大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540、引物及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TCR540與CRb基因共分離，可用于蕓薹種包括結(jié)球白菜和青梗菜抗根腫病基因的分子標(biāo)記輔助選擇。在輔助選擇過程中同時(shí)使用這些標(biāo)記，選擇理論準(zhǔn)確度可達(dá)到100％，并且該標(biāo)記重復(fù)性好，可靠性高，檢測成本低，省時(shí)省力。
【專利說明】
大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)巧TCR540、引物及 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子 標(biāo)記TCR540、引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2002年，本課題組獲得了1份抗蕓臺根腫病的大白菜雙單倍體系'CR化inki DH' 系，研究表明該抗病材料抗蕓臺根腫菌生理小種2、4和8 (Piao等，Conver si on of A化P marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker.2002，J Kor Soc 化的Sci 43:653-665)。進(jìn)一步研究證明抗根腫病基因?yàn)轱@性單基因，并命名為CRb(Piao 等，SCAR and CAPS mapping of CRb, a gene conferring resistance to PI曰smodiophor曰 br曰ssic曰e in Chinese c曰bb曰ge(Br曰ssic曰 r曰p曰 ssp.pekinensis)， Theor Appl Genet,2004,108:1458-1465)。
[0003] 在蕓臺種抗根腫病品種轉(zhuǎn)育過程中，每代都需要采用田間接種根腫病菌的方法鑒 定中間材料的基因型，而且環(huán)境條件會影響到正確中間材料的選擇，運(yùn)樣勢必影響轉(zhuǎn)育進(jìn) 程，因此抗病品種轉(zhuǎn)育難的問題還沒有徹底解決。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(MAS)可能是最終 解決運(yùn)一問題的有效途徑。
[0004] 目前，國內(nèi)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)樸鐘云課題組獲得了與蕓臺種抗根腫病基因 CRb連鎖的 標(biāo)記（2004,2014)，包括TCR01，TCR05和TCR09,見（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，W及1'〔1?108、1'〔1?30、1'〔1?74、1'〔1?79，見口11日]1邑 等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding, 134:1173-1183)。但運(yùn)些標(biāo)記并不 是與C肺共分離的標(biāo)記，利用運(yùn)些標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選育時(shí)容易造成連鎖累寶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540、引 物及應(yīng)用，利用該分子標(biāo)記可對待測植株進(jìn)行苗期鑒定，從而減少連鎖累寶，簡化大白菜抗 根腫病品種的轉(zhuǎn)育程序。
[0006] 本發(fā)明提供了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540,所述大白 菜抗根腫病C肺基因的共分離分子標(biāo)記TCR540的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示，為：
[0007] 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTAT TGGAACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCA TATTT-3'。
[000引本發(fā)明還提供了一種上述大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540的 PCR特異性擴(kuò)增引物，包括：
[0009] F TCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'
[0010] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種大白菜抗根腫病C肺基因的共分離分子標(biāo)記TCR540,在分子 標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540,在大白 菜抗根腫病分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種上述大白菜抗根腫病C肺基因的共分離分子標(biāo)記TCR540的應(yīng) 用方法，具體包括：
[0014] (1)用CTAB方法提取待巧耐料的基因組DNA [00 巧](2)PCR 擴(kuò)增
[0016] a.反應(yīng)體系：10化體系，各組分物質(zhì)的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · L-1引物； 1.0mmol.L-idNTP;1.0uL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；d地2〇補(bǔ)齊lOyL，混勻，離 屯、，
[0017] 其中引物的序列為F TCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'，
[0018] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '；
[0019]6.擴(kuò)增程序：94°(：預(yù)變性5111111;94°(：變性3〇3;60°(：退火453;72°(：延伸3〇3;35個(gè)循 環(huán)后；72°C延伸lOmin;最后4°C保存；
[0020] C.電泳:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序 電泳儀上進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，70W條件下電泳1.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀 染，并觀察擴(kuò)增結(jié)果；
[0021] d.判斷:擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測到148bp和大于148bp兩條帶，則待測材料中含 有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100%。
[0022] 本發(fā)明提供的一種大白菜抗根腫病C肺基因的共分離分子標(biāo)記TCR540,與蕓臺種 抗根腫病基因 C^b共分離，可廣泛應(yīng)用于蕓臺種抗根腫病基因(^b的分子標(biāo)記輔助選擇育 種。本發(fā)明通過特異引物PCR擴(kuò)增可對待測植株進(jìn)行苗期鑒定，大大提高育種效率，縮短育 種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0023] 圖1為TCR540和TCR541在抗病材料'CRBJN3-2'、感病材料'BJN3-2' W及重組體中 的擴(kuò)增結(jié)果；
[0024] 其中，圖1A為TCR540在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2 '（ S泳道） W及重組體（1-44號泳道）中的擴(kuò)增結(jié)果，圖1B為TCR5"在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感 病材料'BJN3-2 '（S泳道)W及重組體(1-44號泳道)中的擴(kuò)增結(jié)果；
[0025] 圖2為TCR540的引物在大白菜抗病材料和感病材料當(dāng)中擴(kuò)增出來的序列對比圖；
[0026] 圖3為大白菜抗根腫病CRb基因的遺傳連鎖圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù) 范圍并不受【具體實(shí)施方式】的限制。
[00%] -、大白菜抗根腫病C肺基因的共分離分子標(biāo)記TCR540和TCR541的獲得
[0029] 1、分離群體的構(gòu)建
[0030] W含抗根腫病基因 CRb的大白菜品系' CRBJN3-2 '為父本，易感染根腫病的大白菜 品系' B JN3-2 '為母本雜交獲得Fi，所獲Fi代植株全部表現(xiàn)為抗病。W上兩個(gè)親本' CRBJN3-2 ' 和'BJN3-2'均保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)。選擇單株Fi自交構(gòu)建F2代作圖群體，群體數(shù)為4783個(gè)。 播種的全部4783個(gè)F2群體，種植10天后接種根腫菌。40天后進(jìn)行抗病性鑒定，4783個(gè)F2群體 中3641個(gè)抗病，1142個(gè)感病，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3:1的分離比二3.16 <二3.84)。
[0031] 2、CTAB 法提取 DNA
[0032] 1)、在1.5ml離屯、管中加入498uL 1 X CTAB提取液W及2uU3-琉基乙醇，搖勻，其中1 X CTAB提取液包含2% 的CTAB，lOOmmol/L的Tris-肥1，20mmol/L的抓TA和 1.4mol/L的化C1， 其中2%的CTAB指的質(zhì)量濃度為2%(w/v);
[0033] 2)、取0.2g幼嫩葉片，在液氮條件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-琉基 乙醇的離屯、管中，搖勻；
[0034] 3)、隨后將離屯、管放入65°C水浴中，每隔5分鐘搖一次，水浴30min;
[0035] 4)、取出離屯、管，加入等體積的氯仿:異戊醇混合物(24:l，v/v)，搖晃lOmin后，常 溫下120001·/min 離屯、lOmin;
[0036] 5)、將上清液轉(zhuǎn)移到另一離屯、管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1，v/v)，搖晃 lOmin 后，常溫下 120001·/min 離屯、lOmin;
[0037] 6)、將上清液移至另一離屯、管當(dāng)中，加入2倍體積事先預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，將 抱團(tuán)的DNA挑入到裝有400ULTE緩沖液的離屯、管中溶解；
[003引 7)、加入 1.加 LRNaseA(lOugAiL)，混勻后 37Γ 保存 30min;
[0039] 8)、重復(fù)步驟5);
[0040] 9)、將上清液轉(zhuǎn)移到另一離屯、管中，向離屯、管中加入50uL 3mol/LNaAC溶液和預(yù)冷 的等體積的異丙醇，-20 °C沉淀20min;
[0041 ] 10)、4°C條件下12000r/m離屯、lOmin，棄掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次；
[0042] 11)、在超凈工作臺上風(fēng)干DNA，加入50化TE (Tri S-抓TA)溶解DNA，-20 °C冰箱中保 存。
[0043] 二、大白菜抗根腫病C肺基因的共分離分子標(biāo)記TCR540和TCR541的獲得和鑒定
[0044] 1、多態(tài)性引物的篩選
[0045] 根據(jù)樸鐘云課題組2014年發(fā)表的抗根腫病CRb基因的2個(gè)側(cè)翼標(biāo)記TCR79和 TCR108序列（Zhang 等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resist曰nee to clubroot disease in Brassies r曰p曰.，Mol Breeding,34: 1173-1183)，將該基因錯(cuò)定在大白菜A3連鎖群83.5化區(qū)間內(nèi)。分析化assica化tabase數(shù)據(jù) 庫化ttp: //brasS i ca化.0巧)序列信息，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域存在15個(gè)基因。根據(jù)運(yùn)15個(gè)基因的基 因功能，對其中5個(gè)抗病相關(guān)基因在抗病材料'CRBJN3-2'上進(jìn)行測序。對測序結(jié)果進(jìn)行比 對，發(fā)現(xiàn)抗病材料中有3個(gè)基因的序列與Brassica Database數(shù)據(jù)庫（http:// brassicadb.org)中參考基因組序列存在差異。因此，根據(jù)抗病材料的測序結(jié)果，利用 Prime巧.0軟件，共設(shè)計(jì)3對引物。
[0046] 利用設(shè)計(jì)的3對引物擴(kuò)增親本'CRBJN3-2'和'BJN3-2'的DNA，其中有2對引物在親 本間具有多態(tài)性，并分別命名為TCR540和TCR541，TCR540和TCR541對應(yīng)的分子標(biāo)記的序列 分別為：
[0047] (l)TCR540(148bp)的核巧酸序列如沈Q ID N0.1所示，為：
[004引 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTAT TGGAACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCA TATTT-3'。
[0049] (2)1'〇?541(25269)的核巧酸序列如沈9 10^.4所示，為：
[0050] 5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAAAAATCTACCTGGAAGCATCAAGAAACTTCATCATCTCAAATCT CTTTACTTGCATTGTCAACAGCTCGTTTCTCTTCCACTGCTTCCATCAAATCTGCAGTATCTGGATGCTCATGGCTG TATCTCACTCGAAACAGTGGCTAAACCCATGACGCTTCTTGTGGTAGCTGAAAGGAACCAGTCTACTTTCGTCTTCA CTGATTGTTTCAAGCTAAACAGAGATGCGCAA-3 '。
[0化1] 根據(jù)上述序列分別設(shè)計(jì)并合成了針對TCR540的一對引物F TCR540/R TCR540，W 及針對TCR541的一對引物F TCR541/R TCR541，具體序列如下：
[0化2] (1)TCR540的引物：
[0化3] FTCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'（核巧酸序列如沈QIDN0.2所示）
[0化4] 1?1'〇?540:5'-444了4了6〇：1'1^44176(：1'1'(：-3'（核巧酸序列如沈9 10備.3所示）。
[0化5] (2)TCR541 的引物：
[0化6] FTCR541:5-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'（核巧酸序列如沈QIDN0.5所示） [0057] 1?1'〇?541:5'-176〔6〔41'(：1'(：了61'7^6(：1'1'-3'（核巧酸序列如沈9 10備.6所示）。
[0化引 2、分子標(biāo)記的鑒定
[0化9] 為了驗(yàn)證運(yùn)些分子標(biāo)記的可靠性，首先，利用C肺兩翼連鎖標(biāo)記TCR79和TCR74見 (Zhang等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding,34:1173-1183)f^ 選1142株F2代感病個(gè)體中的重組體；然后，利用TCR540的引物（F TCR540/R TCR540)和 TCR541的引物(F TCR541 /RTCR541)分別對含抗根腫病基因 CRb的大白菜' CR BJN3-2 '和易 感根腫病的大白菜自交系'BJN3-2 '及其44個(gè)F2代感病重組體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表 明如圖1所示，圖1A為TCR540在抗病材料'CR BJN3-2'（R泳道）、感病材料'BJN3-2'（S泳道） W及重組體（1-44號泳道）中的擴(kuò)增結(jié)果，使用TCR540的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在抗病親本'CR BJN3-2'上能擴(kuò)增出一條148bp的條帶，在感病親本'BJN3-2'和44株F2代感病重組體上均能 擴(kuò)增出一條大于148bp的條帶；圖1B為TCR541在抗病材料'CR BJN3-2'（R泳道）、感病材料 '8抑3-2'（5泳道似及重組體（1-44號泳道）中的擴(kuò)增結(jié)果，使用1'0?541的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在 抗病親本' CRBJN3-2 '上能擴(kuò)增出一條252bp的條帶，在感病親本' BJN3-2 '和44株F2代感病 重組體上均能擴(kuò)增出一條大于25化P的條帶。
[0060] TCR540的引物在抗病材料當(dāng)中擴(kuò)增出來的序列為：
[0061 ] 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTAT TGGAACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCA TATTT-3'。
[0062] TCR540的引物在感病材料當(dāng)中擴(kuò)增出來的序列為：
[0063] 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGACCAACAACTCAGTAAGTCAGAGAAAATGTATATCTGTTACTTCCAC TGCTAGAAAATGTATATCTATTACTTCCACTGAAATTTAGAATACTGTTTAGGTTCCTTTGTACACTTAGAAGCTTA TGTTTCTGAACTCATTTGCCATTTTTCTTCAGGGAACAGAAGCAATTGAAGGCATATTT-3'。
[0064] 上述兩個(gè)序列的對比結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，兩個(gè)序列存在較大的差異性，說 明TCR540的分子標(biāo)記能夠很好的區(qū)分大白菜抗病材料和感病材料，可用于蕓臺種包括結(jié)球 白菜和青梗菜抗根腫病基因的分子標(biāo)記輔助選。
[0065] 3、遺傳圖譜的構(gòu)建
[0066] 根據(jù)F2群體的篩選鑒定結(jié)果，計(jì)算各標(biāo)記與CRb基因間的重組率，MapchartS. 1繪 審化Rb基因的遺傳連鎖圖譜（圖3)，圖右側(cè)標(biāo)記之間的數(shù)字表示標(biāo)記間的重組體數(shù)，圖左側(cè) 的數(shù)字表示兩標(biāo)記之間的遺傳距離，由圖可知^379、1'0?108、1'0?0、1'0?7、1'0?74，分別定 位于距離CRb基因0.03cM、0.04cM、0.36cM、0.43cM、0.49cM處。而新開發(fā)的分子標(biāo)記TCR540、 TCR541與CRb基因存在共分離關(guān)系。因此，確定運(yùn)2個(gè)標(biāo)記可W運(yùn)用到今后大白菜抗根腫病 CRb基因的分子標(biāo)記輔助選育過程當(dāng)中，并且由于運(yùn)2個(gè)分子標(biāo)記為共分離標(biāo)記，與之前的 連鎖標(biāo)記相比，在分子標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用中能夠消除連鎖累寶現(xiàn)象，大大提高轉(zhuǎn)育效率。
[0067] Ξ、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540和TCR541在輔助選擇大白 菜抗根腫病植株中的應(yīng)用方法，具體包括：
[0068] 1、用CTAB方法提取待測材料的基因組DNA
[0069] 用CTAB方法提取待測大白菜材料的基因組DNA，具體步驟參照上文中"一、大白菜 抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540、TCR541的獲得"中"2、CTAB法提取DNA"部分記 載的內(nèi)容。
[0070] 2、PCR 擴(kuò)增
[0071] a.反應(yīng)體系：10化體系，各組分物質(zhì)的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · 1/1引物； 1.0mmol.L-idNTP;1.0uL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；d地2〇補(bǔ)齊lOyL，混勻，離 屯、，
[0072] 其中，TCR540使用的引物的序列為：
[0073] F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 '，
[0074] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '，
[00巧]TCR541使用的引物的序列為：
[0076] F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '，
[0077] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[007 引 6.擴(kuò)增程序：94°(：預(yù)變性5111111;94°(：變性303;60°(：退火453;72°(：延伸303;35個(gè)循 環(huán)后；72°C延伸lOmin;最后4°C保存。
[0079] 3、電泳：
[0080] TCR540:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序 電泳儀上進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，70W條件下電泳1.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀 染；
[0081 ] TCR541:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序 電泳儀上進(jìn)行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染。 [0082]需要說明的是，上樣緩沖液采用聚丙締酷胺凝膠電泳常用的緩沖液，其中包含 98%("八）的的1'111日1111(16,1011^的抓了4,0.001%(>八）的巧16]16巧日]1〇巧1]0.001%(>八）的 bromphenol blue。
[0083] 4、結(jié)果分析
[0084] ①在使用TCR540的引物的擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測到148bp和大于148bp兩條帶， 則待測材料中含有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
[0085] ②在使用TCR541的引物的擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測到25化P和大于25化P兩條帶， 則待測材料中含有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
[0086] 如果①、②2項(xiàng)中的擴(kuò)增結(jié)果均可獲得，則待測材料具有大白菜抗根腫病基因 CRb 的概率為100 %。
[0087] 盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造 性概念，則可對運(yùn)些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所W，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu) 選實(shí)施例W及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
[0088] 顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W對本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精 神和范圍。運(yùn)樣，倘若本發(fā)明的運(yùn)些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍 之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含運(yùn)些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540，其特征在于，所述大白菜抗 根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，為： 5'-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTATTGGA ACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCATATT T-3, 。2. -種權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540的PCR特異 性擴(kuò)增引物包括： F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 ' R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540,在分子標(biāo) 記輔助選擇中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540，在大白菜 抗根腫病分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。5. -種權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR540的應(yīng)用方 法，具體包括： (1) 用CTAB方法提取待測材料的基因組DNA (2) PCR擴(kuò)增 a. 反應(yīng)體系：10yL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補(bǔ)齊 10yL，混勻，離 心， 其中引物的序列為F TCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'， R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '； b. 擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s; 60°C退火45s; 72°C延伸30s; 35個(gè)循環(huán)后； 72°(：延伸1〇11^11;最后4°(：保存； c .電泳:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序電泳 儀上進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳1.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染，并 觀察擴(kuò)增結(jié)果； d.判斷:擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測到148bp和大于148bp兩條帶，則待測材料中含有大 白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011134SQ201610459379
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】樸鐘云, 張騰, 龐文星, 李曉楠, 樸英蘭, 張椿雨
【申請人】沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)