專利名稱：一個新聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及通過植化提取分離手段從五味子屬藥用植物鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Baill.的根和莖中分離出一個新的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素、制備方法以及該化合物在制備治療和/或預防腫瘤藥物中的應用。
背景技術(shù)：
五味子科植物主要含有木脂素和三萜等成分，其中木脂素是五味子科植物主要的生物活性成分，而聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素是五味子科的特征性化學成分，骨架獨特，立體化學復雜。近年來，人們通過研究發(fā)現(xiàn)，木脂素除了具有人們熟知的保肝降酶，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)等作用外，還有抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、抗HIV等等。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有文獻報道聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素具有治療腫瘤的作用。鐵箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]是五味子科五味子屬植物，木質(zhì)藤本，是我國特有的藥用植物，在我國分布廣泛(甘，陜，豫，鄂，滇，川，黔，桂等地均有分布)，資源豐富，在民間用來治療風濕麻木，神經(jīng)衰弱，跌打損傷，風濕骨痛，月經(jīng)不調(diào)，外傷出血，瘡癤腫痛，胃痛及脈管炎等疾病。本實驗室在研究鐵箍散的木脂素類化合物的過程中，分離并鑒定了一個新的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素，經(jīng)體外試驗表明該化合物具有顯著的治療癌癥的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以藥用植物箍散[Schisandra propinqua(Wall.)Baill.]的根和莖為原料提取分離的具有治療或預防腫瘤的活性的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素類化合物。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟以藥用植物鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Baill.的根和莖為原料，經(jīng)95％乙醇回流提取，用蒸餾水混懸提取物，分層得到水不溶部分，之后，利用包括硅膠吸附柱層析、SephardexLH-20柱層析、反向C-18低壓柱層析等分離手段得到式1化合物。流程詳見圖1。
式I結(jié)構(gòu)鑒定主要利用光譜，包括HRSI-MS，紫外，紅外，質(zhì)譜，核磁共振譜(1HNMR，13CNMR，2D-NMR)鑒定其結(jié)構(gòu)。
化合物I為無色針晶，熔點91～92℃。
紫外光譜(見圖3)中的吸收峰222，255，288表明該化合物為聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素紅外光譜(見圖2)顯示羥基的特征吸收(3487cm-1)和酯基的特征吸收(1740cm-1)高分辨質(zhì)譜中(見圖4)有很強的[M-C6H12O2]+和M-C6H12O2-C7H6O2]+峰，提示己酸酯和苯甲酸酯取代基結(jié)構(gòu)的存在。
通過2D-NMR技術(shù)，尤其是HMQC和HMBC譜，解決了取代基的位置，結(jié)合高分辨質(zhì)譜，對全部氫信號進行了確切的歸屬。
化合物I的1H譜中，兩個單峰信號(δ6.71，6.79，1H each，s)是4位和11位質(zhì)子的信號。四個單峰(δ3.93，3.97，3.32，3.22，3Heach，s)為甲氧基信號。五個芳質(zhì)子信號δ7.30(2H，t，J＝8)，740(1H，d，J＝8)，7.47(2H，t，J＝8)以及13C譜中的(δ164.88，δ129.14，δ129.54，δ128.18，δ133.28)確證了該化合物的苯甲酸酯結(jié)構(gòu)。烷烴質(zhì)子信號1.81(2H，m)，1.18(6H，m)，0.84(3H，s，J＝7.2)以及13C譜中的(171.65，33.47，24.08，31.07，22.24，13.82)確證了該化合物具有己酸酯取代基。(見表1、圖5、6)化合物I的HMQC(1H-dettected heteromuclear multiple-quantum coherence)譜(見圖8)揭示了芳香質(zhì)子(δH 6.71→δc 107.82，δH 5.97→δc 85.14)，甲氧基質(zhì)子(δH 3.93→δc60.84，δH 3.97→δc 59.77，δH 3.32→δc 59.74，δH 3.22→δc 55.94，)，甲基質(zhì)子(δH 1.33→δc 17.25，δH 1.38→δc 28.82)等與其直接相連的碳質(zhì)子具有明顯的相關信號。
另外HMBC(1H-detected heteronuclear multiple-bond coherence)譜(見圖7)揭示了甲氧基質(zhì)子，進一步證實了化合物結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)取代，芳香質(zhì)子與其鄰近的碳質(zhì)子均有明顯的相關信號，δ6.71(H-4)分別與δ135.28(C-2)，150.56(C-3)，85.14(C-6)，115.99(C-16)相關，δ6.79(H-11)分別與δ149.38(C-12)，138.74(C-13)，83.37(C-9)，118.89(C-15)相關，6位和9位質(zhì)子與其鄰近的碳質(zhì)子的相關信號證實了己酸酯基和苯甲酸酯基的取代位置，δ5.97(H-6)分別與δ107.82(C-4)，129.83(C-5)，74.20(C-7)，42.98(C-8)，115.99(C-16)，28.82(C-18)，164.88(C＝0 ofBen)，δ5.78(H-9)分別與δ42.98(C-8)，74.20(C-7)，135.62(C-10)，109.83(C-11)，118.89(C-15)，17.15(C-17)，171.65(C＝0 of Cap)相關。
通過上述解析，推定化合物I為1，12-二羥基-2，3，13，14-四甲氧基-6-己酸酯基-7-羥基-8-甲基-9-苯甲酸酯基-聯(lián)苯環(huán)辛二烯木脂素，結(jié)構(gòu)如式I。
表1化合物I的1H，13C-NMR的化學位移值(溶劑為CDCl3)



圖1式I化合物的制備流程。
圖2式I化合物的紅外光譜圖3式I化合物的紫外光譜圖4式I化合物的高分辨質(zhì)譜圖5式I化合物的氫譜圖6式I化合物的碳譜圖7式I化合物的HMBC譜圖8式I化合物的HMQC譜本發(fā)明還涉及含有式I的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素作為活性成分的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，含有生理有效量的式I聯(lián)苯環(huán)辛烯類化合物和/或藥物可接受的載體，所說的聯(lián)苯環(huán)辛烯類化合物在組合物的重量比為0.1-99.9％，藥物可接受的載體在組合物中的重量比為0.1-99.9％。本發(fā)明的藥物組合物以適合藥用的制劑形式存在，這些制劑形式是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊劑、口服液、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。
本發(fā)明進一步涉及式I所述的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素在制備治療和/或預防腫瘤藥物中的應用。細胞毒性試驗采用人肝癌細胞株(HepG2)、人急性早幼粒白血病細胞株(HL-60)和人口腔鱗癌細胞株(KB)，結(jié)果表明式I化合物對實體瘤和血液瘤均有良好的殺傷作用。
具體實施方案下面所列實施例有助于本領域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1式I化合物的制備以鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Baill.干燥根和莖30Kg為原料，用95％乙醇回流提取三次，每次2小時，濃縮至浸膏狀，以適量蒸餾水混懸，靜置過夜，分層得到水不溶部分A和水溶部分B。水不溶部分用適量乙醇溶解后拌以粗硅膠(100目)，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮洗脫后濃縮至浸膏。將乙酸乙酯部分浸膏(42g)經(jīng)硅膠(200-300目)柱色譜分離，依次用石油醚至石油醚-丙酮(1∶2)不同比例的溶液梯度洗脫得到15個餾分，餾分11經(jīng)Sephadex LH-20色譜柱分離，以氯仿∶甲醇(1∶1)為洗脫劑，得到12個餾分。其中5-7合并(約1.9g)利用反相硅膠柱(RP-18)分離，以65％甲醇梯度洗脫得到38個餾分，合并fr6-11得到式1化合物。
實施例3式I化合物的體外抑制腫瘤試驗1.材料人急性早幼粒白血病細胞株(HL-60)、人肝癌細胞株(HepG2)、人口腔鱗癌細胞株(KB)購自美國ATCC。培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購自Gibico公司。MTT(3-(4，5-Dimethyiazol-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)，購自Sigma公司。
2.腫瘤細胞培養(yǎng)HL-60、HepG2和KB細胞分別培養(yǎng)在含10％FBS的DMEM(含100u/mlPemcillin以及100ug/ml的Streptomycin)培養(yǎng)基中，收集生長良好并取處于對數(shù)生長期的細胞用培養(yǎng)基配成密度為1×105個細胞/ml的細胞懸液，均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul(即每孔細胞個數(shù)為104個)，在5％CO2，95％空氣，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，待細胞完全貼壁后，給藥組用不同濃度的式I化合物處理，化合物終濃度分別為50ug/ml，40ug/ml，30ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，1ug/ml。同時設對照組和空白組，每組6個復孔，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48hr后，加入10μl的10mg/ml-1MTT使終濃度為0.05％，孵育4hr后，離心棄去上清液培養(yǎng)基，加入100μlDMSO，在酶標儀上振蕩60s后，于595nm測定吸光度值。
3.式I化合物對腫瘤細胞的抑制率計算根據(jù)測得的吸光度值進行細胞的存活率計算，各測試孔的OD值減去空白組OD值(完全培養(yǎng)基加MTT，無細胞)，各重復孔的OD值取均數(shù)。細胞的存活率以T/C％表示，T為加藥組細胞的OD值，C為對照組細胞的OD值?；衔飳δ[瘤細胞的抑制率以(1-T/C)％表示。
4.實驗結(jié)果式I化合物體外對三種腫瘤細胞株的IC50值

實驗結(jié)果表明式I化合物對血液瘤和實體瘤具有顯著的抑制作用。
實施例3片劑的制備式I化合物 20g乳糖 80g硬脂酸鎂 1.0％
3％聚維酮乙醇溶液 適量共制成1000粒取處方量化合物1與處方量乳糖混合均勻，加3％聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，50℃干燥30-45分鐘，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片。每片含化合物20mg。
實施例4膠囊劑的制備式I化合物 20g乳糖 80g硬脂酸鎂 1.0％3％聚維酮乙醇溶液 適量共制成1000粒取處方量式I化合物與處方量乳糖混合均勻，加3％聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，50℃干燥30-45分鐘，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，充于1號膠囊。每粒含化合物20mg。
權(quán)利要求
1.一種新聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素，結(jié)構(gòu)如式I。 式I
2.權(quán)利要求1所述的新聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素的制備方法，包括以下步驟以藥用植物鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Baill.的根和莖為原料，經(jīng)95％乙醇回流提取，用蒸餾水混懸提取物，分層得到水不溶部分，之后，利用包括硅膠吸附柱層析、Sephardex LH-20柱層析、反向C-18低壓柱層析等分離手段得到式1化合物。
3.含有權(quán)利要求1所述的新聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素作為活性成分的藥物組合物。
4.權(quán)利要求1所述的新聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素在制備治療和/或預防腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從五味子科藥用植物鐵箍散Schisandra propinqua(Wall.)Baill.的根和莖中分離得到的一個新的聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素、制備方法和用途。體外抗腫瘤實驗證明，該化合物具有顯著的抗腫瘤作用。
文檔編號C07C69/78GK1634854SQ20041009677
公開日2005年7月6日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月8日
發(fā)明者肖培根, 陳士林, 陳四保, 許利嘉, 黃峰 申請人:肖培根, 陳士林