本發(fā)明屬于細(xì)胞工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的方法，也包括該方法中所用到的特定小分子化合物組合及該內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞進(jìn)一步向?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞技術(shù)多次被《自然》、《科學(xué)》等雜志評(píng)為二十一世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域最具發(fā)展前景的技術(shù)，是攻克各種傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療手段力所不及的重大疾病的一種全新的醫(yī)療技術(shù)。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，在器官組織再生、疾病模型建立、發(fā)育生物學(xué)及藥物研發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。近10年來，干細(xì)胞理論與技術(shù)研究取得了飛速的發(fā)展，有望成為全新的疾病治療方式，推動(dòng)醫(yī)學(xué)治療的范式轉(zhuǎn)換，引領(lǐng)新的醫(yī)學(xué)革命。干細(xì)胞有多種不同的分類方法，從發(fā)育的角度來看，干細(xì)胞大致分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells)(escs)和成體干細(xì)胞(adultstemcells)兩大類。escs來源于囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass)(icm)，是一類具有無限自我更新和向人體所有細(xì)胞類型進(jìn)行分化的多能性干細(xì)胞。1998年，thomson在世界上首次建立了人胚胎干細(xì)胞系(hescs)[thomsonja,itskovitz-eldorj,shapiross,waknitzma,swiergieljj,marshallvs,etal.embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.science.1998；282:1145-7.]，由于其能夠產(chǎn)生成體所有細(xì)胞類型，理論上能為基礎(chǔ)研究、疾病治療和藥物研發(fā)提供理想的細(xì)胞來源。多年來利用escs已經(jīng)產(chǎn)生了多種功能性細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞和肝臟細(xì)胞等[murryce,kellerg.differentiationofembryonicstemcellsto&#xa0；clinicallyrelevantpopulations:lessonsfromembryonicdevelopment.cell.132:661-80.]。然而，escs的使用在國際上面臨著倫理學(xué)的爭議，而且escs來源的細(xì)胞移植后會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，未分化的escs會(huì)形成畸胎瘤等諸多問題，因此大大限制了其走向臨床的應(yīng)用。而成體干細(xì)胞存在于出生后各個(gè)階段的多種組織中，具有一定的自我更新能力并且能夠向其來源組織中的成熟細(xì)胞進(jìn)行分化，如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等。由于其來源于成體組織且只能向固定的方向分化，因此不具有成畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，也沒有倫理學(xué)的問題，所以是臨床疾病治療的良好種子細(xì)胞。但其來源畢竟有限，只能從人體組織中分離獲得，而且分化潛能也很局限只能生成其所在譜系內(nèi)的一種或幾種成熟細(xì)胞類型，體外也很難大規(guī)模的擴(kuò)增，所以其臨床應(yīng)用也有很大的局限性。多年來，眾多的研究都在致力于尋求更為理想的細(xì)胞類型來進(jìn)行疾病的治療、藥物研發(fā)和機(jī)制研究。傳統(tǒng)的表觀遺傳學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為譜系的特化、細(xì)胞的分化是單向的、不可逆的過程，多能的細(xì)胞狀態(tài)只能向終末成熟的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行命運(yùn)特化(waddington’epigeneticlandscape)。而誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells)簡稱ipscs的出現(xiàn)深刻的改變了這一觀念。2006年日本科學(xué)家yamanaka利用escs特異性的4個(gè)多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子oct4、sox2、klf4、c-myc(oskm)成功的將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為類似escs的多能性干細(xì)胞ipscs，首次證實(shí)了終末分化的細(xì)胞在多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用下可以重新獲得分化多能性，這就是經(jīng)典的重編程技術(shù)[takahashik,yamanakas.inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.cell.126:663-76.takahashik,tanabek,ohnukim,naritam,ichisakat,tomodak,etal.inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.cell.131:861-72.]。ipscs的出現(xiàn)具有里程碑式的意義：首先，它突破了經(jīng)典的表觀遺傳全景模式，極大的豐富了細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換的理論，引領(lǐng)了細(xì)胞命運(yùn)研究和干細(xì)胞研究的范式轉(zhuǎn)換，給再生醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用開辟了廣闊前景。其次，ipscs具有escs的無限自我更新和向體內(nèi)所有細(xì)胞類型進(jìn)行分化的潛能，同時(shí)避免了escs研究和應(yīng)用的倫理學(xué)爭議。再次，由于成纖維細(xì)胞可取自病人自體因此也避免了escs分化產(chǎn)生的終末細(xì)胞移植入體內(nèi)帶來的免疫排斥問題。最后，病人自體來源的ipscs可以建立個(gè)體特異性的疾病細(xì)胞模型和個(gè)體化的藥物篩選平臺(tái)。ipscs的出現(xiàn)不僅給疾病的基礎(chǔ)研究，藥物篩選帶來新的研究模式，而且使多能性干細(xì)胞(pscs)走向臨床應(yīng)用跨進(jìn)一大步。利用ipscs已經(jīng)成功的產(chǎn)生了多種功能性細(xì)胞類型，而且ipscs來源的視網(wǎng)膜色素上皮治療致盲性眼病的臨床試驗(yàn)正在開展。yamanaka也因此項(xiàng)技術(shù)而獲得2012年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。盡管ipscs具備多方面的優(yōu)勢(shì)，是一種非常具有治療前景的細(xì)胞類型，然而由于同樣具有escs類似的多能性依然難以避免致畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)，此外ipscs向功能性細(xì)胞進(jìn)行分化的過程中存在隨機(jī)性分化的問題，會(huì)產(chǎn)生多種非預(yù)期細(xì)胞類型，這些問題都會(huì)對(duì)大規(guī)模的臨床應(yīng)用帶來安全性的風(fēng)險(xiǎn)。為了彌補(bǔ)這一缺陷，近年來基于ipscs技術(shù)和原理發(fā)展而來的譜系重編程(lineagereprogramming)技術(shù)日益受到廣泛的重視。譜系重編程主要使用目的細(xì)胞譜系特異性的轉(zhuǎn)錄因子(lineagespecifictranscriptionalfactors)而非多能性的轉(zhuǎn)錄因子(oskm)在起始細(xì)胞主要是皮膚成纖維細(xì)胞或血細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)，進(jìn)而將起始細(xì)胞直接轉(zhuǎn)換為目的細(xì)胞。譜系重編程的出現(xiàn)同樣是干細(xì)胞領(lǐng)域具有里程碑意義的重要事件。首先，由于不經(jīng)過ipscs的多能性階段，譜系重編程避免了ipscs的致畸胎瘤風(fēng)險(xiǎn)；其次，譜系重編程可以根據(jù)使用的轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)條件的不同直接獲得終末成熟的功能細(xì)胞或者具有擴(kuò)增能力的成體干細(xì)胞，而且得到的目的細(xì)胞類型相對(duì)均一；再次，譜系重編程也具有ipscs的無免疫排斥及個(gè)體化的優(yōu)勢(shì)，因此在干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究和疾病治療上顯示出了更為廣闊的應(yīng)用前景[sancho-martinezi,baeksh,izpisuabelmontejc.lineageconversionmethodologiesmeetthereprogrammingtoolbox.natcellbiol.2012；14:892-9.]。最后，譜系重編程的出現(xiàn)極大的豐富了細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換和重編程理論的內(nèi)涵，使人們對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)特化和調(diào)控的理解更為全面和深刻，并將這一概念應(yīng)用到更為廣闊的領(lǐng)域。從2008年首次實(shí)現(xiàn)在同一胚層內(nèi)的胰腺外分泌細(xì)胞向內(nèi)分泌β細(xì)胞的譜系重編程[zhouq,brownj,kanareka,rajagopalj,meltonda.invivoreprogrammingofadultpancreaticexocrinecellstobeta-cells.nature.2008；455:627-32.]到2010年開始實(shí)現(xiàn)跨胚層的成纖維細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換[vierbuchent,ostermeiera,pangzp,kokubuy,sudhoftc,wernigm.directconversionoffibroblaststofunctionalneuronsbydefinedfactors.nature.2010；463:1035-41.]，譜系重編程領(lǐng)域取得了一個(gè)又一個(gè)的巨大突破。目前使用病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子在體細(xì)胞中過表達(dá)的方式，已在三個(gè)胚層的的多種細(xì)胞類型中成功的實(shí)現(xiàn)了命運(yùn)轉(zhuǎn)換。在外胚層中已經(jīng)將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為多種類型的神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞等；在中胚層已經(jīng)獲得了心肌細(xì)胞、心肌祖細(xì)胞、造血干/祖細(xì)胞等；在內(nèi)胚層獲取了胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝干細(xì)胞等。在這一領(lǐng)域尤其是肝系細(xì)胞的譜系重編程領(lǐng)域，中國科學(xué)家取得了一系列突破。2011年國內(nèi)恵利建實(shí)驗(yàn)室在國際上首次使用肝細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子組合成功的將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為肝細(xì)胞[huangp,hez,jis,sunh,xiangd,liuc,etal.inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.nature.2011；475:386-9.]。2013年胡以平實(shí)驗(yàn)室使用轉(zhuǎn)錄因子組合又獲得了具有自我更新和向肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞進(jìn)行分化的小鼠肝干細(xì)胞[yub,hezy,youp,hanqw,xiangd,chenf,etal.reprogrammingfibroblastsintobipotentialhepaticstemcellsbydefinedfactors.cellstemcell.2013；13:328-40.]。2015年惠利建和鄧宏魁實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立的使用不同的轉(zhuǎn)錄因子組合成功的將人的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成功能性肝細(xì)胞，為肝病治療、藥物篩選提供了良好的種子來源[duy,wangj,jiaj,songn,xiangc,xuj,etal.humanhepatocyteswithdrugmetabolicfunctioninducedfromfibroblastsbylineagereprogramming.cellstemcell.2014；14:394-403.huangp,zhangl,gaoy,hez,yaod,wuz,etal.directreprogrammingofhumanfibroblaststofunctionalandexpandablehepatocytes.cellstemcell.2014；14:370-84.]。盡管這些年來利用譜系重編程已獲取了人或鼠的多種細(xì)胞類型，而且已經(jīng)彌補(bǔ)了ipscs應(yīng)用上的多個(gè)缺陷，然而目前絕大多數(shù)譜系重編程的研究都是依賴于慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)的方式，這些病毒載體進(jìn)入目的細(xì)胞后存在與宿主基因組整合，由此可能導(dǎo)致宿主基因組不穩(wěn)定，為將來的臨床應(yīng)用帶來安全性隱患，此外轉(zhuǎn)錄因子的操作過程復(fù)雜、效率較低下，不同實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程不一，難以大規(guī)模的擴(kuò)展應(yīng)用。因此諸多的研究目前致力于尋找更為安全的、高效的方式來替代轉(zhuǎn)錄因子。與轉(zhuǎn)錄因子相比，小分子化合物具有明顯的多方面的優(yōu)勢(shì)，小分子化合物可以自由通透細(xì)胞、易于合成、經(jīng)濟(jì)高效、無免疫源性、作用于蛋白水平不與基因組整合、可以標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)。通過改變小分子的濃度和作用時(shí)間較容易實(shí)現(xiàn)蛋白調(diào)控的強(qiáng)度和時(shí)空控制。近年來眾多的研究都在致力于篩選小分子用于提高ipscs的生成效率，縮短ipscs的生成時(shí)間，減少轉(zhuǎn)錄因子的使用，最終目的都是為了完全使用小分子來替代經(jīng)典的yamanaka四因子，從而避免病毒在宿主細(xì)胞中整合[liw,lik,weiw,dings.chemicalapproachestostemcellbiologyandtherapeutics.cellstemcell.2013；13:270-83.]。2013年國內(nèi)鄧宏魁實(shí)驗(yàn)室，在這方面取得了突破性的進(jìn)展，其團(tuán)隊(duì)通過多次的篩選，找到了合適的小分子化合物組合能夠在不依賴任何外源轉(zhuǎn)錄因子的情況下實(shí)現(xiàn)小鼠成纖維細(xì)胞向ipscs的重編程，盡管效率只有0.2％并且過程復(fù)雜，但這項(xiàng)突破為基于小分子的重編程和譜系重編程帶來了理論及現(xiàn)實(shí)的依據(jù)[houp,liy,zhangx,liuc,guanj,lih,etal.pluripotentstemcellsinducedfrommousesomaticcellsbysmall-moleculecompounds.science.2013；341:651-4.]。在研究小分子化合物介導(dǎo)ipscs產(chǎn)生的同時(shí)，篩選合適的小分子用于調(diào)控譜系重編程甚至完全替代譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子，從而產(chǎn)生安全高效可控的目的細(xì)胞的研究也在國內(nèi)外如火如荼的開展[lik,zhus,russha,xus,xut,zhangy,etal.smallmoleculesfacilitatethereprogrammingofmousefibroblastsintopancreaticlineages.cellstemcell.2014；14:228-36.zhus,rezvanim,harbellj,mattisan,wolfear,benetlz,etal.mouseliverrepopulationwithhepatocytesgeneratedfromhumanfibroblasts.nature.2014；508:93-7.zhus,russha,wangx,zhangm,mat,xut,etal.humanpancreaticbeta-likecellsconvertedfromfibroblasts.natcommun.2016；7:10080.]。在這一領(lǐng)域，中國科學(xué)家同樣取得了令人矚目的成就，裴剛實(shí)驗(yàn)室近期篩選到合適的小分子組合將阿爾茨海默病病人來源的成纖維細(xì)胞重編程為成熟的功能性神經(jīng)元[huw,qiub,guanw,wangq,wangm,liw,etal.directconversionofnormalandalzheimer'sdiseasehumanfibroblastsintoneuronalcellsbysmallmolecules.cellstemcell.2015；17:204-12.]，而鄧宏魁實(shí)驗(yàn)室則成功的使用小分子組合將小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換為神經(jīng)元[lix,zuox,jingj,may,wangj,liud,etal.small-molecule-drivendirectreprogrammingofmousefibroblastsintofunctionalneurons.cellstemcell.2015；17:195-203.]，leizhang等完全使用小分子將人星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系重編程為功能性神經(jīng)元[zhangl,yinjc,yehh,manx,leeg,chenxa,etal.smallmoleculesefficientlyreprogramhumanastroglialcellsintofunctionalneurons.cellstemcell.2015；17:735-47.]。這些突破性的進(jìn)展為完全使用小分子將成體細(xì)胞轉(zhuǎn)換為其他類型的功能性細(xì)胞或干細(xì)胞奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，也帶來巨大希望?！扼w細(xì)胞重編程技術(shù)在肝臟再生中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究》[張文成，2012年博士論文]討論了利用小分子化合物譜系重編程消化道細(xì)胞獲得誘導(dǎo)內(nèi)胚層多能干細(xì)胞(iemsc)，實(shí)驗(yàn)中使用sb431542、vpa、y27632小分子化合物以及成分未公開的1#-6#小分子組合進(jìn)行了誘導(dǎo)重編程效率的比較。內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞是肝臟、胰腺、胃、腸等內(nèi)臟器官發(fā)育的源泉，獲得內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞，并進(jìn)行大量的擴(kuò)增，然后再對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，獲得大量的功能性肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞將對(duì)多種類型的內(nèi)胚層器官疾病的治療具有巨大的意義。眾所周知，我國是肝病大國，目前有9700萬的乙肝病毒攜帶者，1000萬的丙肝病毒攜帶者，近年來酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝病在我國的發(fā)展趨勢(shì)也明顯升高，其它包括藥物性肝損傷、免疫性肝病等都嚴(yán)重影響我國的國民身體健康[wangfs,fanjg,zhangz,gaob,wanghy.theglobalburdenofliverdisease:themajorimpactofchina.hepatology.2014；60:2099-108.]。各種肝病如果缺乏及時(shí)有效的治療都將逐漸進(jìn)展到以肝硬化，肝衰竭和肝癌為代表的終末期肝病(esld)的階段。我國龐大的肝病基礎(chǔ)人群造成了每年數(shù)十萬人罹患esld。而對(duì)于esld而言，目前的治療手段非常有限，人工肝的治療還未成熟難以大規(guī)模開展，內(nèi)科治療只能采取保守姑息的方式，對(duì)于esld目前公認(rèn)的最有效的治療方式是原位肝移植，但又嚴(yán)重受限于肝源的匱乏。據(jù)估計(jì)我國每年死于esld的人群超過30萬例，給萬千家庭帶來巨大痛苦，給社會(huì)帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。而功能性肝細(xì)胞移植被認(rèn)為是肝移植的良好替代治療方式，但同樣也受限于來源的匱乏。此外，無論是我國還是世界上其他國家，都擁有龐大的糖尿病人群，而且還呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。國際糖尿病聯(lián)盟(internationaldiabetesfederation)的分析顯示在不遠(yuǎn)的將來糖尿病將影響世界上超過30億的人口。然而目前糖尿病的治療方法同樣有限而且效果不一，尤其是ⅰ型糖尿病(t1dm)只能通過終生注射外源性的胰島素進(jìn)行治療，長期注射胰島素費(fèi)用昂貴，還會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗，降低治療效果以及帶來感染、低血糖、過敏反應(yīng)等一系列慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。而t1dm被認(rèn)為可通過外源性移植胰島β細(xì)胞來治愈并且目前的研究已取得令人矚目的進(jìn)展[bellinmd,bartonfb,heitmana,alejandror,heringbj.potentinductionimmunotherapypromoteslong-terminsulinindependenceafterislettransplantationintype1diabetes.americanjournaloftransplantation.2012；12:1576-83.]，但外源性胰島或β細(xì)胞的缺乏嚴(yán)重阻礙了這種治療方式的應(yīng)用。如果能夠獲得內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞，并進(jìn)行大量的擴(kuò)增然后再對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化進(jìn)而獲得大量的功能性肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞將會(huì)對(duì)肝病的細(xì)胞治療，糖尿病的細(xì)胞治療甚至腸道疾病的治療帶來巨大的希望。多項(xiàng)研究已經(jīng)報(bào)道從多能性干細(xì)胞escs或ipscs來獲得內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞并將其向肝臟和胰腺進(jìn)行誘導(dǎo)分化[sneddonjb,borowiakm,meltonda.self-renewalofembryonic-stem-cell-derivedprogenitorsbyorgan-matchedmesenchyme.nature.2012；491:765-8.chengx,yingl,lul,galvaoam,millsja,linhc,etal.self-renewingendodermalprogenitorlinesgeneratedfromhumanpluripotentstemcells.cellstemcell.2012；10:371-84.]，然而由于其來源于多能性干細(xì)胞，同樣難以回避前述的多能性干細(xì)胞應(yīng)用面臨的問題。目前國際上多項(xiàng)研究都在致力于使用小分子將人的成體細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層祖細(xì)胞或者其來源的肝臟細(xì)胞和胰腺細(xì)胞。2014年丁盛實(shí)驗(yàn)室使用yamanaka四因子oskm在人成纖維細(xì)胞中短暫過表達(dá)并且結(jié)合小分子使細(xì)胞首先進(jìn)入一個(gè)不同于escs或ipscs多能性狀態(tài)的一個(gè)可塑中間態(tài)，然后再給予內(nèi)胚層的誘導(dǎo)條件將成纖維細(xì)胞重編程到內(nèi)胚層祖細(xì)胞階段(eps)，接著使用肝細(xì)胞的序貫誘導(dǎo)方法最終獲得了類肝細(xì)胞樣的細(xì)胞[zhus,rezvanim,harbellj,mattisan,wolfear,benetlz,etal.mouseliverrepopulationwithhepatocytesgeneratedfromhumanfibroblasts.nature.2014；508:93-7.]。近期使用類似的方案，他們將人成纖維細(xì)胞重編程到內(nèi)胚層祖細(xì)胞階段后，進(jìn)而向胰腺進(jìn)行誘導(dǎo)分化，從而獲取了功能性的β細(xì)胞[zhus,russha,wangx,zhangm,mat,xut,etal.humanpancreaticbeta-likecellsconvertedfromfibroblasts.natcommun.2016；7:10080.]。盡管這一方式不經(jīng)過多能性狀態(tài)，因此避免了多能性干細(xì)胞的成畸胎瘤性，但其依然需要oskm四因子的始發(fā)驅(qū)動(dòng)，因此還是一個(gè)部分依賴于轉(zhuǎn)錄因子的策略，還未做到完全依賴小分子的作用。分析目前整個(gè)重編程領(lǐng)域還未實(shí)現(xiàn)僅使用小分子來介導(dǎo)譜系重編程獲得上皮源性的內(nèi)胚層譜系細(xì)胞類型包括內(nèi)胚層祖細(xì)胞、肝細(xì)胞或胰腺細(xì)胞的原因，我們認(rèn)為存在以下幾個(gè)關(guān)鍵的科學(xué)問題：1、起始細(xì)胞的問題：首先，無論是經(jīng)典重編程ipscs還是譜系重編程，絕大多數(shù)都是以成纖維細(xì)胞為起始細(xì)胞，盡管成纖維細(xì)胞在獲取上比其它成體細(xì)胞相對(duì)容易，通過皮膚活檢即可獲得，因此也是臨床應(yīng)用的一大優(yōu)勢(shì)，然而對(duì)于期望獲得的目的細(xì)胞如內(nèi)胚層祖細(xì)胞、肝細(xì)胞或胰腺細(xì)胞而言，以成纖維細(xì)胞為起始存在表觀遺傳的障礙。成纖維細(xì)胞來源于中胚層，而目的細(xì)胞內(nèi)胚層祖細(xì)胞則屬于內(nèi)胚層，由中胚層向內(nèi)胚層的跨胚層轉(zhuǎn)換是一個(gè)巨大障礙，尤其是對(duì)于作用較為溫和的小分子而言顯得更為困難。其次，成纖維細(xì)胞在組織學(xué)分類上屬于間質(zhì)類細(xì)胞，而內(nèi)胚層祖細(xì)胞則屬于上皮類細(xì)胞，由成纖維細(xì)胞向內(nèi)胚層祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)換需要經(jīng)歷間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換(met)的過程，而met已經(jīng)被證實(shí)是ipscs產(chǎn)生過程中需要突破的首個(gè)重要障礙[lir,liangj,nis,zhout,qingx,lih,etal.amesenchymal-to-epithelialtransitioninitiatesandisrequiredforthenuclearreprogrammingofmousefibroblasts.cellstemcell.2010；7:51-63.]，同樣met也是譜系重編程的重要障礙。2、小分子的選擇問題：小分子的選擇與起始細(xì)胞的特性密切相關(guān)，不同的起始細(xì)胞決定了在向內(nèi)胚層祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)換過程所需要的小分子組合也不盡相同。由于目前還沒有完全使用小分子獲取內(nèi)胚層的任何一種細(xì)胞類型的報(bào)道來作為參考，因此在小分子的選擇上要經(jīng)過詳盡的調(diào)研和篩選。3、滋養(yǎng)層細(xì)胞的使用問題：滋養(yǎng)層細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，可溶性細(xì)胞外基質(zhì)或microrna等，并且和培養(yǎng)的細(xì)胞密切接觸，給細(xì)胞的生長和存活提供合適的細(xì)胞外微環(huán)境。滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)于干/祖細(xì)胞的培養(yǎng)和重編程來說通常是必須的，而目前無論是重編程還是譜系重編程最常用的滋養(yǎng)層細(xì)胞都是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mefs)、人包皮成纖維細(xì)胞(hffs)或間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)等，這些細(xì)胞僅能提供基礎(chǔ)的干細(xì)胞生長環(huán)境并不具有譜系特異的支持和誘導(dǎo)作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明中，“干/祖細(xì)胞”的概念為“干細(xì)胞”或“祖細(xì)胞”，所指為同一種細(xì)胞，因業(yè)內(nèi)命名不統(tǒng)一，統(tǒng)稱為“干/祖細(xì)胞”。本發(fā)明所提供的將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的方法，可包括以下步驟：1)將原代分離的消化道來源上皮細(xì)胞作為起始細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)所述消化道來源上皮細(xì)胞；2)用絲裂霉素-c處理滋養(yǎng)層細(xì)胞后清洗，并用酶消化細(xì)胞后備用；3)將步驟2)準(zhǔn)備的滋養(yǎng)層細(xì)胞添加于步驟1)擴(kuò)增培養(yǎng)的消化道來源上皮細(xì)胞中，繼續(xù)共培養(yǎng)過夜；4)第2天更換為重編程培養(yǎng)基，每2-3天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-15天，得到誘導(dǎo)內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)克隆。在上述方法中，所述步驟1)中的起始細(xì)胞為消化道來源上皮細(xì)胞包括胃、十二指腸上皮細(xì)胞。從臨床獲取的難易程度考慮，胃上皮細(xì)胞更易獲取，因此優(yōu)選為胃上皮細(xì)胞(hgecs)，尤其優(yōu)選為ncam(神經(jīng)細(xì)胞黏附分子)陽性的胃上皮細(xì)胞(hgecs)。步驟1)優(yōu)選以ncam陽性的胃上皮細(xì)胞為起始細(xì)胞，用kubota(庫部塔)培養(yǎng)基在37攝氏度，5％co2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)5天。所述步驟2)中的滋養(yǎng)層細(xì)胞為消化道來源的基質(zhì)細(xì)胞，包括胃肌成纖維細(xì)胞或小腸肌成纖維細(xì)胞，優(yōu)選人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)。步驟2)優(yōu)選用絲裂霉素-c處理人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)2-3小時(shí)，用pbs清洗細(xì)胞，用tryple酶消化細(xì)胞。步驟3)優(yōu)選按1～3×105每平方厘米的密度將步驟2)準(zhǔn)備的滋養(yǎng)層細(xì)胞添加于步驟1)培養(yǎng)到5天的消化道來源上皮細(xì)胞中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中過夜(12-16小時(shí))。步驟4)中所述重編程培養(yǎng)基為小分子化合物組合與基礎(chǔ)培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)添加成分的混合物；所述小分子化合物選自tgf-β信號(hào)通路、表觀修飾劑、鈣離子通道激動(dòng)劑和代謝通路調(diào)節(jié)劑等功能群；代表性的含有8個(gè)小分子化合物的組合(8m)，包括fbp、bayk8644(bay)、bix01294((bix)、sb431542(sb)或a83-01(a83)、vpa、rg108(rg)、pd0325901和ps48中的全部或多個(gè)包括sb或a83在內(nèi)的化合物的組合。所述8m組合為sb43154：vpa：pd0325901：rg108：bix01294：bayk8644：ps48：fbp按摩爾比為50：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的組合；或a83：vpa：pd0325901：rg108：bix01294：bayk8644：ps48：fbp按摩爾比為12.5：12500：12.5：1:12.5：50:125：87500的組合，且按該配比的8m組合在使用中滿足rg使用濃度為0.01～1μm，優(yōu)選0.04μm。優(yōu)選的小分子化合物組合為包括4個(gè)小分子化合物的組合，為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)組合(簡稱bbrs組合)，或?yàn)閍83-01(a83)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)組合(簡稱bbra組合)；所述小分子化合物組合中各化合物使用濃度為：sb43152為(1～10μm)，a83為(0.4～1μm)，rg108為(0.01～1μm)，bix01294為(0.1～2μm)，bayk8644為(1～4μm)。bbrs組合為各化合物按sb：rg：bix：bay摩爾比50:1:12.5:50的組合，bbra組合為各化合物按a83：rg：bix：bay摩爾比12.5:1:12.5:50的組合；優(yōu)選各化合物使用濃度sb43152為2μm，a83為0.5μm，rg108為0.04m，bix01294為0.5μm，bayk8644為2μm。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為advanceddmem/f12，細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)添加成分包括谷氨酰胺(glutamax)和抗生素，其中在advanceddmem/f12中谷氨酰胺的使用濃度為2mm(1×)，抗生素為青-鏈霉素,使用濃度為100u/ml青霉素，0.1mg/ml鏈霉素。所述步驟4)中的重編程培養(yǎng)基配方為：advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，2μm的sb43154或0.5μm的a83-01，0.5mm的vpa，0.5μm的pd0325901，0.04μm的rg108，0.5μm的bix01294，2μm的bayk8644，5μm的ps48，3.5mm的fbp；所列濃度均為使用濃度，即各組分在advanceddmem/f12(溶劑)中的濃度?；?，advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，1～10μm的sb43152，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；優(yōu)選advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，2μm的sb43152，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644；或advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，0.4～1μm的a83-01，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；優(yōu)選advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，0.5μm的a83-01，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644。具體的，將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的方法，包括以下步驟：1)將原代分離的消化道來源上皮細(xì)胞作為起始細(xì)胞，用無血清kubota’smedium(庫部塔培養(yǎng)基)在37攝氏度，5％co2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)5天；2)用絲裂霉素-c處理滋養(yǎng)層細(xì)胞2-3小時(shí)，用pbs清洗細(xì)胞，用tryple酶消化細(xì)胞；3)按1～3×105每平方厘米的密度將步驟2)準(zhǔn)備的滋養(yǎng)層細(xì)胞添加于步驟1)培養(yǎng)了4-5天的起始上皮細(xì)胞中，在37℃、5％co2條件下共培養(yǎng)過夜(12-16小時(shí))；4)第2天起，更換為重編程培養(yǎng)基，每2-3天換液一次，培養(yǎng)7-15天后，獲得誘導(dǎo)內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs,humaninducedendodermalprogenitorcells)克隆。用上述重編程方法獲得的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)也屬于本發(fā)明。本發(fā)明還提供了一種對(duì)內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)進(jìn)行傳代的方法，包括以下步驟：1)傳代前準(zhǔn)備：在孔板中接種經(jīng)絲裂霉素-c(10μg/ml)處理的成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)或提前約3個(gè)小時(shí)將fibronectin(fn，纖連蛋白)、cell-tak(ct，細(xì)胞組織粘附劑)膠鋪于孔板中，室溫晾干；2)配制傳代培養(yǎng)基：advanceddmem/df12+awf(a83-010.5μm+wnt3a50ng/ml+bfgf10ng/ml)或advanceddmem/df12+a(a83-01，0.5μm)；3)手動(dòng)挑取內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)克隆，并將其劃成小塊，比例約1:3-，將其置于fn+awf、ct+awf或feeder[滋養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素-c(10μg/ml)處理的成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)]+a培養(yǎng)基中在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)得到傳代內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞。以上獲得的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)或傳代內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞在向肝臟細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞和腸細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明可將人胃上皮細(xì)胞(hgecs)作為起始細(xì)胞，從人胃組織肌層分離培養(yǎng)獲取成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)來作為滋養(yǎng)層，用小分子化合物組合在滋養(yǎng)層細(xì)胞的支持下將人胃上皮細(xì)胞譜系重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞，并可進(jìn)一步進(jìn)行傳代培養(yǎng)和擴(kuò)增。利用本發(fā)明獲得的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞或其傳代細(xì)胞并結(jié)合使用相應(yīng)的誘導(dǎo)分化體系，可獲取成熟的肝臟細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞和腸細(xì)胞，期望給肝病、糖尿病以及腸道疾病的細(xì)胞治療提供理想的種子來源，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。附圖說明圖1為確定了起始細(xì)胞、初始小分子以及滋養(yǎng)層細(xì)胞后的本發(fā)明的技術(shù)路線圖；圖2為相差顯微鏡下培養(yǎng)4-5天的胃上皮細(xì)胞(hgecs)和十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖3為相差顯微鏡下傳代培養(yǎng)的胃肌成纖維細(xì)胞形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖4為胃上皮細(xì)胞中胃特異性及內(nèi)胚層祖細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)圖；圖5為人胃上皮細(xì)胞(hgecs)向內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)重編程的動(dòng)態(tài)過程細(xì)胞形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖6為人十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)及其來源的內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖7為分別以人胃上皮細(xì)胞(hgecs)(a)或胃腸道肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)(b)為起始細(xì)胞的重編程過程細(xì)胞形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖8為克隆形態(tài)全景掃描圖，顯示第7天(a)和第15天(b)的不同克隆(用虛線勾畫大致輪廓)，c、d、e、f為代表性克隆的具體形態(tài)；圖9為克隆面積計(jì)算中不同大小克隆所占格子示意圖(標(biāo)尺：250μm)；圖10為小分子化合物(8m)與各種滋養(yǎng)層細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)或條件培養(yǎng)基支持下的克隆形成效率柱狀圖(不同的支持條件下重編程的效率)；圖11為msc、mefs和agsemf-cm支持作用下的細(xì)胞形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖12為8個(gè)小分子化合物(8m)逐一減去的克隆形成效率柱狀圖；圖13為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)4個(gè)小分子化合物逐一減去的克隆形成效率柱狀圖；圖14為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)4個(gè)小分子逐一減去的克隆形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖15a為以sb431542為基礎(chǔ)并和其它三種小分子化合物組合下的克隆形成效率柱狀圖；圖15b為以a83-01為基礎(chǔ)并和其它三種小分子化合物組合下的克隆形成效率柱狀圖；圖16為以sb431542為基礎(chǔ)并和其它三種小分子化合物組合下的克隆形態(tài)圖；圖17為小分子化合物優(yōu)化過程的流程圖；圖18為用熒光原位雜交(fish)進(jìn)行起始細(xì)胞的初步定位染色圖(a:男性來源的hgecs重編程后的fish染色情況；b：女性來源的hgecs重編程后的fish染色情況)；圖19為胃竇部組織cd56(ncam)免疫熒光染色圖(標(biāo)尺：50μm)；圖20為起始細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)的ncam流式分選及相應(yīng)亞群的重編程情況示意圖(線條勾畫的是不同克隆的大致輪廓)；圖21為誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中內(nèi)胚層祖細(xì)胞特異性蛋白的流式水平檢測(cè)圖；圖22為誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中胃特異性及內(nèi)胚層祖細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)檢測(cè)染色圖；圖23為誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中內(nèi)胚層祖細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)分析結(jié)果柱狀圖，(a)和胃特異性基因的表達(dá)分析結(jié)果(b)；圖24為dna甲基化芯片顯示重編程前后全基因組dna表觀遺傳的改變圖(a:hgecs與hiendopcs的聚類分析；b：hiendopcs比hgecs低甲基化基因的go分析)；圖25a為火山圖，顯示hiendopcs與hgecs相比，啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平發(fā)生改變的基因數(shù)量；b為hiendopcs與hgecs在foxa2和gata4基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平比較圖；圖26為rna深度測(cè)序相關(guān)性分析圖，顯示hiedops與esc來源的de、pgt、pfg的關(guān)系；圖27為pca分析圖，顯示hgecs、hdecs、hgecs來源的hiendopcs、hdecs來源的hiendopcs、escs來源的de、gsemfs在全基因表達(dá)譜上的位置關(guān)系；圖28為hgecs與hiendopcs微觀形態(tài)圖，(標(biāo)尺:2μm(a-d)，100nm(e))；圖29為hiendopcs在重編程過程中的動(dòng)力學(xué)特征圖，a為hiendopcs重編程過程中的時(shí)期劃分軸向圖，b為不同時(shí)期的增殖速率曲線圖，c為phaseⅱ和phaseⅲ期的細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化圖；圖30為傳代后的hiendopcs在不同支持環(huán)境下的細(xì)胞形態(tài)圖(標(biāo)尺：100μm)；圖31為hiendopcs在傳代過程中的細(xì)胞形態(tài)圖(標(biāo)尺：200μm)；圖32為hiendopcs傳代次數(shù)及每代的細(xì)胞數(shù)量柱狀圖；圖33為hiendopcs向胰腺誘導(dǎo)分化結(jié)果，a為hiendopc-pans的三維形態(tài)學(xué)圖；b為hiendopc-pansdtz染色圖；c和d為hiendopc-pans胰腺特異性蛋白表達(dá)圖(標(biāo)尺：50μm)；e為hiendopc-pans的胰腺特異性基因表達(dá)圖；f為hiendopc-pans的胰島素釋放反應(yīng)圖；圖34為hiendopcs向腸道誘導(dǎo)分化結(jié)果，a為hiendopc-ints的形態(tài)學(xué)圖；b為hiendopc-ints腸特異性的基因表達(dá)圖；c為hiendopc-ints的腸特異性蛋白染色圖(標(biāo)尺：50μm)；圖35為hiendopcs向肝臟的誘導(dǎo)分化結(jié)果，a為hiendopc-heps的肝特異性基因表達(dá)圖；b為hiendopc-heps的afp和ck18染色圖(標(biāo)尺：50μm)；c為hiendopc-heps的alb和afp流式水平檢測(cè)圖；圖36為hiendopcs向甲狀腺(a)和肺(b)誘導(dǎo)分化的基因表達(dá)水平檢測(cè)柱狀圖。具體實(shí)施方式在確定了起始細(xì)胞、初始小分子以及滋養(yǎng)層細(xì)胞后，本發(fā)明的技術(shù)路線(如圖1所示)為：獲取人胃上皮細(xì)胞(hgecs)作為起始細(xì)胞，從人胃組織肌層分離培養(yǎng)獲取消化道肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)來作為滋養(yǎng)層，篩選合適的小分子組合并在滋養(yǎng)層細(xì)胞的支持下將人胃上皮細(xì)胞譜系重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞。首先，分離培養(yǎng)人胃來源的上皮細(xì)胞(hgecs)作為譜系重編程的起始細(xì)胞，通過初步篩選，確定八個(gè)小分子化合物組合：sb431542+vpa+pd0325901+rg108+bix01294+bayk8644+ps48+fbp，并在人胃來源的肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)作為滋養(yǎng)層的條件下可以將人胃上皮細(xì)胞(hgecs)重編程為內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)樣的克隆。以能夠出現(xiàn)內(nèi)胚層祖細(xì)胞樣克隆為標(biāo)準(zhǔn)，然后對(duì)重編程的體系—小分子化合物和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定bix01294+bayk8644+rg108+sb431542(bbrs)為最優(yōu)的小分子化合物組合，而且確定了能夠?qū)崿F(xiàn)重編程的必需小分子化合物是sb431542。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞—人胃肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)的獲取最為便利，因此確立了重編程最優(yōu)的體系是bbrs+gsemfs，在這樣的體系中重編程的效率為4％-6％；此外，本發(fā)明還證實(shí)了內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)來源于ncam陽性的hgecs，實(shí)現(xiàn)了起始細(xì)胞的精確定位。其次，還對(duì)誘導(dǎo)的內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)從內(nèi)胚層特征性的基因、蛋白表達(dá)水平、表觀遺傳水平、全基因組表達(dá)水平、細(xì)胞微觀形態(tài)水平及細(xì)胞增殖能力、內(nèi)胚層分化潛能對(duì)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)做了全方位鑒定。首先檢測(cè)了常見的內(nèi)胚層祖細(xì)胞特征性的轉(zhuǎn)錄因子foxa2、sox9、hnf1b、pdx1、gata4，其它干/祖細(xì)胞特征性蛋白包括cxcr4、epcam、lgr5、ck19以及胃上皮特異性的標(biāo)志mμc6、gastrin等在hiendopcs中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與hgecs相比內(nèi)胚層標(biāo)志性的基因在hiendopcs中明顯上調(diào)，而胃特異性的基因則不表達(dá)，初步證實(shí)了hgecs向內(nèi)胚層祖細(xì)胞重編程成功。表觀遺傳分析也顯示重編程后細(xì)胞發(fā)生了顯著改變，具備了內(nèi)胚層祖細(xì)胞的分子特征。對(duì)hiendopcs的發(fā)育階段進(jìn)行精確定位，深度測(cè)序的結(jié)果顯示hiendopcs處于hescs來源的原始消化管(pgt)和前腸后段(pfg)這兩個(gè)內(nèi)胚層發(fā)育階段之間，且更接近pfg。此外，hiendopcs具有干細(xì)胞微觀水平的特征并能進(jìn)行4-6次的傳代擴(kuò)增。盡管與escs或ipscs相比，hiendopcs的擴(kuò)增潛能有限，然而以106起始細(xì)胞為起點(diǎn)經(jīng)過重編程和4-6代的擴(kuò)增可以獲得約109的細(xì)胞，這樣的數(shù)量足以進(jìn)行細(xì)胞治療且在有限的傳代次數(shù)內(nèi)細(xì)胞的基因組相對(duì)穩(wěn)定，更加安全，也更加有利于未來的細(xì)胞治療。由于發(fā)育過程中內(nèi)胚層祖細(xì)胞具有向胰腺、肝臟、腸、肺和甲狀腺等內(nèi)胚層器官進(jìn)行分化的潛能，因此使用相應(yīng)的誘導(dǎo)分化條件發(fā)現(xiàn)hiendopcs同樣具有形成功能性胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、腸道細(xì)胞、肺細(xì)胞和甲狀腺細(xì)胞的能力。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《molecμlarcloning:alaboratorymanμal》(sambrook，j.，rμssell，davidw.，molecμlarcloning:alaboratorymanμal，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1、小分子化合物誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞向內(nèi)胚層祖細(xì)胞轉(zhuǎn)換的體系建立本發(fā)明重編程的目的細(xì)胞是內(nèi)胚層祖細(xì)胞，考慮到肝臟、胰腺、膽道、胃、腸等從發(fā)育的角度來看都來源于內(nèi)胚層，與內(nèi)胚層祖細(xì)胞發(fā)育同源，表觀遺傳相似，重編程障礙相對(duì)較小，確定其是良好的起始細(xì)胞類型。其次，臨床上胃大部切除術(shù)或胃癌切除術(shù)等消化道手術(shù)后，不可避免的會(huì)有部分正常的胃或十二指腸組織被遺棄，而且胃潰瘍或十二指腸潰瘍愈后胃鏡活檢隨診，也可獲得的正常的胃或十二指腸的組織，因此起始細(xì)胞的來源也是可行的。本發(fā)明建立胃上皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)體系，然后使用選擇的四大類共八個(gè)小分子并且以消化道肌成纖維細(xì)胞做滋養(yǎng)層來進(jìn)行向內(nèi)胚層祖細(xì)胞的重編程。在這樣的條件下成功的在胃上皮或十二指腸上皮細(xì)胞中產(chǎn)生了內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞樣的克隆。重編程成功后，進(jìn)一步對(duì)這個(gè)體系進(jìn)行了優(yōu)化，找到了最優(yōu)的重編程小分子組合和最少的小分子組合。最后對(duì)起始細(xì)胞進(jìn)行了分群，明確了能夠重編程成功的起始細(xì)胞亞群。本發(fā)明將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的總體思路和策略如下：1、在起始細(xì)胞的選擇上，肝臟、胰腺、胃腸等內(nèi)臟器官都來源于內(nèi)胚層祖細(xì)胞，它們?cè)诎l(fā)育上同源，因此與其它胚層來源的細(xì)胞相比，它們之間具有更近的親緣關(guān)系，更多的表觀遺傳相似性。此外，它們都是上皮組織類型細(xì)胞，在轉(zhuǎn)換的過程中不需要經(jīng)歷met的障礙，因此在理論上它們之間的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換也就相對(duì)容易。此外，胃腸道組織細(xì)胞更新速度較快，大量細(xì)胞處于活躍增殖狀態(tài)，增殖快速的細(xì)胞或祖細(xì)胞更易被重編程。胃腸道(gi-tract)是連接內(nèi)臟各個(gè)器官的通道，各種消化道手術(shù)都會(huì)有大量切除的正常組織被遺棄，同時(shí)胃十二指腸組織通過活檢也可獲得。因此以gi-tract來源的人胃上皮細(xì)胞(hgecs)為起始細(xì)胞向內(nèi)胚層祖細(xì)胞進(jìn)行重編程，在與以成纖維細(xì)胞為起始相比，具有表觀同源性的優(yōu)勢(shì)，上皮源性的優(yōu)勢(shì)，增殖祖細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)和也具有臨床操作的可行性。2、在小分子的選擇上，確定了四大類功能明確的，能夠正向調(diào)控重編程的小分子群，分別是：(1)信號(hào)通路抑制劑：tgf-β信號(hào)通路抑制劑sb431542(sb)或a83-01(a83)，sb或a83可以替代sox2，與oct4、klf4、c-myc組合就可產(chǎn)生ipscs，另一個(gè)是mapk/erk信號(hào)通路抑制劑pd0325901(pd)，pd與sb(或a83)組合可將重編程效率提高100多倍，而且大大縮短重編程時(shí)間；(2)表觀修飾劑：組蛋白去乙?；敢种苿﹙pa，vpa甚至可以取代klf4、c-myc兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，與oct4、sox2組合可以促進(jìn)ipscs的生成，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑bix01294(bix)、dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑rg108(rg)都可明顯提高重編程效率；(3)鈣離子通道激動(dòng)劑bayk8644(bay)，bay與bix的組合則可取代sox2與c-myc；(4)代謝通路調(diào)節(jié)劑：磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1激動(dòng)劑ps48、磷酸果糖激酶激動(dòng)劑fbp，有利于成熟細(xì)胞氧化磷酸化的能量代謝向干細(xì)胞無氧糖酵解的途徑轉(zhuǎn)換，從而提高重編程效率。3、在滋養(yǎng)層細(xì)胞的選擇上，為了促進(jìn)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的產(chǎn)生和維持，選擇了與內(nèi)胚層器官緊密相關(guān)的消化道肌成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，這些細(xì)胞在發(fā)育的早期會(huì)通過旁分泌的作用影響內(nèi)胚層器官的發(fā)生和支持內(nèi)胚層祖細(xì)胞的擴(kuò)增。一、胃上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及表型鑒定材料與方法以下所列材料與方法源自實(shí)驗(yàn)的原始記錄。在本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用中，可以使用商業(yè)來源的材料和符合工業(yè)應(yīng)用的方法實(shí)施，不受所列實(shí)驗(yàn)的限制。(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)組織手術(shù)或者活檢來源的胃、十二指腸組織由中國人民解放軍總醫(yī)院和307醫(yī)院普外科提供，流產(chǎn)胎兒組織由解放軍總醫(yī)院提供，所有提供組織的患者均已知情并簽署知情同意書，組織標(biāo)本使用經(jīng)解放軍總醫(yī)院和307醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。(2)實(shí)驗(yàn)器材激光共聚焦顯微鏡(zeiss)、恒溫水浴鍋(長風(fēng))、低溫離心機(jī)(eppendorf)、倒置相差顯微鏡(leica)、手術(shù)器械(手術(shù)刀柄、刀片、眼科直鑷、彎鑷、剪刀)、激光共聚焦小皿(nest)。(3)主要試劑及配制1、kubotamedium(km)培養(yǎng)基的配制：一袋rpmi1640(gibco)粉末溶解于1l去離子水中，加入1×青-鏈霉素，10-9mzincsulfateheptahydrate(七水硫酸鋅，sigma)，0.54gnicotinamide(煙酰胺，sigma)，5mginsulin(胰島素，sigma)，10-6mhydrocortisone(氫化可的松，sigma)，2gnahco3(sigma)，5×10-5mbeta-mercaptoethanol(β巰基乙醇，sigma)，30nmselenium(硒，sigma)，游離脂肪酸(sigma)，10μg/mlhighdensitylipoprotein(高密度脂蛋白，sigma)，1gbovineserumalbumin(牛血清白蛋白，購自gibco)，5mgtransferrin(轉(zhuǎn)鐵蛋白，sigma)，2mmglutamax(谷氨酰胺，購自gibco)。2、無ca2+、mg2+pbs的配制：使用1l去離子水溶解0.24gkh2po4，8.0gnacl，0.2gkcl，1.44gna2hpo4，可根據(jù)配制的體積等比例添加試劑。配制完成后0.45μm濾膜過濾后高壓蒸汽滅菌或直接0.22濾膜過濾后使用。3、主要抗體：表1用于人胃上皮細(xì)胞(hgecs)免疫熒光檢測(cè)的第一抗體一抗公司貨號(hào)一抗種屬稀釋比cxcr4(c-x-c基序趨化因子受體4)abcamab77909兔200epcam(上皮細(xì)胞粘附分子)neomarkerms-181小鼠免疫球蛋白1200foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)r&daf2400山羊免疫球蛋白100sox9(性別決定區(qū)域y基因9)abcamab76997小鼠免疫球蛋白2a50ck19(細(xì)胞角蛋白19)abcamab7754小鼠免疫球蛋白2a200lgr5(富含重復(fù)亮氨酸g蛋白偶聯(lián)受體5)sigmahpa012530兔350gastrin(胃泌素,gast)santacruzsc-7783山羊50muc6(黏膜蛋白-6)abcamab49462小鼠免疫球蛋白150表2用于人胃上皮細(xì)胞(hgecs)免疫熒光檢測(cè)的第二抗體4、0.075mg/mlⅳ型膠原酶的配制：200mladvancedrpmi1640培養(yǎng)基(購自gibco)中加入20mgⅳ型膠原酶(sigma)和6mgdnasea。5、其它試劑和材料：tryple消化酶(購自invitrogen)、4％(v/v)多聚甲醛(購自sigma)、dnasea(invitrogen)、0.2％(v/v)tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚，購自sigma)、胎牛血清(fbs，gibco)、枸櫞酸鈉緩沖液(購自sigma)、dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，sigma)、免疫組織化學(xué)試劑盒(vectorlab)。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)獲取胃上皮細(xì)胞胃上皮細(xì)胞可直接購買獲得；也可用以下操作分離培養(yǎng)獲得胃竇、幽門部或十二指腸粘膜上皮細(xì)胞：1)、提前將配制好的ⅳ型膠原酶放置于室溫或37℃平衡，將pbs置于冰上預(yù)冷，準(zhǔn)備1000×青-鏈霉素，75％(v/v)酒精消毒手術(shù)器械。2)、從醫(yī)院獲取新鮮的胃手術(shù)后胃竇、幽門或十二指腸組織標(biāo)本，盡量半個(gè)小時(shí)內(nèi)用冰盒運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。3)、在預(yù)冷的pbs中加入5×的青-鏈霉素并用其清洗獲取的組織標(biāo)本4-5次，充分洗去殘余血污。4)、鈍性分離清洗后的胃組織粘膜層與肌層，同樣用含5×青-鏈霉素的冷pbs分別清洗粘膜層和肌層，而后進(jìn)行不同的處理。5)、使用剪刀和手術(shù)刀結(jié)合將粘膜層剪碎或剁碎，加入適量的ⅳ型膠原酶(0.075mg/ml)37℃水浴消化，每2-3分鐘振蕩一次，8-10分鐘沉降一次分離物，每次冰上沉降2-3分鐘，然后滴管小心收集上清，余下部分繼續(xù)加適量的酶消化。6)、重復(fù)步驟5，直至無明顯的大塊組織即終止。7)、在收集的上清中加入預(yù)冷pbs，4℃、1200rpm(轉(zhuǎn)/每分鐘)離心5分鐘，洗滌3-4遍，充分去除細(xì)胞中殘留的消化酶。8)、用含有8％(v/v)胎牛血清(fbs)和1×青-鏈霉素的km培養(yǎng)基以合適密度接種細(xì)胞，貼壁過夜，次日換為無血清的km培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。9)、在培養(yǎng)的過程中每2-3天換液，大概培養(yǎng)4-5天即可開始重編程。結(jié)果：將從臨床獲取的胃或十二指腸組織進(jìn)行分離可得到粘膜層和肌層，粘膜層用于分離胃或十二指腸上皮細(xì)胞，肌層則用于分離滋養(yǎng)層細(xì)胞—肌成纖維細(xì)胞。按照實(shí)驗(yàn)步驟中胃或十二指腸上皮的組織分離方法，通常得到的是接近隱窩部的細(xì)胞。使用無血清的上皮細(xì)胞篩選培養(yǎng)基庫部塔(kubota’smedium)培養(yǎng)，人胃上皮細(xì)胞(hgecs)和十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)在培養(yǎng)中都呈現(xiàn)典型的舞蹈樣的上皮形態(tài)(如圖2所示)。經(jīng)過觀察，大約第4-5天細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到最多，此后細(xì)胞進(jìn)入逐漸凋亡的狀態(tài)。因此，通常以培養(yǎng)到4-5天后的細(xì)胞，來作為向內(nèi)胚層祖細(xì)胞重編程的起始細(xì)胞。而且經(jīng)過對(duì)幾十例胃和十二指腸不同部位細(xì)胞分離培養(yǎng)的觀察和分析來看，發(fā)現(xiàn)胃竇、幽門或十二指腸來源的組織無論是在細(xì)胞貼附還是生長方面都最好，胃體部或胃底、賁門部組織則幾乎不能貼附或很難培養(yǎng)。又由于十二指腸組織來源相對(duì)較少，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中除非特別提及，都以胃竇部或胃幽門部組織作為來源，分離獲取胃上皮細(xì)胞來作為重編程的起始細(xì)胞。(2)肌成纖維細(xì)胞的獲得肌成纖維細(xì)胞可直接購買獲得；也可用以下貼壁法分離和培養(yǎng)胃腸道肌成纖維細(xì)胞：1)、對(duì)前述獲得的胃或十二指腸肌層使用手術(shù)刀片充分剁碎為小組織塊，越小越好，加入少量的含15％(v/v)胎牛血清(fbs)的高糖培養(yǎng)基或km培養(yǎng)基潤濕組織碎塊，使用1毫升小滴管將組織碎塊均勻涂抹于10cm培養(yǎng)皿中，倒置于37℃培養(yǎng)箱30分鐘。其余基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)方法如上述。2)、貼附30分鐘后，沿培養(yǎng)皿邊緣加入基質(zhì)細(xì)胞生長培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)、經(jīng)過5-7天培養(yǎng)可見有梭形細(xì)胞從組織塊周圍爬出，2周后大量細(xì)胞爬出并生長，此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代、凍存。這樣即可獲得胎兒胃的肌成纖維細(xì)胞(fgsemfs)、成人胃的肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)、胎兒腸肌成纖維細(xì)胞(fisemfs)、胎兒橫隔基質(zhì)細(xì)胞(fdcs)。凍存后的細(xì)胞可為以后重編程提供滋養(yǎng)層細(xì)胞。結(jié)果：將得到的胃或十二指腸肌層機(jī)械法剁碎成小塊使用組織貼壁法分離培養(yǎng)肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)。組織貼附約4-7天，可以看到有梭狀的細(xì)胞從組織塊中爬出，10-14天可以進(jìn)行傳代，傳代培養(yǎng)的肌成纖維細(xì)胞呈典型的長梭樣的成纖維細(xì)胞形態(tài)(如圖3所示)。(3)胃上皮細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)對(duì)人胃上皮細(xì)胞(hgecs)特性進(jìn)行免疫熒光鑒定，包括以下操作(一抗、二抗分別如表1和表2所示)：1)、4％(v/v)多聚甲醛固定細(xì)胞10-15min，pbs清洗2遍。2)、0.2％(v/v)tritonx-100破膜10分鐘，pbs清洗一遍。3)、二抗種屬來源的血清封閉1小時(shí)，pbs清洗一遍。4)、相應(yīng)一抗孵育4℃過夜，pbs清洗2-3遍。5)、相應(yīng)二抗室溫避光孵育1小時(shí)，pbs清洗2-3遍。6)、dapi室溫避光孵育15分鐘。7)、激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并攝像。結(jié)果：如圖4所示，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)人胃上皮細(xì)胞(hgecs)低表達(dá)內(nèi)胚層祖細(xì)胞標(biāo)志ck19、foxa2、cxcr4、sox9、lgr5、epcam等，而高表達(dá)胃特征性標(biāo)志muc6和gast。第一部分“胃上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)及表型鑒定”成功建立了胃竇或幽門部胃上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)體系，體外培養(yǎng)的人胃上皮細(xì)胞(hgecs)呈典型的上皮樣形態(tài)。由于隱窩部細(xì)胞通常較為原始(與胃成熟細(xì)胞類型相比)，可以進(jìn)行一定程度的增殖。人胃上皮細(xì)胞(hgecs)高表達(dá)胃特異性標(biāo)志，低表達(dá)內(nèi)胚層早期祖細(xì)胞標(biāo)志，與我們先前的推測(cè)一致，因其部分表達(dá)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的某些標(biāo)志，在向內(nèi)胚層祖細(xì)胞的重編程過程中重編程障礙會(huì)相對(duì)較小，因此是向內(nèi)胚層祖細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)換的良好起始細(xì)胞來源。但是人胃上皮細(xì)胞(hgecs)的胃上皮特征性的標(biāo)記在重編程的過程中則必須要丟失。解決了起始細(xì)胞的來源和培養(yǎng)問題，而且也初步明確了其特性，下一步將以其為起始細(xì)胞進(jìn)行向內(nèi)胚層祖細(xì)胞的重編程。二、小分子化合物和滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞向內(nèi)胚層祖細(xì)胞轉(zhuǎn)換材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)和成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)在步驟一中制備并保存。(2)實(shí)驗(yàn)器材倒置相差顯微鏡(leica)、顯微鏡格子線、低溫離心機(jī)(eppendorf)、12孔板。(3)主要試劑及配制1、基礎(chǔ)試劑advanceddmem/f-12培養(yǎng)基、advancedrpmi1640培養(yǎng)基、neaa(非必需氨基酸)、tryple消化酶、谷氨酰胺(glutamax)、dispase(離散酶)均購自gibco公司，青-鏈霉素和絲裂霉素-c(sigma)。2、小分子化合物表38個(gè)小分子化合物(8m)“使用濃度”是指各化合物以advanceddmem/f-12培養(yǎng)基為溶劑的濃度。3、8m重編程培養(yǎng)基配制配方：advanceddmem/f12+2mm谷氨酰胺(glutamax)+青-鏈霉素(100u/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素)+sb43154(2μm)+vpa(0.5mm)+pd0325901(0.5μm)+rg108(0.04μm)+bix01294(0.5μm)+bayk8644(2μm)+ps48(5μm)+fbp(3.5mm)。該配方中各組分濃度均為其以advanceddmem/f-12培養(yǎng)基為溶劑的濃度。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)小分子化合物介導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞(hgecs)或十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)向誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)轉(zhuǎn)換具體方法包括以下步驟：1、起始細(xì)胞的擴(kuò)增：原代分離的人胃上皮細(xì)胞(hgecs)或十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)作為起始細(xì)胞，用kubta培養(yǎng)基(參照文獻(xiàn)進(jìn)行配制，文獻(xiàn)來源kubota,h.,andreid,l.m.(2000).clonogenichepatoblasts,commonprecursorsforhepatocyticandbiliarylineages,arelackingclassicalmajorhistocompatibilitycomplexclassiantigen.proc.natl.acad.sci.usa97,12132–12137)在37℃、5％co2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)4-5天，將起始細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。2、滋養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備：用絲裂霉素-c(10μg/ml，目的是使滋養(yǎng)層細(xì)胞失去有絲分裂的能力))處理滋養(yǎng)層細(xì)胞的成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs，該細(xì)胞由胃組織基質(zhì)層分離獲得，培養(yǎng)擴(kuò)增后大量凍存，需要時(shí)提前復(fù)蘇備用)2-3小時(shí)，pbs洗3-4遍，tryple酶消化細(xì)胞，而后洗滌細(xì)胞；3、當(dāng)待人胃上皮細(xì)胞(hgecs)或十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)培養(yǎng)至第5-6天時(shí)，將已處理的胃肌成纖維細(xì)胞以適宜密度(密度一般為1～3×105每平方厘米)添加于培養(yǎng)中的人胃上皮細(xì)胞(hgecs)或十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中過夜(12-16小時(shí))；4、重編程培養(yǎng)：在添加了胃肌成纖維細(xì)胞的第二天更換為8m重編程培養(yǎng)基，每2-3天換一次培養(yǎng)基，連續(xù)觀察，一般培養(yǎng)1周或2周以上(7-15天)，得到誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)。結(jié)果：(1.1)人胃上皮細(xì)胞(hgecs)向誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的轉(zhuǎn)換利用8個(gè)小分子化合物(8m，如表3所示)，在8m重編程培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)的胃腸道肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，人胃上皮細(xì)胞(hgecs)的形態(tài)不斷發(fā)生明顯變化，由開始的形態(tài)較大的舞蹈樣或多角樣上皮，在第7天開始出現(xiàn)邊界較清晰的小的細(xì)胞克隆，在第15天左右，人胃上皮細(xì)胞(hgecs)已經(jīng)被重編程為邊界清晰，細(xì)胞小而緊密，形態(tài)較為均一，核質(zhì)比較大的典型內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞樣克隆(g-hiendopcs)，如圖5所示(圖5中下排圖片為上排圖片方框中的放大部分)。(1.2)人十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)向內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的轉(zhuǎn)換同樣，以人十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)為起始，在8m重編程培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)的胃腸道肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用下，經(jīng)過15天的誘導(dǎo)也可形成典型的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞克隆(d-hiendopcs)(如圖6所示，左幅為十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)，右幅為十二指腸上皮細(xì)胞重編程產(chǎn)生的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(d-hiendopcs)，形態(tài)與g-hiendopcs(圖5)幾乎類似。由于十二指腸組織來源有限，通常以人胃上皮細(xì)胞(hgecs)作為重編程的起始細(xì)胞。(1.3)僅以人胃上皮細(xì)胞(hgecs)或胃腸道肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)為起始細(xì)胞向內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的轉(zhuǎn)換不使用小分子化合物，不能形成內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞樣克隆，但是分別僅以人胃上皮細(xì)胞(hgecs)或胃腸道肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)為起始細(xì)胞，在8m重編程培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天也均不能形成內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞樣克隆(如圖7所示)，說明小分子化合物(8m)、人胃上皮細(xì)胞(hgecs)和胃腸道肌成纖維細(xì)胞(gsemfs)的組合是內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)形成不可或缺的因素。(2)克隆形成效率的計(jì)算具體方法包括以下步驟：1、計(jì)算克隆的總數(shù)。2、使用顯微鏡格子線計(jì)算不同克隆的面積大?。好總€(gè)顯微鏡微格的面積為0.0625mm2，用克隆所占的格子數(shù)乘以0.0625mm2則是每個(gè)克隆的面積。3、綜合克隆的數(shù)目和克隆的面積大小來評(píng)價(jià)重編程的效率。結(jié)果：在前述的觀察中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在重編程第7天時(shí)已經(jīng)有小的細(xì)胞克隆開始出現(xiàn)，孔板全景掃描顯示這樣的小克隆界限清晰，數(shù)量非常多(圖8之a(chǎn))，在形態(tài)上已經(jīng)接近經(jīng)典的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞克隆形態(tài)(圖8之c和d)。由于在重編程第15天產(chǎn)生的克隆形態(tài)最典型(圖8之e和f)，通常在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)計(jì)算克隆形成效率，但第7天至15天克隆的生長速度較快，許多克隆在計(jì)算的時(shí)間節(jié)點(diǎn)融合在一起形成大的克隆(圖8之b)，因此克隆的數(shù)目在計(jì)算時(shí)較少，但是總的面積在增大，為了更加客觀的反應(yīng)重編程效果，本實(shí)驗(yàn)綜合克隆的總數(shù)目以及不同面積下的克隆數(shù)目和克隆面積來作為重編程效率計(jì)算方法。使用顯微鏡格子線計(jì)算不同克隆的面積大?。好總€(gè)顯微鏡微格的面積為0.0625mm2，用克隆所占的格子數(shù)乘以0.0625mm2則是每個(gè)克隆的面積，不同大小的克隆面積計(jì)算方法如圖9所示，計(jì)算結(jié)果參見表4。表4:不同大小的克隆面積計(jì)算結(jié)果方格數(shù)面積a120.750b0.10.006c60.375第二部分在初步選擇的八個(gè)小分子(8m)和成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)作為滋養(yǎng)層的條件下成功的將人胃上皮細(xì)胞(hgecs)重編程到內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)的階段，由于在重編程的過程中發(fā)生的最初的明顯改變是細(xì)胞形態(tài)，因此將干/祖細(xì)胞克隆的出現(xiàn)作為重編程成功的初始判斷。使用相同的方法同樣可以將人十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)。在重編程過程中，小分子化合物和滋養(yǎng)層細(xì)胞是必需的要素。盡管初步實(shí)現(xiàn)了我們的設(shè)想，但仍然需要找到最佳的重編程方案，盡可能的提高重編程效率，減少小分子化合物數(shù)目，而且找到關(guān)鍵的小分子將會(huì)對(duì)解析重編程的機(jī)制有著十分重要的提示作用。三、小分子化合物和滋養(yǎng)層細(xì)胞重編程體系的優(yōu)化材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)、胎兒胃肌成纖維細(xì)胞(fgsemfs)、成人胃的肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)、胎兒腸肌成纖維細(xì)胞(fisemfs)、胎兒橫隔基質(zhì)細(xì)胞(fdcs)在步驟一中制備；間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mefs)、成人皮膚成纖維細(xì)胞(hffs)來源于包皮組織，由本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)并保存。(2)實(shí)驗(yàn)器材倒置相差顯微鏡(leica)、顯微鏡格子線、12孔板。(3)主要試劑1、基礎(chǔ)試劑：advanceddmem/f-12培養(yǎng)基、advancedrpmi1640培養(yǎng)基、neaa(非必須氨基酸)、谷氨酰胺(glutamax)均購自gibco公司；青-鏈霉素、絲裂霉素-c購自sigma公司；tryple、dispase消化酶購自invitrogen公司；matrigel膠購自bd公司；gelatin購自sigma公司。2、小分子化合物組合(8m)：種類和使用濃度與第二部分相同(見表3)。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)胎兒腸肌成纖維細(xì)胞(fisemfs)或成人胃的肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)條件培養(yǎng)基制備：用濃度10μg/ml的絲裂霉素c處理fisemfs細(xì)胞或agsemfs細(xì)胞2-3小時(shí)，pbs洗3-4遍，然后加上advanced(先進(jìn))dmem/f-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天收集培養(yǎng)基，0.22μm濾器過濾，保存于-80℃。(2)不同的滋養(yǎng)層細(xì)胞支持人胃上皮細(xì)胞(hgecs)重編程為內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)具體方法包括以下步驟：1)、起始細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)的處理與步驟二中的方法相同。2)、各種滋養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備與第二部分中的方法相同。3)、重編程方法與第二部分中的方法相同。4)、在重編程第15天計(jì)算小分子化合物(8m)與各種滋養(yǎng)層細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)或條件培養(yǎng)基下支持下的克隆形成效率，進(jìn)而找到合適的滋養(yǎng)層細(xì)胞。結(jié)果：在前述的實(shí)驗(yàn)中使用8個(gè)小分子化合物(8m)和成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)實(shí)現(xiàn)了人胃上皮細(xì)胞(hgecs)向內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的轉(zhuǎn)換。接下來確定更佳的滋養(yǎng)層細(xì)胞或?qū)崿F(xiàn)無滋養(yǎng)層細(xì)胞的重編程。使用了多種消化道來源的基質(zhì)細(xì)胞包括胎兒胃肌成纖維細(xì)胞(fgsemfs)、胎兒腸肌成纖維細(xì)胞(fisemfs)、胎兒橫隔基質(zhì)細(xì)胞(fdcs)以及其它常用的滋養(yǎng)層細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mefs)、成人皮膚成纖維細(xì)胞(hffs)等，還測(cè)試了多種細(xì)胞外基質(zhì)如matrigel膠、明膠等，以及胎兒腸肌成纖維細(xì)胞(fisemfs)來源的和成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)來源的條件培養(yǎng)基，分別來進(jìn)行重編程的比較。在8m重編程培養(yǎng)基條件下，發(fā)現(xiàn)fisemfs、fgsemfs、agsemfs等消化道基質(zhì)細(xì)胞和橫隔基質(zhì)細(xì)胞都可以成功的支持hgecs產(chǎn)生hiendopcs，其中又以胎兒腸肌成纖維細(xì)胞(fisemfs)的重編程效率最高，其它的支持介質(zhì)如mefs、hffs、mscs、matrigel、明膠以及條件培養(yǎng)基等則很少或幾乎不能支持重編程(如圖10所示)。以mscs或mefs為支持細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生少量的不典型的上皮樣細(xì)胞克隆。在成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)來源的條件培養(yǎng)基(agsemfs-cm)中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞在不斷凋亡(如圖11所示，圖中右上角或左上角圖片為小方框中的放大圖)。由于胎兒組織來源有限，而臨床上成人的胃手術(shù)標(biāo)本最容易獲取，可以得到足量的成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)，而且agsemfs也可以維持較高的重編程效率，因此agsemfs是一類良好的重編程滋養(yǎng)層細(xì)胞，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將以其為滋養(yǎng)層細(xì)胞來支持重編程。(3)小分子組合的優(yōu)化—重編程必要小分子的篩選1)、以第二部分篩選的滋養(yǎng)層細(xì)胞為支持細(xì)胞，在前述的8個(gè)小分子化合物(8m)培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上逐個(gè)遞減小分子，首先篩選到不可或缺的小分子。2)、再以第1)步篩選的小分子化合物組合為基礎(chǔ)，依次逐個(gè)遞減最終找到最佳(重編程效率最高)的小分子化合物組合和最少(保證克隆能夠形成)的小分子化合物組合。(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均來自于3次及以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，除特殊說明外，數(shù)據(jù)均描述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用spss軟件進(jìn)行學(xué)生雙尾t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)兩組之間的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：在步驟(2)中確定了最合理的滋養(yǎng)層細(xì)胞—成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)，以其作為支持細(xì)胞，來進(jìn)行小分子組合的優(yōu)化。以8個(gè)小分子化合物的組合(8m)為基礎(chǔ)然后逐個(gè)遞減小分子，當(dāng)減去pd0325901、ps48、fbp后克隆的形成效率有所提高，說明這些小分子化合物在重編程中起到一定的抑制作用，應(yīng)該舍去；當(dāng)減去vpa后，克隆形成的效率沒有明顯變化，表明vpa可有可無，基于簡單化原則，應(yīng)該去掉；但當(dāng)減去bix01294、bayk8644、rg108時(shí)克隆的形成效率明顯減少，尤其是當(dāng)sb431542減去后克隆不能產(chǎn)成(如圖12所示)，表明這四個(gè)小分子是必要的。在前述必須的4個(gè)小分子化合物bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(簡稱bbrs組合)的組合上，誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)同樣可以產(chǎn)生而且效率比8個(gè)小分子化合物(8m)條件下更高。然后再以bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(bbrs組合)為基礎(chǔ)再進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)去除bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)任何一個(gè)小分子，克隆的形成效率都會(huì)明顯下降(如圖13所示)，但克隆的形態(tài)與bbrs組沒有明顯差異，當(dāng)減去sb431542(sb)后則沒有克隆形成(如圖14所示)。因此確定了重編程最佳的組合是bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(bbrs)，在bbrs組合條件下重編程的效率約為4％-6％(如圖13所示)。由于sb431542的作用最為關(guān)鍵，因此以sb431542為基礎(chǔ)，再與另外三個(gè)小分子(bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg))的任意一個(gè)進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)sb431542是能夠保證克隆形成的最少小分子組合，盡管效率不及最優(yōu)組合bbrs(如圖15a所示)，但形態(tài)都無明顯差異(如圖16所示)。sb431542不可或缺的作用對(duì)重編程過程中小分子化合物的作用機(jī)制有重要的提示作用。(5)重編程必要小分子化合物的優(yōu)化在證實(shí)了重編程體系中sb431542(sb)是最少的能夠保證重編程成功的小分子化合物后，由于sb431542是tgf-β信號(hào)通路抑制劑，發(fā)明人嘗試使用另一種tgf-β信號(hào)通路抑制劑a83-01(a83)替代sb重復(fù)小分子化合物組合的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果a83(使用濃度0.5μm)無論是單獨(dú)作用還是與其他小分子組合(簡稱bbra組合)都可以產(chǎn)生和sb類似甚至更好的重編程作用。結(jié)果見圖15b，其中bbr分別代表另外三個(gè)小分子bix01294(b)、bayk8644(b)、rg108(r)。第三部分通過對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的篩選，確定了多種消化道肌成纖維細(xì)胞都可以支持人胃上皮細(xì)胞(hgecs)向內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的轉(zhuǎn)換，尤其是胎兒來源的基質(zhì)細(xì)胞支持作用更強(qiáng)，提示與消化道相關(guān)的滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)于內(nèi)胚層祖細(xì)胞重編程的獨(dú)特支持作用?？紤]到細(xì)胞來源的充足情況，確定了成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)為滋養(yǎng)層細(xì)胞。在agsemfs為支持細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過3輪小分子的優(yōu)化過程篩選到了最佳的重編程小分子組合bix01294、bayk8644、rg108、sb431542(bbrs)或bix01294、bayk8644、rg108、a83-01(bbra)以及必要小分子sb431542或a83-01(a83)，其篩選過程如圖17所示。后面實(shí)施例3中，發(fā)明人將以bbrs+agsemfs為例作為重編程條件，對(duì)人胃上皮細(xì)胞(hgecs)向內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)重編程做詳細(xì)描述。四、重編程起始細(xì)胞的精確定位材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、組織人胃上皮細(xì)胞(hgecs)、成人胃的肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)、成人胃竇部組織(解放軍總醫(yī)院提供)。(2)實(shí)驗(yàn)器材流式細(xì)胞分析儀(bd)，激光共聚焦顯微鏡(zeiss)，倒置相差顯微鏡(leica)。(3)主要試劑基礎(chǔ)試劑：advanceddmem/f-12培養(yǎng)基、neaa(非必須氨基酸)、谷氨酰胺(glutamax)均購自gibco公司；青-鏈霉素、accutase、絲裂霉素-c均購自sigma公司；tryple消化酶購自invitrogen公司。小分子化合物：sb431542、bix01294、rg108、bayk8644均購自stemgent公司。抗體：cd56-pe(ebioscience)、兔抗人cd56(ncam)(abcam)、鼠抗人igg1muc5ac(abcam)；alexa647goatanti-mouseigg2b(γ2b)、alexa568goatanti-mouseigg1(γ1)均購自invitrogen公司。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)熒光原位雜交(fish)—起始細(xì)胞的初步定位具體方法包括以下步驟：1)、將男性來源的胃上皮細(xì)胞接種到女性來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞上進(jìn)行重編程或者反之。2)、重編程成功后對(duì)原孔的細(xì)胞用甲醇和冰醋酸的混合物(3:1)固定20分鐘，送公司進(jìn)行x和y染色體的原位雜交。3)、處理完后的細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下觀察性別染色體分別在hiendopcs和滋養(yǎng)層細(xì)胞上的染色情況。結(jié)果：由于在重編程體系中涉及到兩種細(xì)胞類型，起始細(xì)胞—人胃上皮細(xì)胞(hgecs)和滋養(yǎng)層細(xì)胞—成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)，前述已經(jīng)證實(shí)它們單獨(dú)都不能被重編程為誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)，只有兩者組合并在bbrs重編程培養(yǎng)基的培養(yǎng)下經(jīng)重編程才能成功。為了進(jìn)一步證實(shí)hiendopcs確實(shí)來源于胃上皮細(xì)胞而不是滋養(yǎng)層細(xì)胞，進(jìn)行了性別錯(cuò)配結(jié)合熒光原位雜交(fish)的實(shí)驗(yàn)：使用男性來源的hgecs作為起始細(xì)胞，以女性來源的胃腸道肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)為滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行重編程，熒光原位雜交(fish)的結(jié)果顯示，重編程得到的hiendopcsx和y染色體都是陽性，表明是確實(shí)是男性來源，而滋養(yǎng)層細(xì)胞則僅是x染色體陽性表明是女性來源(圖18a)；而當(dāng)以女性來源的hgecs作為起始細(xì)胞，以男性來源的胃腸道肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)為滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行重編程，熒光原位雜交(fish)的結(jié)果則顯示hiendopcs僅x染色陽性，表明是女性來源，而滋養(yǎng)層細(xì)胞x、y染色體均陽性表明是男性來源(圖18b)。本實(shí)驗(yàn)充分證明了hiendopcs起源于胃上皮細(xì)胞而非滋養(yǎng)層細(xì)胞。(2)起始細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)表面標(biāo)志的確定—cd56標(biāo)記的流式分選、接種和重編程具體方法包括以下步驟：1)、用accutase(細(xì)胞消化液)將人胃上皮細(xì)胞(hgecs)消化成單細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清。2)、用pbs洗1遍。3)、用pbs重懸并加入適量cd56-pe，對(duì)照組加pe(pe，一種熒光標(biāo)記染料)同型對(duì)照抗體。4)、置于4℃搖床45min。5)、用pbs洗3遍。6)、用適量pbs重懸。7)、用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析并篩選，分別保留cd56陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞(全程注意無菌)。8)、將cd56陽性和陰性的細(xì)胞以同樣的數(shù)量接種于提前用絲裂霉素c處理好的成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)上，細(xì)胞貼附過夜(12-16小時(shí))后更換為bbrs重編程培養(yǎng)基，進(jìn)行重編程。對(duì)胃竇部組織cd56(ncam，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，是表達(dá)于細(xì)胞膜上的一種表面蛋白)免疫熒光染色，細(xì)胞免疫熒光染色方法同第一部分。結(jié)果：通過fish實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)了起始細(xì)胞來源于胃上皮細(xì)胞而非滋養(yǎng)層細(xì)胞。由于胃上皮細(xì)胞屬于原代細(xì)胞，細(xì)胞類型較為混雜，為了進(jìn)一步明確起始細(xì)胞中哪一類亞群發(fā)生了向hiendopcs的轉(zhuǎn)換，需要對(duì)起始細(xì)胞進(jìn)行細(xì)分。首先需要明確hgecs的表面標(biāo)記，由于分離的hgecs主要來源于胃竇部的隱窩，有研究報(bào)道ncam是表達(dá)于多種內(nèi)胚層來源組織的一種表面標(biāo)志尤其是表達(dá)于較原始的細(xì)胞上，因此對(duì)胃竇部組織進(jìn)行ncam原位染色，發(fā)現(xiàn)ncam(cd56)主要在深部胃組織(即隱窩部分)中有強(qiáng)弱不同程度的表達(dá)(如圖19左幅紅色熒光所示),淺部胃組織幾乎不表達(dá)，淺部組織主要表達(dá)muc5ac(如圖19中間幅綠色熒光所示，圖19右幅為顯示ncam染色和muc5ac染色的合成圖)，因此認(rèn)為ncam是可以用于起始細(xì)胞分群的可靠標(biāo)志。以ncam作為分選標(biāo)記對(duì)培養(yǎng)的hgecs進(jìn)行流式分類，分為ncam陽性和ncam陰性的兩群細(xì)胞。然后以ncam陽性和陰性的細(xì)胞為起始細(xì)胞分別進(jìn)行重編程。結(jié)果顯示ncam陽性的起始細(xì)胞能夠重編程成功，而陰性的細(xì)胞幾乎不能(如圖20所示)。第四部分通過性別錯(cuò)配實(shí)驗(yàn)證實(shí)起始細(xì)胞來源于胃上皮細(xì)胞而非滋養(yǎng)層細(xì)胞。通過對(duì)起始細(xì)胞進(jìn)行細(xì)分類，進(jìn)一步證實(shí)了是ncam陽性而非ncam陰性的胃上皮細(xì)胞在重編程的過程中發(fā)生了細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)起始細(xì)胞的精確定位。實(shí)施例2、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的表型鑒定及分化潛能內(nèi)胚層祖細(xì)胞被認(rèn)為是肝、胰、腸，胃、肺、甲狀腺等內(nèi)臟器官發(fā)育的起始，而且具有增殖能力，因此是獲取功能性肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腸細(xì)胞、肺和甲狀腺細(xì)胞的良好種子細(xì)胞。之前有多項(xiàng)以胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells)(escs)或誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells)(ipscs)為起始獲取內(nèi)胚層祖細(xì)胞的研究，為本實(shí)施例中鑒定重編程獲得的內(nèi)胚層祖細(xì)胞奠定了良好的基礎(chǔ)。在實(shí)施例1中我們使用bbrs和成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)的組合成功的在人胃上皮細(xì)胞(hgecs)中產(chǎn)生了內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞樣的克隆(hiendopcs)。然而這只是初步的形態(tài)改變，還要證實(shí)其內(nèi)胚層祖細(xì)胞屬性，使用pcr和免疫蛋白染色的方法鑒定誘導(dǎo)內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞(hiendopcs)特征性基因表達(dá)，基因芯片檢測(cè)其全基因組表達(dá)，甲基化芯片進(jìn)行表觀遺傳分析，還測(cè)試了其增殖特性，使用電鏡觀察其微觀特性，采用不同的誘導(dǎo)分化體系對(duì)其向肝臟、胰腺、腸道、肺和甲狀腺分化的潛能進(jìn)行了鑒定，來證實(shí)通過譜系重編程確實(shí)獲得了內(nèi)胚層祖細(xì)胞樣的細(xì)胞(hiendopcs)并且挖掘hiendopcs細(xì)胞的特有屬性。一、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)、人胃上皮細(xì)胞(hgecs)、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)、h9人胚胎干細(xì)胞(escs)購自wicell公司。(2)實(shí)驗(yàn)器材實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀(bio-rad)、普通pcr儀(eppendorf)、倒置相差顯微鏡(leica)、實(shí)時(shí)定量96孔板及封閉膜(bio-rad)、12孔板、激光共聚焦熒光顯微鏡(zeiss)、細(xì)胞免疫共聚焦小皿(nest)。(3)主要試劑抗體同實(shí)施例1第一部分、免疫組化試劑盒(vectorlab)、ra和ldn193189均購自sigma公司；a83-01購自stemgent公司；b-fgf、wnt3a、activina、fgf10購自r&d公司。(4)引物序列表5引物序列(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的特征性蛋白表達(dá)分析蛋白免疫熒光染色方法同實(shí)施例1。(2)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中特異性基因的表達(dá)分析提取重編程克隆的rna、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量pcr，具體方法包括以下步驟：1)、手動(dòng)挑取重編程產(chǎn)生的細(xì)胞克隆，盡量避免滋養(yǎng)層細(xì)胞的混入，然后用rna提取試劑盒(購自qiagen)將挑取的細(xì)胞按說明書的要求加入適量裂解液bufferrlt,充分裂解細(xì)胞，并繼續(xù)按下述步驟來提取rna：2)、加入等體積的70％(v/v)乙醇到裂解液里，用移液槍吹打混勻。3)、將混勻液包括沉淀加入到spincolumn(離心柱，購自qiagen)并置于2ml收集管中，12000rpm離心30s，棄掉濾液。4)、加入700μl的bufferrw1(rna提取試劑盒提供，購自qiagen)到spincolumn中，12000rpm離心30s，棄掉濾液。5)、加入500μlbufferrpe(rna提取試劑盒提供，購自qiagen)到spincolumn中，12000rpm離心30s，棄掉濾液。6)、加入500μlbufferrpe到spincolumn中，12000rpm離心2min，棄掉濾液，然后再空離1min。7)、將spincolumn移至新的1.5ml收集管中，加入30μlrneasy-freewater(無核糖核酸酶水)到spincolumn膜的中央，12000rpm離心1min，棄去spincolumn，收集管內(nèi)即為提取的rna溶液。8)、使用分光光度計(jì)測(cè)定洗脫的rna樣品濃度。9)、按1μg的rna總量吸取相應(yīng)體積的rna，并加入rna-freewater(無核糖核酸酶水)至16μl，65℃加熱5min，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰上冰浴2分鐘。10)、冰浴結(jié)束后加入4μlrna反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的5×rt反轉(zhuǎn)錄試劑，使用普通pcr儀反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃15分鐘，50℃5分鐘，98℃5分鐘，4℃終止。11)、按需求吸取反轉(zhuǎn)錄獲取的cdna、三蒸水、sybr，提前于96孔板中加入檢測(cè)引物，體系(具體為：cdna加水總共9μl，sybr10μl，引物1μl)配制完成后，封閉膜封閉孔板，放入實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀中，程序：95℃3分鐘，95℃10秒，60℃35秒，65℃5秒，95℃5秒，總共循環(huán)45次。(3)胚胎干細(xì)胞(escs)向定性內(nèi)胚層(de)定向誘導(dǎo)分化提前將生長狀態(tài)良好的人胚胎干細(xì)胞h9以適宜密度接種接種于matrigel膠包被的孔板里，次日更換培養(yǎng)基為de誘導(dǎo)培養(yǎng)基：advancedrpmi1640+1％(w/v)b27(無血清神經(jīng)細(xì)胞添加劑)+activina(激活素a，100ng/ml)+chir99021(3μm，購自stemgent)作用1天，第2天和第3天更換培養(yǎng)基為：advancedrpmi1640+1％b27+activina(100ng/ml)。(4)胚胎干細(xì)胞(escs)向原始消化管(pgt)定向誘導(dǎo)分化向定性內(nèi)胚層(de)誘導(dǎo)后將培養(yǎng)基更換為pgt誘導(dǎo)培養(yǎng)基：advanced(中文名稱：先進(jìn))rpmi1640+2％(v/v)fbs+50ng/mlfgf10(成纖維生長因子10)+cyclopamine(環(huán)巴胺，0.25μm)，作用3天即可得到pgt。(5)胚胎干細(xì)胞(escs)向前腸后段(pfg)定向誘導(dǎo)分化向定性內(nèi)胚層(de)誘導(dǎo)后將培養(yǎng)基更換為pfg誘導(dǎo)培養(yǎng)基：advancedrpmi1640+ra(維甲酸，2μm)+ldn193189(0.25μm，購自sigma)，作用3天即可得到pfg。(三)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均來自于三次及以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，除特殊說明外，數(shù)據(jù)均描述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用spss軟件進(jìn)行學(xué)生雙尾t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)兩組數(shù)據(jù)之間的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：(1)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的特征性蛋白表達(dá)分析對(duì)重編程后的克隆進(jìn)行內(nèi)胚層特異性蛋白的流式分析發(fā)現(xiàn)，hiendopcs均一性高表達(dá)foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)、sox9(性別決定區(qū)域y基因9)、sox17(性別決定區(qū)域y基因17)、lgr5(富含重復(fù)亮氨酸g蛋白偶聯(lián)受體5)、epcam(上皮細(xì)胞粘附分子)，如圖21所示(isotype為同種型)。對(duì)hiendopcs進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，如圖22所示，hiendopcs不再表達(dá)胃特異性的標(biāo)志muc6(黏膜蛋白-6)和gast(胃泌激素)，失去了胃的屬性，而開始明顯表達(dá)內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子foxa2(紅色熒光，表達(dá)量96±2.6％)、sox9(紅色熒光，表達(dá)量97±1.18％)和其它內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志如cxcr4(綠色熒光，表達(dá)量98±0.56％)、epcam(紅色熒光，表達(dá)量97±2.7％)、lgr5(綠色熒光，表達(dá)量92±4.3％)、ck19(綠色熒光，表達(dá)量91±4.2％)。流式水平的檢測(cè)與免疫蛋白染色相一致，更加印證了hiendopcs的內(nèi)胚層祖細(xì)胞特征。(2)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中特異性基因的表達(dá)分析轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果也顯示與起始細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)相比，內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中內(nèi)胚層早期發(fā)育相關(guān)的基因foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)、sox9(性別決定區(qū)域y基因9)、gata4(gata結(jié)合蛋白4)、hnf1b(肝細(xì)胞核因子同源框蛋白b)、pdx1(胰十二指腸同源異型盒基因1)、onecut2(一切除域蛋白家族2)、hoxa3(同源框蛋白a3)明顯上調(diào)，甚至與胚胎干細(xì)胞(escs)來源的內(nèi)胚層早期發(fā)育階段-定性內(nèi)胚層(de)、原始消化管(pgt)、前腸后段(pfg)中早期內(nèi)胚層基因的表達(dá)可比，尤其與pfg的表達(dá)模式最為相似(圖23的a幅，圖23a中柱群從左至右依序?yàn)閔ecs、de、pgt、pfg、hiendopcs,p1、hiendopcs,p4和hgecs)。而且hiendopcs不再表達(dá)胃特異性標(biāo)志muc6、pgc、gif和gast(圖23的b幅，圖23b中柱群從左至右依序?yàn)閔gecs、hiendopcs和人胃組織)。小結(jié)：起始細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)重編程后得到的誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)失去了胃特征性的標(biāo)志如muc6、gif、pgc、gast等，而開始高表達(dá)內(nèi)胚層早期祖細(xì)胞標(biāo)志性基因如轉(zhuǎn)錄因子foxa2、sox9、hnf1b、gata4、pdx1、hoxa3和其它內(nèi)胚層祖細(xì)胞的標(biāo)志如cxcr4、ck19、lgr5、epcam。轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平都顯示了hiendopcs的內(nèi)胚層祖細(xì)胞特征。然而，想要全面明確hiendopcs分子特性、發(fā)育階段特征和時(shí)空定位，還需對(duì)其進(jìn)行全基因表達(dá)或表觀遺傳表達(dá)譜的分析。二、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞表觀遺傳分析和發(fā)育階段定位材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)、人胃上皮細(xì)胞(hgecs)、十二指腸上皮細(xì)胞(hdecs)、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)、定性內(nèi)胚層(de)、原始消化管(pgt)、前腸后段(pfg)。(2)實(shí)驗(yàn)器材普通pcr儀(eppendorf)。(3)主要試劑illuminatotalprepkit(伊魯米娜完全預(yù)備試劑盒，ambion)、sentrixchiparray(圣翠科斯芯片陣列，humanht-12)、qiaampdnamicrokit(微量dna提取試劑盒，qiagen)、ezdnamethylation-goldkit(脫氧核糖核酸甲基化金試劑盒，zymoresearch)。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)hgecs、hiendopcs、pgt、pfg的rna提取、反轉(zhuǎn)錄方法同本實(shí)施例步驟一。(2)深度測(cè)序處理及分析(中科院北京基因組所協(xié)作完成)提取的hgecs、hiendopcs、pgt、pfgrna先擴(kuò)增，按照illuminatotalprep試劑盒提供的步驟從總rna中產(chǎn)生生物?；腸rna，然后使用sentrixchiparray對(duì)crna進(jìn)行雜交，雜交后的處理按照illumina公司提供的方法，使用illuminabeadstudio軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，原始數(shù)據(jù)上傳至geneexpressionomnibusdatabase(accessionnumbergse69706)。(3)dna甲基化處理及分析(中科院北京基因組所協(xié)作完成)首先進(jìn)行dna文庫構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，收集來自兩個(gè)不同標(biāo)本的hgecs和相應(yīng)的兩個(gè)hiendopcs單克隆，用qiaampdnamicrokit提取基因組dna，用ezdnamethylation-goldkit(zymoresearch，貨號(hào)d5005)進(jìn)行亞硫酸轉(zhuǎn)化，然后用高通量測(cè)序平臺(tái)hiseq2500(illumina)進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)提交至geneexpressionomnibusdatabase(accessionnumber：gse69706)。結(jié)果：(1)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的全基因組dna表觀遺傳分析步驟一對(duì)hiendopcs的鑒定局限在內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的某些特征性的標(biāo)記上，為了證實(shí)hiendopcs與hgecs確實(shí)是兩類不同的細(xì)胞，我們又使用全基因組dna甲基化芯片檢測(cè)來對(duì)hiendopcs與hgecs從表觀遺傳修飾角度進(jìn)行分析。聚類分析結(jié)果顯示hiendopcs與hgecs擁有不同的表觀模式(圖24的a幅)，明確證實(shí)了重編程后細(xì)胞發(fā)生了重大改變。geneontology(go)分析顯示，與hgecs相比，hiendopcs中低甲基化狀態(tài)的基因，也就是處于活躍狀態(tài)的基因分類主要與胚胎發(fā)育或干細(xì)胞發(fā)育相關(guān)(圖24的b幅)。這正與hiendopcs的內(nèi)胚層早期屬性和干/祖細(xì)胞屬性相一致。(2)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)中的特征性基因的啟動(dòng)子區(qū)表觀修飾甲基化分析顯示，與hgecs相比，在hiendopcs中啟動(dòng)子區(qū)域甲基化發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的基因分別有519和857個(gè)(圖25之a(chǎn))，其中內(nèi)胚層特異性的轉(zhuǎn)錄因子foxa2(叉頭編碼框蛋白a2)和gata4(gata結(jié)合蛋白4)的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平在hiendopcs中明顯降低(圖25之b)，說明foxa2和gata4的基因表達(dá)處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)，這與hiendopcs中foxa2和gata4基因高表達(dá)相一致。(3)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)的發(fā)育階段定位在從多個(gè)水平證實(shí)了hiendopcs的內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的特征后，還需要對(duì)hiendopcs所處的發(fā)育階段進(jìn)行定位以進(jìn)一步明確其特征。由于hiendopcs自然狀態(tài)下的陽性對(duì)照難以得到，因此以較為公認(rèn)的胚胎干細(xì)胞(escs)來源的按照發(fā)育過程誘導(dǎo)的定性內(nèi)胚層(de)、原始消化管(pgt)、前腸后段(pfg)等早期內(nèi)胚層階段作為陽性對(duì)照來與重編程獲得的hiendopcs進(jìn)行全基因組表達(dá)譜的比較，rna深度測(cè)序顯示hiendopcs處于pgt與pfg之間且更接近于pfg(圖26)。此外，pca主成分分析顯示胃上皮細(xì)胞來源的hiendopcs與十二指腸上皮細(xì)胞來源的hiendopcs在全基因表達(dá)譜上非常相似(pca主成分分析是指將多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法)，這與前面發(fā)現(xiàn)的它們?cè)诩?xì)胞形態(tài)上極其類似相一致，并且都與它們的起始細(xì)胞不同，也與escs來源的定性內(nèi)胚層(de)、滋養(yǎng)層細(xì)胞(gsemfs)明顯不同(圖27)。小結(jié)：全基因組dna甲基化水平分析進(jìn)一步證實(shí)了hgecs與hiendopcs明顯的不同，重編程后hiendopcs獲得了內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的分子特征，因此hgecs向hiendopcs的轉(zhuǎn)換確實(shí)是重編程的過程。而且rna深度測(cè)序明確了hiendopcs在發(fā)育階段上處于pgt和pfg之間更接近于pfg，因此實(shí)現(xiàn)了hiendopcs的時(shí)空定位。三、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的微觀特征材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)。(2)實(shí)驗(yàn)器材h7650transmissionelectronmicroscope(透射電鏡，hitachi)、h7650electronmicroscopy(電子顯微鏡)、amtxr16mccddigitalcamera(數(shù)碼相機(jī)電耦合器件，amt)、amtcaptureenginesoftwareversion600.259(捕獲工程軟件)、可拆卸96孔板(corning)。(3)主要試劑polybed812epoxyresin(多床環(huán)氧樹脂)購自polysciences,inc.,warrington,pa，reynolds’leadcitrate(雷若茲檸檬酸鉛，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家儀器分析測(cè)試中心提供)、aqueousuranylacetate(含水乙酸雙氧鈾，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家儀器分析測(cè)試中心提供)。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果具體方法包括以下步驟：1、hiendopcs和hgecs種植于可拆卸的96孔板中。2、pbs清洗，使用3％glutaraldehyde(戊二醛)與0.1msodiumcacodylate(二甲胂酸鈉，購自sigma)混合、ph7.4的固定液過夜(12-16小時(shí))固定細(xì)胞。3、用sodiumcacodylatebuffer(二甲胂酸鈉，購自sigma)清洗3次后，再用1％osmiumtetroxide(四氧化鋨，購自sigma)與0.1sodiumcacodylatebuffer(二甲胂酸鈉緩沖液，購自sigma)混合再固定1小時(shí)。4、去離子水清洗后，脫水再埋入polybed812epoxyresin(多床環(huán)氧樹脂)中。5、將組織切成70nm的切片，用4％aqueousuranylacetate(含水乙酸雙氧鈾)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家儀器分析測(cè)試中心提供，染色15分鐘再用reynolds’leadcitrate(雷若茲檸檬酸鉛，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國家儀器分析測(cè)試中心提供)染7分鐘。6、染色后的切片用h7650透射電鏡觀察。7、使用amtxr16mccd和amt600.259(捕獲工程軟件)進(jìn)行攝像。結(jié)果：如圖28所示(圖中，microvilli(微絨毛，mv)，terminalwebofactinmicrofilaments(肌動(dòng)蛋白微絲，am)，mitochondria(線粒體，mi)，vacuoles(液泡，v)，endoplasmicreticulum(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，er)，nucleus(核，n)，nucleolus(核仁，nu))，在對(duì)hgecs和hiendopcs進(jìn)行電鏡水平的觀察發(fā)現(xiàn)，hgecs呈現(xiàn)成熟細(xì)胞的特征包括細(xì)胞相對(duì)較大，細(xì)胞間緊密連接，核質(zhì)比較小，有許多的肌動(dòng)蛋白纖維網(wǎng)(圖28之a(chǎn)幅)，胞漿內(nèi)容物豐富，含有大量的線粒體，微絨毛和空泡(圖28之b幅)。而hiendopcs細(xì)胞更小，連接更為緊密，核仁明顯，核漿比更大(圖28之c幅)，胞漿內(nèi)容物較少，含線粒體較少，少量線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布于核膜的周圍(圖28之d幅)，并且細(xì)胞連接處具有不成熟細(xì)胞的指狀突起連接(圖28之e幅)。因此微觀水平的分析顯示，hiendopcs與hgecs明顯不同，hiendopcs呈現(xiàn)干細(xì)胞的微觀特征，而hgecs呈現(xiàn)終末分化成熟細(xì)胞的特征。小結(jié)：電鏡水平的分析進(jìn)一步證實(shí)了hiendopcs屬于干/祖細(xì)胞特征，而hgecs則具有成熟細(xì)胞的特征，hgecs向hiendopcs轉(zhuǎn)換是成熟細(xì)胞向干/祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。四、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的增殖和傳代擴(kuò)增特性材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞成人胃肌成纖維細(xì)胞(agsemfs)、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)。(2)實(shí)驗(yàn)器材倒置相差顯微鏡(leica)、mltraview(超視，perkinelmer)。(3)主要試劑fibronectin(fn，纖連蛋白)、cell-tak膠(ct)均購自bd；無血清細(xì)胞快速凍存液(bio-tool)；a83-01(stemgent)；bfgf(堿性成纖維生長因子b)、wnt3a均購自r&d；絲裂霉素-c(sigma)；advanceddmem/f12、dispase(離散酶)均購自gibco。(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)hiendopcs的傳代1、傳代前準(zhǔn)備：提前以合適密度在孔板中接種絲裂霉素c處理的agsemfs或提前約3個(gè)小時(shí)將fibronectin(fn)、cell-tak(ct)膠鋪于孔板中，室溫晾干。2、配制傳代培養(yǎng)基：advanceddmem/df12+awf(配方：a83-010.5μm+wnt3a50ng/ml+bfgf10ng/ml)或advanceddmem/df12+a(a83-01，0.5μm)。3、傳代時(shí)手動(dòng)挑取克隆，并將其劃成小塊，比例約1:3-4。將其置于fn+awf、ct+awf或feeder(滋養(yǎng)細(xì)胞)+a培養(yǎng)基中在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2)hiendopccs的凍存與復(fù)蘇1、凍存：用5mg/ml的dispase酶將手動(dòng)挑取的克隆在37℃消化5分鐘，并吹打成小塊，使用培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌2次，然后用適量的無血清細(xì)胞快速凍存液重懸細(xì)胞，置于凍存管中，直接放于-80℃保存。2、復(fù)蘇：將凍存的細(xì)胞42℃快速解凍，使用10倍體積的培養(yǎng)基洗滌，離心，然后用advanceddmem/df12+a(a83-010.5μm)的培養(yǎng)基重懸并接種于前述準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果：(1)hiendopcs在重編程過程中的增殖特征在證實(shí)了hiendopcs的內(nèi)胚層祖細(xì)胞的分子特征后，對(duì)其增殖特性進(jìn)行分析。仔細(xì)觀察hiendopcs在重編程過程中的動(dòng)力學(xué)特征，將其分為三個(gè)階段：第0-7天有些緊密的、邊緣銳利的是細(xì)胞克隆逐漸出現(xiàn)(phaseⅰ)；在7-10天克隆有一個(gè)緩慢增殖的過程(phaseⅱ)，克隆由小變大；在第10-15天是克隆迅速增殖的階段(phaseⅲ)，許多小的克隆迅速匯合成面積較大的克隆，在此階段細(xì)胞的倍增時(shí)間大概為36.1±4.7小時(shí)(參見圖29)。(2)hiendopcs的傳代培養(yǎng)條件篩選由于hiendopcs是內(nèi)胚層祖細(xì)胞，因此其必須具備一定的傳代擴(kuò)增潛能，發(fā)明人經(jīng)過對(duì)傳代條件的多次篩選，最終確定在以fibronectin(fn)膠或bdcell-tak(ct)膠作為細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合使用advanceddmem/df12+awf(a83-010.5μm+wnt3a50ng/ml+bfgf10ng/ml)的條件下也即fn+awf(圖30a)或ct+awf(圖30b)等無滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，克隆傳代后可以良好生長并維持原始克隆的狀態(tài)。在以agsemfs為滋養(yǎng)層，結(jié)合advanceddmem/df12+a(a83-010.5μm)也即feeder+a(圖30c)的條件下，也能維持原始的干/祖細(xì)胞克隆形態(tài)。hiendopcs也可進(jìn)行凍存，克隆復(fù)蘇后使用feeder+a的條件，同樣可維持原始克隆的形態(tài)(圖30d，post-thawedcells，凍存復(fù)蘇后)。(3)hiendopcs的傳代擴(kuò)增特性hiendopcs在前述的傳代培養(yǎng)條件下，大約可擴(kuò)增4-6代，傳代過程中細(xì)胞形態(tài)基本維持不變(圖31，下排圖片為上排圖片方框的放大)。傳到4代之后細(xì)胞增殖速度減慢，第6代細(xì)胞數(shù)量達(dá)到頂峰，說明其增殖潛力有限。以每次大約可獲取的106個(gè)人胃上皮細(xì)胞(hgecs)為起始，經(jīng)過重編程和大約4-6次的擴(kuò)增，可以獲得約109數(shù)量的干/祖細(xì)胞(hiendopcs)(圖32)。小結(jié)：使用相應(yīng)的傳代條件可以將hiendopcs進(jìn)行4-6代的擴(kuò)增。五、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞分化潛能鑒定材料與方法(一)實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人胃上皮細(xì)胞(hgecs)、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)、h9人胚胎干細(xì)胞(escs)購自wicell公司。(2)實(shí)驗(yàn)器材實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀(bio-rad)、普通pcr儀(eppendorf)、正置熒光顯微鏡(leica)、實(shí)時(shí)定量96孔板及封閉膜(bio-rad)、12孔板、激光共聚焦熒光顯微鏡(zeiss)、倒置相差顯微鏡(leica)、細(xì)胞免疫共聚焦小皿(nest)。(3)主要試劑1、主要抗體：表6用于內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)免疫熒光檢測(cè)的第一抗體表7用于內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)免疫熒光檢測(cè)的第一抗體2、主要培養(yǎng)基、添加物及基質(zhì)膠：advanceddmem/df12、mcdb131(低蛋白、無血清培養(yǎng)基131)、cmrl1066、advancedrpmi1640、glutamax(谷氨酰胺)、neaa(非必須氨基酸)、n2(無血清神經(jīng)細(xì)胞添加劑n2)、b27(無血清神經(jīng)細(xì)胞添加劑b27)均購自gibco；its-x(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺復(fù)合溶液，lifetechnologies)；t3、ascorbicacid(維生素c，sigma)；hm(肝細(xì)胞培養(yǎng)基，sciencell)；lanminin(層黏連蛋白)、fibronectin(纖連蛋白，fn)、collagenⅳ(4型膠原)購自bd。3、細(xì)胞因子：b-fgf(堿性成纖維細(xì)胞生長因子b)、wnt3a、activina(激活素a)、fgf4(成纖維生長因子4)、hgf(肝細(xì)胞生長因子)、osm(抑瘤素m)、fgf10(成纖維生長因子10)、fgf7(成纖維生長因子7)、egf(表皮生長因子)、noggin(頭蛋白)、bmp4(骨形態(tài)發(fā)生蛋白4、igf(胰島素樣生長因子)、tsh(促甲狀腺激素)、insulin(胰島素)購自r&d公司；nai(碘化鈉，sigma)。4、小分子化合物：dex(地塞米松)、ra(維甲酸)、ldn193189、sant-1均購自sigma；tpb購自emdmillipore；alk5inhibitorii購自enzolifesciences；gammasecretaseinhibitorxx(γ-分泌酶抑制劑xx)購自emdmillipore；r428購自selleckchem；chir99021購自stemgent。5、試劑盒：humanalbuminelisa試劑盒(人白蛋白檢測(cè)試劑盒，購自bethyl)。6、其它試劑：1mg/ml的icg(靛氰綠)溶液、蘇木素、periodicacid(過碘酸)、tritonx-100、schiff’s(聚乙二醇辛基苯基醚，sigma)、枸櫞酸鈉緩沖液、4％多聚甲醛。(4)引物序列表8引物序列(二)實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果(1)免疫熒光染色方法與前述相同。(2)q-pcr方法與前述相同。(3)向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具體方法包括以下步驟：1、將colleganⅳ/matrigel/laminin/km按照1:3:1:5的比例進(jìn)行混合，然后使用適量體積的膠混合液均勻涂抹于孔板中，置于室溫干燥3-5個(gè)小時(shí)。2、手動(dòng)挑取hiendopcs并劃成合適大小的塊接種于上述處理的培養(yǎng)板中，使用加入了8％(v/v)fbs及10umy27632的人胃上皮細(xì)胞(hgecs)重編程培養(yǎng)基(配方：advanced(先進(jìn))dmem/f12+2mm谷氨酰胺+青-鏈霉素+sb43154(2μm)+rg108(0.04μm)+bix01294(0.5μm)+bayk8644(2μm))培養(yǎng)過夜。3、待細(xì)胞團(tuán)塊充分貼壁后，用分階段法對(duì)hiendopcs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。第一階段：km(配方見實(shí)施例第一部分)+25ng/mlbmp4+25ng/mlfgf4+50ng/mlwnt3a培養(yǎng)3天；第二階段：hm(商品化培養(yǎng)基，購自sciencell)+20ng/mlhgf+10ng/mlosm+1μmdex培養(yǎng)10-15天。(4)向胰島β細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具體方法包括以下步驟：1、將matrigel/km按照1:1的比例進(jìn)行混合，然后使用適量體積的膠混合液均勻涂抹于孔板中，置于室溫干燥3-5個(gè)小時(shí)。細(xì)胞貼附方法與前述相同。2、將貼附的細(xì)胞按照4個(gè)階段向胰腺進(jìn)行誘導(dǎo)分化2.1mcdb131medium(購自gibco)+1.5g/lsodiumbicarbonate(碳酸氫鈉)+2mm(濃度)2mmglutamax(谷氨酰胺)+10mmfinalglucoseconcentration(葡萄糖)+2％bsa(牛血清白蛋白)+0.25mmascorbicacid(維生素c)+50ng/mloffgf7(成纖維生長因子7)+0.25μmsant-1+1μmretinoicacid(維甲酸)(ra)+100nmldn193189+1:200its-x(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺復(fù)合溶液)+200nmtpb，培養(yǎng)2天。2.2mcdb131medium+1.5g/lsodiumbicarbonate+2mmglutamax+10mmfinalglucoseconcentration+2％bsa+0.25mmascorbicacid+2ng/mloffgf7+0.25μmsant-1+0.1μmretinoicacid+200nmldn193189+1:200its-x+100nmtpb，培養(yǎng)2天。2.32天后第二階段細(xì)胞用5mg/mldispase(離散酶)在37℃消化5分鐘，然后機(jī)械性吹成小塊并轉(zhuǎn)移到低吸附孔板中更換培養(yǎng)基：mcdb131mediμm+1.5g/lsodiumbicarbonate+2mmglμtamax+20mmfinalglucoseconcentration+2％bsa+0.25μmsant-1+0.05μmretinoicacid+100nmldn193189+1:200its-x+1μmt3(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-乙醇胺復(fù)合溶液)+10μmalk5inhibitorii+10μmzincsulfate(硫酸鋅)+10μg/mlofheparin(肝素)，培養(yǎng)3天。2.4cmrl1066+2mmglutamax+2％bsa+100nmldn193189+1:200its-x+1μmt3+10μmalk5inhibitorii+10μmzincsμlfate+100nmgammasecretaseinhibitorxx(γ-分泌酶抑制劑xx)+2μmr428培養(yǎng)7天或更長。(5)向腸細(xì)胞的誘導(dǎo)分化具體方法包括以下步驟：1、rpmi1640medium+2mmglutama+100u/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素+500ng/mlfgf4(成纖維生長因子4)+500ng/mlwnt3a(wnt信號(hào)通路蛋白配體3a)+100ng/mlegf(表皮生長因子)+3μmchir99021(stemgent),培養(yǎng)3天。2、手動(dòng)挑取第一階段細(xì)胞并機(jī)械性吹成小塊然后埋入matrigel(人工基底膜)中，37℃、7-10分鐘，待膠凝固后加培養(yǎng)基:advanceddmed/f12+2mmglutamax+100u/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素+1％n2(無血清神經(jīng)細(xì)胞添加劑n2)+1％b27(無血清神經(jīng)細(xì)胞添加劑b27)+100ng/mlegf(表皮生長因子)+100ng/mlnoggin(頭蛋白)，培養(yǎng)1周以上。(6)向甲狀腺的誘導(dǎo)分化具體方法包括以下步驟：1、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+noggin(200ng/ml)+sb431542(10μm)作用3天。2、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+wnt3a(100ng/ml)+egf(20ng/ml)+bmp4(10ng/ml)+fgf10(10ng/ml)+fgf7(10ng/ml)+tsh(1μg/ml)作用3天。3、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+tsh(1μg/ml)+igf(50ng/ml)+insulin(5mg/ml)+nai(100μm)作用4天。(7)向肺的誘導(dǎo)分化具體方法包括以下步驟：1、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+noggin(200ng/ml)+sb431542(10μm)作用4天。2、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+wnt3a(100ng/ml)，egf(20ng/ml)+bmp4(10ng/ml)+fgf10(10ng/ml)+fgf7(10ng/ml)培養(yǎng)3天。3、advanceddmem/f12+l-glutamax+b27(1％)+n2(1％)+wnt3a(100ng/ml)+fgf10(10ng/ml)+fgf7(10ng/ml)+dexamethasone(地塞米松)(50nm)作用3天。(8)c肽含量的elisa檢測(cè)操作流程按照c-peptide(c肽)elisa試劑盒上的要求進(jìn)行，具體方法包括以下步驟：1、制備工作液：提前把試劑盒中的試劑按照說明分別稀釋成工作液，室溫平衡20分鐘。2、制備標(biāo)準(zhǔn)品：在5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品中每個(gè)都加入1ml的去離子水，充分混勻后分裝成小樣，-20℃冰箱保存。3、將標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測(cè)的細(xì)胞上清樣品加入已包被c-peptide抗體的96孔板中，每孔各25μl，每組樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。4、每孔加入緩沖液50μl。5、將96孔板置于微孔搖床上，800rpm室溫孵育1小時(shí)。6、棄去96孔板中液體，每孔再加入350μlwashbuffer(洗滌液)，繼而倒掉洗液，濾紙吸干，如此重復(fù)4-5次。7、每孔加入enzymeconjugatesolution(酶結(jié)合溶液)200μl。8、孔板置于微孔搖床上，800rpm室溫孵育1小時(shí)。9、棄掉液體，每孔加入350μlwashbuffer(洗滌液)，重復(fù)步驟6。10、每孔加入底物tmb(四甲基聯(lián)苯胺)200μl。11、孔板置于搖床，室溫避光孵育30分鐘。12、每孔加入50μlstopsolution(終止液)，避光，置于搖床震動(dòng)5秒。13、30分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀上450nm波長處測(cè)定od值，計(jì)算結(jié)果。(9)雙硫腙(dtz)染色具體方法包括以下步驟：1.將dtz貯存液(購自sigma)按1:20的比例進(jìn)行稀釋，然后用0.45μm濾膜過濾后配成工作液。2.用pbs洗滌待染色的細(xì)胞。3.將配制好的dtz工作液加入待染色細(xì)胞中，37℃孵育10min后顯微鏡下觀察并攝像。(10)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均來自于三次及以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，除特殊說明外，數(shù)據(jù)均描述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。兩組數(shù)據(jù)間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用spss軟件進(jìn)行學(xué)生雙尾t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)兩組之間的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：體內(nèi)內(nèi)胚層祖細(xì)胞最終發(fā)育形成胰腺、肝臟、腸、肺和甲狀腺等器官。為了證實(shí)hiendopcs是內(nèi)胚層祖細(xì)胞，本發(fā)明對(duì)其測(cè)試了向多個(gè)方向誘導(dǎo)分化的潛能。(1)內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)向胰腺的誘導(dǎo)分化根據(jù)經(jīng)典的胰腺誘導(dǎo)分化方案[pagliucafeliciaw,millmanjeffreyr,gürtlerm,segelm,vandervorta,ryujenniferh,etal.generationoffunctionalhumanpancreaticβcellsinvitro.cell.2014；159:428-39.rezaniaa,bruinje,arorap,rubina,batushanskyi,asadia,etal.reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells.natbiotechnol.2014；32:1121-33.]將hiendopcs向胰腺進(jìn)行誘導(dǎo)分化。在誘導(dǎo)2周后，hiendopcs來源的胰腺細(xì)胞(hiendopc-pans)呈現(xiàn)體內(nèi)胰島三維的出芽生長形態(tài)(圖33a)。dtz(雙硫腙)染色顯示hiendopc-pans呈現(xiàn)紅色，表明細(xì)胞胞漿中含有鋅離子，這是胰島β細(xì)胞的特征(圖33b)。對(duì)hiendopc-pans進(jìn)行胰腺特異性蛋白染色顯示胰腺特異性轉(zhuǎn)錄因子pdx1和nkx6.1、胰島α細(xì)胞標(biāo)志gcg、胰島β細(xì)胞標(biāo)志c-pep和pro-ins以及胰島δ細(xì)胞的標(biāo)志sst都有明顯表達(dá)(圖33c和d)。轉(zhuǎn)錄水平的分析顯示多種胰腺特征性基因在誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)(圖33e)，這與免疫染色結(jié)果相一致。為了證實(shí)hiendopcs-pans是否具有胰島β細(xì)胞最重要的合成和釋放胰島素的能力，檢測(cè)了hiendopcs-pans在多種刺激條件下的c肽釋放能力。當(dāng)使用高糖刺激時(shí)，與低糖組相比，c肽的釋放明顯增多。當(dāng)使用其他的胰島素分泌促進(jìn)劑kcl、tolbμtamiden作用時(shí)，c肽的釋放也明顯增多。而且hiendopcs-pans對(duì)刺激的胰島素釋放反應(yīng)可與escs來源的胰島細(xì)胞相當(dāng)(圖33f)。hiendopcs-pans的糖刺激反應(yīng)性對(duì)于以后的糖尿病高血糖的治療具有十分重要的臨床應(yīng)用意義。(2)hiendopcs向腸道細(xì)胞的誘導(dǎo)分化根據(jù)經(jīng)典的腸細(xì)胞誘導(dǎo)方案[spencejr,mayhewcn,rankinsa,kuharmf,vallanceje,tollek,etal.directeddifferentiationofhumanpluripotentstemcellsintointestinaltissueinvitro.nature.2010；470:105-9.watsoncl,mahemm,múneraj,howelljc,sundaramn,polinghm,etal.aninvivomodelofhumansmallintestineusingpluripotentstemcells.naturemedicine.2014；20:1310-4.]對(duì)hiendopcs向腸道分化進(jìn)行檢測(cè)。誘導(dǎo)2周后發(fā)現(xiàn)hiendopcs來源的腸道類器官(hiendopc-ints)呈現(xiàn)體外腸道原代培養(yǎng)的形態(tài)特征(圖34a)。hiendopc-ints中腸特異性轉(zhuǎn)錄因子cdx2、小腸細(xì)胞標(biāo)志vil1、杯狀細(xì)胞標(biāo)志muc2、小腸內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志chga、小腸潘氏細(xì)胞標(biāo)志lyso在誘導(dǎo)之后表達(dá)明顯上調(diào)(圖34b)。而且在蛋白水平，腸特征性的標(biāo)志vill、muc2、cdx2、lgr5、ecad也都有明顯的表達(dá)(圖35c)，證實(shí)了hiendopc-ints已經(jīng)初步具備了腸的特征。(3)hiendopcs向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化采用經(jīng)典的肝向誘導(dǎo)方案[gouon-evansv,boussemartl,gadμep,nierhoffd,koehlerci,kuboa,etal.bmp-4isrequiredforhepaticspecificationofmouseembryonicstemcell-deriveddefinitiveendoderm.natbiotechnol.2006；24:1402-11.]將hiendopcs向肝細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)hiendopcs來源的肝細(xì)胞(hiendopc-heps)開始表達(dá)原代肝細(xì)胞特征性的多種功能基因包括hnf4a、cebpa、cebpb、tf、aatggt、g6pc、cyp1a1、cyp3a4、cyp3a7、μgt1a1、μgt1a3等(圖35a)。同時(shí)hiendopc-heps中afp(甲胎蛋白)、ck18(細(xì)胞角質(zhì)蛋白18)的染色陽性(圖35b)；在流式水平alb(白蛋白)陽性的細(xì)胞比例高達(dá)90％以上(圖35c)，表明hiendopc-heps初步具備了肝細(xì)胞的特征。(4)hiendopcs向甲狀腺和肺的誘導(dǎo)分化hiendopcs向甲狀腺進(jìn)行誘導(dǎo)分化[longmireta,ikonomoul,hawkinsf,christodoulouc,caoy,jeanjc,etal.efficientderivationofpμrifiedlungandthyroidprogenitorsfromembryonicstemcells.cellstemcell.2012；10:398-411.]后，hiendopcs來源的甲狀腺細(xì)胞(hiendopcs-thyroid)中甲狀腺和肺共有的特異性轉(zhuǎn)錄因子nkx2.1、甲狀腺特異性轉(zhuǎn)錄因子pax8、甲狀腺球蛋白(tg)、促甲狀腺激素受體(tshr)表達(dá)水平比誘導(dǎo)前有非常明顯的提升(圖36a)。而hiendopcs來源的肺細(xì)胞(hiendopcs-lμng)中肺特異性轉(zhuǎn)錄因子nkx2.1、肺clare細(xì)胞標(biāo)志cc-10、一型肺泡細(xì)胞的標(biāo)志水通道蛋白aqp5、二型肺泡細(xì)胞的標(biāo)志表面活性蛋白spa、spb、spc等表達(dá)明顯上調(diào)(圖36b)。采用能夠促進(jìn)向胰腺、肝臟、腸道、甲狀腺和肺的誘導(dǎo)分化策略，對(duì)hiendopcs的內(nèi)胚層分化潛能做鑒定，結(jié)果表明hiendopcs向5個(gè)方向分化后，相關(guān)的基因表達(dá)，蛋白表達(dá)明顯提高，部分功能也已顯現(xiàn)，更加明確的證實(shí)了hiendopcs是內(nèi)胚層祖細(xì)胞，同時(shí)提示了hiendopcs對(duì)于糖尿病、肝病和腸道疾病等的細(xì)胞治療可以提供理想的種子細(xì)胞。實(shí)施例3、可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的小分子化合物組合小分子組合4m中單個(gè)小分子濃度改變對(duì)誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞產(chǎn)生的影響：前述已說明在四個(gè)小分子化合物bbrs小分子組合中，在sb43152(sb，2μm)，rg108(rg，0.04μm)，bix01294(bix，0.5μm)，bayk8644(bay，2μm)4個(gè)小分子使用濃度下，可以重編程獲得內(nèi)胚層祖細(xì)胞(hiendopcs)，效率4-6％。本實(shí)施例用相同的方法對(duì)所述4個(gè)小分子化合物在不同濃度范圍sb43152(1～10μm)，rg108(0.01～1μm)，bix01294(0.1～2μm)，bayk8644(1～4μm)下對(duì)hiendopcs的產(chǎn)生情況進(jìn)行了驗(yàn)證(參見表9)，同時(shí)用a83-01(a83,0.4～1μm)替換sb后再與其他三個(gè)小分子在不同濃度組合rg108(0.01～1μm)，bix01294(0.1～2μm)，bayk8644(1～4μm)下對(duì)hiendopcs的產(chǎn)生情況進(jìn)行了驗(yàn)證(表10)。表9：不同使用濃度bbrs小分子組合及其重編程獲得hiendopcs效率表10：不同使用濃度bbra小分子組合及其重編程獲得hiendopcs效率參照實(shí)施例2的方法對(duì)表9和表10組合中所獲得的內(nèi)胚層祖細(xì)胞做了內(nèi)胚層相關(guān)的基因、蛋白、表觀修飾檢測(cè)及分化功能鑒定，結(jié)果顯示：以上組合獲得的誘導(dǎo)內(nèi)胚層均能高表達(dá)內(nèi)胚層祖細(xì)胞特征的標(biāo)志foxa2、sox9、gata4、hnf1b、hoxa3、pdx1、cxcr4、epcam、ck19和lgr5，不表達(dá)胃細(xì)胞特征性的標(biāo)志muc6、gast。其具有內(nèi)胚層祖細(xì)胞特征的表觀修飾特點(diǎn)，在向肝細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化后能夠表達(dá)肝細(xì)胞特異性的標(biāo)志afp、alb、hnf4a、ck18、cyp3a4等；在向胰腺β細(xì)胞分化后開始表達(dá)nkx6.1、pdx1、gcg、sst、ins等胰腺特異性標(biāo)記，并且在刺激的條件下能夠釋放胰島素；在向腸細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化后表達(dá)cdx2、muc2、vil1、chga和lyso等腸特異性標(biāo)志；在向肺和甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行分化后分別表達(dá)各自細(xì)胞特異性的標(biāo)志。證實(shí)了表9-表10小分子在所列濃度范圍內(nèi)同樣可以獲得內(nèi)胚層祖細(xì)胞。實(shí)施例4、制備可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的重編程試劑盒本發(fā)明可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的重編程試劑盒，包括可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的小分子化合物組合，具體來講，小分子化合物組合由8個(gè)(8m)小分子化合物組成，分別為：fbp(二磷酸果糖)、bayk8644、bix01294、sb431542或a83-01、valproicacid(vpa)(丙戊酸)、rg108、pd0325901和ps48。優(yōu)選的可將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的小分子化合物組合包括以下4個(gè)小分子化合物，其中bbrs組合為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和sb431542(sb)，bbra組合為bix01294(bix)、bayk8644(bay)、rg108(rg)和a83-01(a83)。試劑盒中，各化合物可分別包裝，或按8m組合或bbrs組合或bbra組合將各化合物混合后包裝；化合物分別包裝時(shí)，試劑盒中的說明書中記載各化合物的使用濃度，具體濃度數(shù)值可參見實(shí)施例1和實(shí)施例3。試劑盒中還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基advanceddmem/f12和細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)添加成分谷氨酰胺(glutamax)和抗生素sp，及其使用說明，其中相對(duì)advanceddmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，谷氨酰胺的使用濃度為2mm(1×)，抗生素(如青-鏈霉素)使用濃度為100u/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素，各成分分別包裝或按所列使用濃度混合后包裝。試劑盒還可將所述小分子化合物組合與所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)添加成分組合形成重編程培養(yǎng)基，重編程培養(yǎng)基的配方為：advanceddmem/f12+2mm谷氨酰胺(glutamax)+青-鏈霉素(100u/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素)+sb43154(2μm)或a83-01(0.5μm)+vpa(0.5mm)+pd0325901(0.5μm)+rg108(0.04μm)+bix01294(0.5μm)+bayk8644(2μm)+ps48(5μm)+fbp(3.5mm)。優(yōu)選的重編程培養(yǎng)基配方為：advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，1～10μm的sb43152，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；更優(yōu)選advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，2μm的sb43152，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644。另一優(yōu)選重編程培養(yǎng)基配方為：advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，0.4～1μm的a83-01，0.01～1μm的rg108，0.1～2μm的bix01294，1～4μm的bayk8644；更優(yōu)選advanceddmem/f12中含2mm谷氨酰胺(glutamax)，青-鏈霉素(100u/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素)，0.5μm的a83-01，0.04μm的rg108，0.5m的bix01294，2μm的bayk8644。試劑盒中，還可包括滋養(yǎng)層細(xì)胞及其使用說明，所述滋養(yǎng)層細(xì)胞為消化道來源的基質(zhì)細(xì)胞，如胃肌成纖維細(xì)胞或小腸肌成纖維細(xì)胞。試劑盒中所有細(xì)胞、化合物和試劑均可按前述實(shí)施例提示的來源商購獲得。試劑盒中還包括使用說明書，說明書中記載試劑盒的實(shí)際組成及使用方法，其中包括使用相關(guān)試劑將消化道來源上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層干/祖細(xì)胞的重編程方法，該方法內(nèi)容參考實(shí)施例中的描述。當(dāng)前第1頁12