專利名稱：單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，可用于對上皮細胞癌變的診斷，包括結(jié)直腸癌、膀胱癌、食道癌、皮膚癌、口腔癌等多種癌癥。
背景技術(shù)：
目前醫(yī)學(xué)病理檢測(pathology)是對癌癥確診的標(biāo)準(zhǔn)方法，其操作流程是將手術(shù)切除的病灶部位新鮮組織以福爾馬林固定并用石蠟包埋，制作成切片經(jīng)染色后，由經(jīng)過多年培訓(xùn)的病理專家在顯微鏡下觀察，根據(jù)經(jīng)驗得出結(jié)論。通常，福爾馬林固定需時3-6小時，切片制作和染色需時24小時，所以在到達病理分析這一階段所費時間已經(jīng)就很長。更進一步的是，對切片觀測所得病理結(jié)論是病理專家基于經(jīng)驗的主觀判斷，存在一定隨意性。對同一切片，不同病理專家可能會得出相反結(jié)論。例如文獻顯示，對同一基底細胞癌病例，單一病理專家得出的結(jié)論與大量同行得出的共同結(jié)論，兩者的吻合幾率僅為65％。因此，如果一種新的檢測方法能夠為醫(yī)生提供迅速和客觀的診斷信息，將大大提高病理診斷的速度和準(zhǔn)確性。
拉曼散射是激發(fā)光波長與待測分子的振動交換能量產(chǎn)生的效應(yīng)，帶有分子的特征指紋，使得拉曼光譜成為標(biāo)識分子、探測分子結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一。在人體組織和細胞的病變過程中，生物大分子(如蛋白質(zhì))的變化將引起其拉曼光譜的改變，使得運用拉曼光譜探測組織病變成為可能。
拉曼散射雖然在上世紀(jì)20年代就已被發(fā)現(xiàn)，但只是在最近10年由于實驗技術(shù)的進步才被廣泛應(yīng)用于對疾病的檢測。其中，首先是激光技術(shù)的發(fā)展解決了拉曼散射激發(fā)光源的問題，其次上世紀(jì)90年代初冷卻CCD技術(shù)的完善使得拉曼信號探測系統(tǒng)實現(xiàn)了小型化，提高了探測靈敏度?，F(xiàn)在，拉曼光譜對癌癥的診斷在臨床研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。
先技術(shù)[1]在利用拉曼光譜技術(shù)診斷基底細胞癌的研究中(Gniadecka M.et al.Journal of Raman Spectroscopy 28，125-129(1997))，使用了近紅外傅立葉變換拉曼光譜技術(shù)檢測最常見的皮膚癌—基底細胞癌(Basal Cell Carcinoma，BCC)的分子變化。他們的具體實驗過程如下樣品包括16個來自經(jīng)組織病理學(xué)確診的基底細胞癌病人的皮膚切片和16個用于對照的正常皮膚切片。所有樣品保存在4℃的潮濕環(huán)境里，不經(jīng)任何預(yù)處理，在樣品收集后的30分鐘內(nèi)進行拉曼光譜測量。拉曼光譜測量在帶有FRA 106拉曼模塊的Bruker IFS 66光學(xué)系統(tǒng)上進行。激發(fā)光源是一個Nd:YAG激光器，波長是1064nm，功率是300mW。樣品放置在一個不銹鋼的杯子里，聚焦到樣品上的激光光斑直徑大約是100μm。對每個樣品須將250次的掃描結(jié)果累加起來，整個光譜記錄時間是10分鐘。測量得到的光譜經(jīng)強度校正后用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析可以區(qū)分正常皮膚和基底細胞癌。
在先技術(shù)[2]中，文獻Haka AS et al.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 102，12371-12376(2005)是該課題組運用拉曼光譜技術(shù)診斷乳腺癌的系列臨床研究的最新結(jié)果。在這一工作中，樣品來源為58例病人在作活組織切片檢查過程中經(jīng)手術(shù)取得的乳腺組織。樣品處理是將乳腺組織切除后立刻在液氮中冷凍儲存，待進行光譜檢測時再將乳腺組織從液氮中取出、置實驗臺上于室溫中自然融化，在組織表面加磷酸鹽緩沖生理鹽水(Phosphate Buffered Saline，PBS)溶液保持濕潤。拉曼探測系統(tǒng)由Ti:Sapphire激光光源、共聚焦顯微系統(tǒng)和CCD光譜儀組成，聚焦后激發(fā)光的光斑直徑約為100μm，但由于組織對光的散射現(xiàn)象，焦點在組織中擴散，所以實際的激發(fā)區(qū)域擴大為約1mm3。使用的激光功率為100mw至150mw，文章聲明在這樣的功率下沒有觀測到組織的輻射損傷。實驗共測得58個病例130條拉曼光譜，在光譜分析中使用了9種物質(zhì)組份的拉曼光譜的線性疊加來對乳腺組織的拉曼光譜進行擬合，得到各組分的濃度系數(shù)。這9種物質(zhì)分別是二水草酸鈣(Calcium Oxalate Dihydrate)、氫氧基磷酸鈣(Calcium Hydroxyapatitte)、β-Carotene、脂肪、膠原蛋白(Collagen)、細胞核、細胞質(zhì)、膽固醇狀脂類沉積物(Cholesterol-like lipid deposits)和水分。在診斷算法部分，文章聲稱僅使用脂肪和膠原蛋白的濃度系數(shù)便可診斷區(qū)分正常組織、纖維囊性變化(fibrocystic change)、纖維腺瘤(fibroadenoma)和浸潤癌(invasive carcinoma)，達到94％靈敏度和96％特定度。然而目前這一工作在學(xué)術(shù)界引起質(zhì)疑，例如，脂肪和膠原蛋白并不是乳腺癌活組織切片病理檢查中的主要檢測目標(biāo)，病理檢測更側(cè)重于從組織形態(tài)、細胞排列、細胞性狀等方面作判斷，因此基于細胞核和細胞質(zhì)濃度系數(shù)的光譜診斷算法應(yīng)是更可信的。
上述已有光譜技術(shù)對癌癥的診斷方法存在如下缺陷(1)樣品的處理過程(如液氮冷凍或4℃環(huán)境下保存)改變了組織的成分和結(jié)構(gòu)；(2)組織樣品喪失了生物活性，其光譜與組織在人體內(nèi)部處于存活狀態(tài)下時有異；(3)均是組織水平的探測，激發(fā)區(qū)域體積均在mm3量級，獲得的拉曼信號是多細胞和細胞間質(zhì)的總和，干擾源較多。由于85％癌癥起源于上皮細胞變異，因此上皮細胞應(yīng)是主要檢測目標(biāo)，而皮下組織中血細胞是強烈拉曼信號源，組織水平的探測技術(shù)很難避免干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前癌癥拉曼光譜診斷中存在的缺點和問題，提供一種單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，它是對手術(shù)切除組織作單細胞處理，并以單細胞拉曼光譜檢測手段實現(xiàn)對上皮細胞的癌癥病理識別。在測量過程中維持上皮細胞處于存活狀態(tài)、所處測量環(huán)境接近人體自然生理環(huán)境，能夠正確反映其尚在人體內(nèi)時的性質(zhì)；利用激光俘獲單個細胞而實現(xiàn)的單細胞水平檢測又將檢測目標(biāo)局限于癌變起始部位(即上皮粘膜)，克服了組織水平檢測所包含的細胞間質(zhì)、血細胞和深層組織細胞等的干擾，是激發(fā)區(qū)域在μm3量級的一種定位測量技術(shù)，具有干擾小、研究對象孤立、可控性好、目標(biāo)選擇性高等優(yōu)點。對細胞癌或非癌的拉曼光譜判斷識別結(jié)論可為醫(yī)生對病人的診斷提供快速、客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明技術(shù)解決方案如下一種單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，包括四個內(nèi)容(1)人體病灶部位單細胞樣品的制備和生物活性維持將病人病灶部位切除組織和病灶附近正常部位少量切除組織作細胞分離后進行原代培養(yǎng)并制備單細胞樣品，獲得反常對照組和正常對照組。
(2)在接近人體生理環(huán)境下對單個活細胞拉曼光譜的測量利用激光俘獲顯微拉曼光譜儀挑選和俘獲樣品培養(yǎng)液中具有生物活性的單個上皮細胞，并利用光勢阱的囚禁作用將細胞轉(zhuǎn)移至顯微鏡視野中一個相對孤立的區(qū)域。后者的目的是為了凈化上皮細胞的測量環(huán)境，防止測量過程中培養(yǎng)液里其它物質(zhì)(如另一個上皮細胞，或紅細胞，或其它組織殘留物)對俘獲細胞的可能粘接。光勢阱的激光能量本身將激發(fā)被俘獲細胞的拉曼光譜，由拉曼光譜儀記錄測量。對正常對照和反常對照各挑選20個細胞進行測量。
(3)區(qū)別癌癥細胞與正常細胞的單細胞拉曼光譜診斷識別模型對細胞性質(zhì)進行識別必須由一個模型實現(xiàn)，而這一模型是通過定標(biāo)過程來建立的。在定標(biāo)時，考慮到不同病人間存在一些個體差異，為保證統(tǒng)計性，需采集足夠確診病例的拉曼光譜，建立定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上，使用主元素分析方法和邏輯回歸算法，建立由光譜參數(shù)構(gòu)成的診斷方程，給出對數(shù)據(jù)庫中癌癥細胞光譜與正常細胞光譜的最佳模式區(qū)分，而其中實現(xiàn)光譜模式識別的閾值條件則稱為診斷條件。
(4)診斷識別模型在臨床診斷中的應(yīng)用程序?qū)ξ创_診病人的手術(shù)切除組織按照步驟(1)制備成單細胞樣品并按步驟(2)測量光譜，將光譜帶入步驟(3)的診斷識別模型，根據(jù)診斷條件來對未知細胞進行癌與非癌的模式歸類，從而實現(xiàn)對細胞的光譜診斷。
本發(fā)明可用于對上皮細胞癌變的診斷，包括結(jié)直腸癌、膀胱癌、食道癌、皮膚癌、口腔癌等多種癌癥。


圖1是本發(fā)明測得的結(jié)直腸上皮細胞的平均光譜<r(v)>。(見方程(3))圖2是本發(fā)明方程(5)用于計算參數(shù)a2所需要的第二主元素光譜P2(v)。
圖3是本發(fā)明方程(5)用于計算參數(shù)a3所需要的第三主元素光譜P3(v)。
圖4是本發(fā)明方程(5)用于計算參數(shù)a4所需要的第四主元素光譜P4(v)。
圖5是本發(fā)明對實施例1拉曼光譜診斷的結(jié)果。由(a2，a3，a4)給出的點集本是三維圖，但平面顯示難以展示點集分布特征，所以圖中將坐標(biāo)空間作了旋轉(zhuǎn)，將a2和a3組合為橫軸，則診斷面投影為一條直線。沿診斷面看去，左上方為p＜0.5區(qū)域，是正常細胞區(qū)域；直線的右下方為p＞0.5區(qū)域，是癌癥細胞區(qū)域。
圖6是本發(fā)明對實施例2拉曼光譜診斷的結(jié)果。
圖7是本發(fā)明對實施例3拉曼光譜診斷的結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明所使用病例都事先得到了病人的知情同意。本發(fā)明的具體技術(shù)細節(jié)按照對結(jié)直腸癌的實施闡述如下
(一)單細胞樣品的制備和生物活性維持本發(fā)明可與醫(yī)院現(xiàn)行常規(guī)醫(yī)學(xué)病理檢測共享樣品來源。通常，結(jié)直腸腫瘤手術(shù)除切除腫瘤組織外，還在病灶部位附近切除少量正常粘膜組織，后者用作醫(yī)學(xué)病理檢測中的正常對照。
本發(fā)明樣品處理步驟如下在結(jié)直腸腫瘤患者手術(shù)后，無菌條件下立即從手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織和正常粘膜組織中各切取約0.5cm3，后者取自距腫瘤10cm以上部位的粘膜。將所取組織置于含青霉素300U/ml、鏈霉素300μg/ml的D-Hanks平衡鹽溶液中20分鐘，然后將之剪成小于1mm3的碎塊放入預(yù)熱至37℃的0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液中，由胰蛋白酶對組織碎片作用消化30分鐘，其間操作員不時用吸管在溶液中以反復(fù)吸擠溶液的機械方式來產(chǎn)生液流沖擊吹打組織。消化之后取上清液離心(800轉(zhuǎn)/分)，將沉淀用D-Hanks平衡鹽溶液洗滌一遍，然后以8ml含10％小牛血清和青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮沉淀，制成單細胞懸液。所用試劑均購自Invitrogen公司。單細胞樣品制備可在1小時內(nèi)完成。
(二)在接近人體生理環(huán)境下對單個活細胞拉曼光譜的測量光譜測量由我們仿制的激光俘獲顯微拉曼光譜儀(Xie CG，Dinno MA，Li YQ，Optics Letters 27，249-251(2002))實現(xiàn)。該光譜儀使用恒溫恒電流控制下的半導(dǎo)體激光作為光源，中心波長為782nm，光路中使用了780-790nm的窄帶濾波器來提高光源的單色性能。該光源同時用作激光光鑷控制光源和拉曼光譜激發(fā)光源，由光路系統(tǒng)輸入尼康EclipseTE2000-U微分干涉相襯(DIC)顯微鏡，經(jīng)雙色鏡和100X油浸物鏡共軸聚焦于樣品溶液中，在焦點附近形成激光光鑷(即光勢阱)，俘獲待測細胞并激發(fā)拉曼散射，光鑷處激光功率約為11.5mw。而油浸物鏡同時又用作收集物鏡，收集散射信號沿軸向反向輸出顯微鏡，經(jīng)Super-NotchFilter(Kaiser，Inc.)濾去激發(fā)波長信號，剩余的拉曼信號再經(jīng)過光路系統(tǒng)輸入光柵光譜儀(Acton SpectraPro 2300i)和CCD(RoperScientific SPEC-10100BR/LN)進行光譜測量。與光譜測量系統(tǒng)相互獨立，顯微鏡的成像系統(tǒng)為物鏡視場中激光光鑷對細胞的挑選、俘獲和操控提供了實時觀測功能。
實驗過程中，將上述(一)中制備的單細胞培養(yǎng)液移入顯微鏡載物臺上的樣品池中。在顯微鏡成像系統(tǒng)的視場內(nèi)，可以觀測到溶液內(nèi)通常懸浮幾類細胞單一上皮細胞、未分離的上皮細胞團、紅細胞和少量細菌。在測量過程中挑選圓潤的、微轉(zhuǎn)動的、體型大的、有相襯度的單一上皮細胞作探測對象，這幾個要求保證了所選細胞處于存活狀態(tài)，具有生物活性，而其中最后一個要求使用了DIC顯微鏡的相襯功能來排除非常透明的細胞。
信號探測分為三步第一，將待測細胞在光鑷焦點處囚禁并抬升至溶液中同一高度(高于焦點20μm)；第二，以11.5mw激發(fā)功率和60s積分時間采集細胞的拉曼光譜s(v)，v為波數(shù)；第三，將細胞從光鑷處釋放，再以相同激發(fā)功率和積分時間采集背景光譜B(v)。最終細胞實際的拉曼光譜R(v)可以表達為R(v)＝[S(v)-B(v)]/Q(v)(1)其中Q(v)為拉曼系統(tǒng)響應(yīng)曲線。
(三)區(qū)別癌癥細胞與正常細胞的單細胞拉曼光譜診斷識別模型診斷識別模型是本發(fā)明的核心之一，它的建立過程稱為定標(biāo)。下面闡述定標(biāo)過程的技術(shù)細節(jié)。
本發(fā)明的定標(biāo)使用了確診為癌癥的病例的拉曼光譜來確立光譜分析所需的基矢光譜和診斷參數(shù)方程。這里“確診病例”定義為通過對新鮮組織作切片進行組織病理分析，由兩名或兩名以上富有經(jīng)驗的病理分析專家相互獨立工作得到共同結(jié)論的病例，而得到不同結(jié)論的病例則被摒棄。通常定標(biāo)過程中所使用的光譜數(shù)量越多，診斷識別模型統(tǒng)計性越好，判斷越準(zhǔn)確。本發(fā)明使用了8個確診為癌癥的病例，每個病例從反常對照中挑選20個癌癥細胞，從正常對照中挑選20個正常細胞(兩類拉曼光譜總共各160個)，組成了定標(biāo)光譜集。
本發(fā)明光譜診斷識別模型的建立采用主元素分析法(PrincipalComponent Analysis)和邏輯回歸(Logistic regression)分析法。兩者都是數(shù)據(jù)挖掘理論(Data Mining)中的標(biāo)準(zhǔn)方法。
建立診斷模型的第一步是對光譜的歸一化。因為光譜中的診斷信息主要是包含在譜線形狀即各譜峰的相對強度上，而譜線的絕對強度與激發(fā)能量成正比，受激光功率漲落影響。光譜歸一方法有幾種選擇，例如將譜線按積分歸一，但更常用的是將譜線作矢量歸一，因為這有利于主元素分析的幾何解釋。具體操作是r(v‾)=R(v‾)/Σi=1NR2(v‾i)---(2)]]>這里，由于測得的光譜R(v)實際上是CCD各像素點的光子計數(shù)，由一系列分離值組成，而波數(shù)v也是由像素點換算得到的分離值(N為波數(shù)總數(shù)目)，因此方程(2)將光譜映射到N維空間中單位球面上的一個點。
這里給出主元素分析在我們光譜分析中的幾何解釋。任何一條由離散值(如CCD像素點的光子計數(shù))代表的光譜均可一一映射到高維空間中的一個點，空間維數(shù)為離散值總數(shù)，坐標(biāo)取每一像素的數(shù)值。然而這些維度之間是相關(guān)的。例如，設(shè)想待測樣品中含有一種化學(xué)組分，其在v300、v560和v720處有拉曼峰，相對強度分別為α、β和γ，那么在高維空間中的第300、560和720維就存在關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)為當(dāng)這種組分含量改變時，光譜對應(yīng)的高維空間點沿著直線αx^300+βx^560+γx^720]]>移動，其中 和 分別是這三個維度坐標(biāo)的單位向量。很明顯，點集在這三個維度的變化實際上是一維變化而不是三維變化，適當(dāng)選擇坐標(biāo)變換便可只用一個變量描述。主元素分析就是對歸一后的定標(biāo)光譜集在N維空間單位球面上的點分布做維度降階的方法。
建立模型的第二步是計算構(gòu)成定標(biāo)集的320條歸一光譜的平均光譜，即⟨r(v‾)⟩=1320Σm=1320rm(v‾)---(3)]]>為闡述清晰，我們用下標(biāo)m標(biāo)記不同的光譜，而用下標(biāo)i和j標(biāo)記波數(shù)。
建立模型的第三步是使用主元素分析的標(biāo)準(zhǔn)算法，確立描述定標(biāo)光譜主要變化特征的主元素光譜(Principal Components)。首先，計算定標(biāo)光譜歸一后(方程(2))各波數(shù)間的協(xié)方差矩陣，即σij=Σm=13201320-1[rm(v‾i)-⟨r(v‾i)⟩]·[rm(v‾j)-⟨r(v‾j)⟩],]]>1≤i，j≤N.(4)其次，計算矩陣σij的本征值和本征矢量。在將本征值從大到小排序后，即λ1≥λ2≥...≥λN，與本征值{λ1，λ2，...，λN}相對應(yīng)的本征矢量便組成了主元素光譜{P1(v)，P2(v)，...，PN(v)}?？梢宰⒁獾?，本征值和本征矢量的個數(shù)均與波數(shù)總數(shù)N相等，但實際上只有排在前列的少數(shù)幾個本征值才有高于信號噪音的數(shù)值，后面的均弱于信號噪音而可忽略。
由于{Pn(v)，1≤n≤N}的正交歸一性，可實現(xiàn)對定標(biāo)光譜按主元素光譜的線性分解，即an=Σi=1N[r(v-i)-⟨r(v‾i)⟩]·Pn(v‾i),1≤n≤N;r(v‾)=⟨r(v‾)⟩+Σn=1NanPn(v-).---(5)]]>其中r(v)是歸一后的定標(biāo)光譜，an是展開系數(shù)(score)。這里特別需要指出的是，主元素分析過程中對本征值的排序使得Pn(v)在光譜分析中的重要性隨下標(biāo)n增加而降低，而定標(biāo)光譜集中光譜的主要變化特征可以用{a1，a2，...aN}序列中排在前列的幾個參數(shù)描述。主元素光譜的另一特性是{Pn(v)}組成了正交歸一的基矢集，由此張成了一個空間，稱作主元素空間，可由前述N維空間經(jīng)坐標(biāo)變換得到，實際上主元素分析便是變換的具體操作過程。經(jīng)方程(5)每一光譜被映射到主元素空間中的一個點。另一個值得注意的事實是從光譜測量直到這里，我們對癌癥細胞和正常細胞都是等價處理的。
但是癌癥細胞光譜對應(yīng)的點集與正常細胞光譜對應(yīng)的點集在空間分布上是不同的，分別處于可隔離的區(qū)域。尋找這兩類點集分布的分界面便是建立診斷模型的第四步一使用模式識別算法從{an}中建立區(qū)分癌癥細胞與正常細胞的參數(shù)方程。在這里，我們才引入兩類細胞的差異。邏輯回歸法(logistic regression)是對二元模式識別的標(biāo)準(zhǔn)算法，具體操作是計算似然估計函數(shù)的極大值。這一算法的輸入量是1.兩類細胞的模式設(shè)置，有且僅有兩個值0或1。第m個細胞的模式取值為(均是已知量，建立定標(biāo)數(shù)據(jù)庫時己知) 2.從{an，1≤n≤N}中挑選處于系列前列的幾個主要展開系數(shù)。這里需要注意的是，入選系數(shù)的數(shù)目增多通常會減弱模型的預(yù)言能力，通常數(shù)目應(yīng)不超過3。
經(jīng)過反復(fù)調(diào)試，本發(fā)明確認對結(jié)直腸癌，組合{a2，a3，a4}能夠給出最佳結(jié)果。應(yīng)用這三個參數(shù)，定標(biāo)光譜集的邏輯回歸似然估計函數(shù)為Πm=1320exp[ym(β0+β1a2(m)+β2a3(m)+β3a4(m))]1+exp[β0+β1a2(m)+β2a3(m)+β3a4(m)],---(7)]]>其中，β0，1，2，3是未知參數(shù)，我們在展開系數(shù)a2，3，4上增加上標(biāo)(m)以標(biāo)記細胞。β的取值應(yīng)使定標(biāo)光譜集的似然估計函數(shù)達到最大值，因此通過求解方程(7)的最值點來得到β值。數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)，β0＝0.07868，β1＝24.38，β2＝-22.35，β3＝-24.47.(8)根據(jù)邏輯回歸算法，對細胞癌性的預(yù)言幾率(predicted probability)表示為
p=exp[β0+β1a2+β2a3+β3a4]1+exp[β0+β1a2+β2a3+β3a4],---(9)]]>代入β數(shù)值后整理為參數(shù)方程1n(p1-p)=0.07868+24.38a2-22.35a3-24.47a4,---(10)]]>這是本發(fā)明確定的將兩類結(jié)直腸粘膜上皮細胞區(qū)分診斷的最佳方程當(dāng)p＝0時，細胞以0％幾率為癌癥，即以100％幾率為正常，方程(10)左端為-∞；當(dāng)p＝1時，細胞以100％幾率為癌癥，方程(10)左端為+∞。當(dāng)p＝0.5時，細胞以同等幾率為正常和癌癥，方程(10)左端為0，這時該方程實際上定義了a2-a3-a4空間中的一個平面，該平面將癌癥細胞點集分布與正常細胞點集分布有效分隔開來，稱為診斷面，這等價于設(shè)定一個診斷條件取閾值0.5，當(dāng)p＜0.5時判定細胞為正常，而當(dāng)p＞0.5時判定細胞為癌癥。
使用上述標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明對定標(biāo)光譜集中的細胞識別達到了77.5％的敏感度(即識別了160個癌癥細胞中的124個)和81.3％的特定度(即識別了160個正常細胞中的130個)。
(四)診斷識別模型在臨床診斷中的應(yīng)用程序識別模型臨床應(yīng)用步驟如下1.對未經(jīng)診斷病人的手術(shù)切除組織按照步驟(一)培養(yǎng)單細胞樣品；2.按照步驟(二)測量單細胞樣品中活的上皮細胞的拉曼光譜；對正常對照組和反常對照組分別測量不低于20個細胞的拉曼光譜；3.對每一細胞，按照方程(2)對光譜作歸一；4.對每一細胞，利用定標(biāo)過程中確定的、已知的＜r(v)＞和{Pi(v)}按照方程(5)算得a2、a3和a4數(shù)值；5.對每一細胞，將a2、a3和a4數(shù)值代入方程(10)，算得p值。如果p＜0.5即為正常，p＞0.5即為癌癥。
6.20個正常細胞的p值分布和20個反常細胞的p值分布既是本發(fā)明的測量結(jié)果，可為醫(yī)生診斷提供判斷依據(jù)。
本發(fā)明的所有數(shù)據(jù)和數(shù)值模型均由實際測量給出，對細胞的診斷結(jié)論由光譜客觀給出，不依賴于觀測者的主觀判斷。單細胞樣品制備可在1小時內(nèi)完成，光譜測量時間可控制在2至4小時，對光譜的識別模型計算可在1秒內(nèi)得到結(jié)果。因此在結(jié)直腸癌的快速臨床診斷方面有廣闊應(yīng)用前景。
實施例1朱X X，男，52歲，病理診斷為乙狀結(jié)腸潰瘍型腺癌，高至中度分化，采用本發(fā)明方法進行雙盲檢測。醫(yī)生提供了病灶部位和非病灶部位單細胞樣品，光譜檢測正確識別了20個正常細胞中的17個，20個癌癥細胞中的17個，結(jié)果顯示該病人確已患有癌癥。圖5為實施例1診斷結(jié)果。
實施例2沈X X，男，64歲，病理診斷為直腸浸潤潰瘍型腺癌，高分化，采用本發(fā)明方法進行雙盲檢測。醫(yī)生提供了病灶部位和非病灶部位單細胞樣品，光譜檢測正確識別了全部20個正常細胞，20個癌癥細胞中的16個，結(jié)果顯示該病人確已患有癌癥。圖6為實施例2診斷結(jié)果。
實施例3張XX，女，64歲，采用本發(fā)明方法進行雙盲檢測。醫(yī)生提供了病灶部位和非病灶部位單細胞樣品，光譜檢測判別20個非病灶細胞中10個為正常，20個病灶部位細胞中的11個為癌癥，判斷該病人處于正常與癌癥之間。經(jīng)病理診斷，其結(jié)論是直腸絨毛-管狀腺瘤，伴輕中度不典型增生。圖7為實施例3診斷結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于該方法由四個步驟組成(1)人體病灶部位單細胞樣品的制備和生物活性維持；(2)在維持接近人體生理環(huán)境下對具有生物活性的上皮細胞進行的單細胞激光俘獲拉曼光譜測量；(3)判斷細胞為癌癥或正常的單細胞拉曼光譜診斷識別模型；(4)細胞診斷識別模型在臨床診斷中的應(yīng)用程序。
2.如權(quán)利要求1所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于對病人手術(shù)切取的組織進行無菌條件下的細胞離化處理，得到處于生理存活狀態(tài)下的單細胞生理溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于在單細胞生理溶液中添加抗生素抑制細菌生長。
4.如權(quán)利要求2所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于在單細胞生理溶液中添加細胞培養(yǎng)液維持細胞的生物活性狀態(tài)。
5.如權(quán)利要求1所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于將上皮細胞懸液注入近紅外激光俘獲顯微拉曼探測系統(tǒng)的樣品池，在細胞培養(yǎng)液的液態(tài)環(huán)境中進行上皮細胞的拉曼光譜測量。
6.如權(quán)利要求5所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于使用激光光鑷技術(shù)對單個活上皮細胞實現(xiàn)俘獲和孤立，簡化光譜測量環(huán)境。
7.如權(quán)利要求6所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于得到俘獲狀態(tài)下單個上皮細胞的拉曼光譜，重點檢測500-1900cm-1。
8.如權(quán)利要求1所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于對拉曼光譜進行強度歸一以去除激發(fā)光功率漲落的影響；
9.如權(quán)利要求1所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于鑒別上皮細胞為癌或正常的拉曼光譜識別模型由確診病例組成的定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫建立。
10.如權(quán)利要求2或9所述的在單細胞水平進行癌癥診斷的拉曼光譜方法，其特征在于組成定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫的每一病例為手術(shù)切取的癌癥確診病人的惡性腫瘤組織和距腫瘤10cm以上部位的正常上皮組織。
11.如權(quán)利要求9所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫包含5個以上病例，且每個病例包含20個正常細胞和20個癌癥細胞的拉曼光譜，以獲得充足的統(tǒng)計性。
12.如權(quán)利要求9所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于鑒別上皮細胞為癌或正常的拉曼光譜識別模型包括a)定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫中所有上皮細胞的平均光譜；b)定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫經(jīng)主元素分析確定的主元素光譜基矢集和定標(biāo)光譜在此基矢集上的展開系數(shù)；c)對定標(biāo)光譜展開系數(shù)經(jīng)邏輯回歸分析確立的判斷細胞為正常或癌癥的的診斷方程該方程以光譜的主要展開系數(shù)為變量，功能是計算細胞為癌癥的語言幾率p，幾率閾值條件設(shè)定為p＜0.5則細胞為正常細胞，p＞0.5則細胞為癌細胞。
13.如權(quán)利要求1所述的單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，其特征在于對未診斷病人的實施程序為a)對病灶的切除組織作單細胞處理；b)測量單細胞拉曼光譜；c)對單細胞拉曼光譜作強度歸一；d)計算光譜在診斷方程中所使用的展開系數(shù)系列；e)將展開系數(shù)代入權(quán)利要求12所述診斷方程，得到p值，由閾值條件確定是否為癌癥細胞。
全文摘要
一種單細胞拉曼光譜判別上皮細胞癌癥性質(zhì)的方法，對手術(shù)切除組織的單細胞拉曼光譜檢測方法，以光譜手段實現(xiàn)對癌癥的醫(yī)學(xué)病理檢測的功能。本發(fā)明包括人體病灶部位單細胞樣品的制備和生物活性維持；在接近人體生理環(huán)境下對單個活細胞拉曼光譜的測量；判斷細胞為癌癥或正常的單細胞拉曼光譜診斷識別模型；單細胞拉曼光譜診斷識別模型的臨床應(yīng)用程序。本發(fā)明具有檢測迅速和判斷客觀的優(yōu)點，并且實施對象(即上皮細胞)在測量過程中處于存活狀態(tài)、所處測量環(huán)境接近人體自然生理環(huán)境，能夠正確反映其尚在人體內(nèi)時的性質(zhì)，并將檢測目標(biāo)局限于癌變起始部位(即上皮粘膜)。本發(fā)明可為醫(yī)生判斷上皮細胞癌變提供診斷依據(jù)，可用于多種癌癥。
文檔編號C12Q1/02GK1804593SQ20061002341
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日
發(fā)明者陳昆, 覃業(yè)軍, 魏青, 孫孟紅, 鄧見遼, 周曉燕 申請人:中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機械研究所