一種高通量提取玉米或蘿卜基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，先批量地獲取待檢測的玉米或蘿卜的葉片樣品，然后分別加入堿液，在高溫條件下破壞掉植物葉片細胞壁和細胞膜，將DNA釋放出來，然后加入酸性的中和提取液使之適合PCR擴增，再進行擴增反應(yīng)后實現(xiàn)目標(biāo)分子檢測。本發(fā)明具有操作簡單，利于人工操作，適合小型實驗室開展，成本低廉，且處理效率高等優(yōu)點。
【專利說明】
-種高通量提取玉米或蘿I、基因組DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明農(nóng)植物育種DNA提取技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種高通量提取玉米或蘿h基因組 DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作物育種又稱品種改良，是通過創(chuàng)造 遺傳變異、改良遺傳特性，^培育優(yōu)良動植物 新品種，使其達到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、優(yōu)良效果的技術(shù)。對發(fā)展畜牧業(yè)和種植業(yè)具有十分重要 的意義。作物育種過程中，一般均需要使用到聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)實現(xiàn)分子標(biāo)記，聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外 的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。
[0003] W聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的玉米、蘿h分子標(biāo)記輔助育種需要在大群體中鑒定含 有目標(biāo)性狀(抗逆、優(yōu)質(zhì)）的單株或株系。在分子育種實踐中，方法之一是研究人員將育種群 體按單粒在苗床中發(fā)芽，幼苗移入田間種植之前完成對目標(biāo)性狀的分子鑒定。方法之二是 直接對種子進行分子檢測。盡管如此，研究人員通常會在一個育種世代對多個育種群體的 數(shù)千份單株進行目標(biāo)性狀的分子鑒定。因此，快速獲取數(shù)W千份能用于PCR擴增的DNA成為 限制分子標(biāo)記選擇效率的因素之一。
[0004] 目前，提取植物DNA常用的方法有CTAB(十六烷基Ξ甲基漠化錠)法、SDS(十二烷基 硫酸鋼)法、DNA商業(yè)試劑盒等方法。
[0005] CTAB法和SDS法主要缺點是過程復(fù)雜、繁瑣耗時。提取蘿h和玉米DNA需要8至10個 步驟，每份樣品需要在液氨中充分研磨，研磨的過程中樣品之間難免會有交叉污染，隨后需 長時間震蕩，反復(fù)離屯、、抽提和洗涂，最后干燥溶解。1個熟練的技術(shù)員1天最多能提取30份 樣品，運遠不能滿足分子標(biāo)記輔助育種實踐的需要。
[0006] DNA商業(yè)試劑盒主要缺點是價格昂貴，使用成本高。分子輔助選擇應(yīng)用于育種的主 要優(yōu)點能提高育種效率，降低育種成本。然而，利用商業(yè)試劑盒提取DNA進行分子檢測將明 顯提高分子輔助選擇的成本，從而增加了育種成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：如何提供一種針對玉 米、蘿hDNA，操作簡單，利于人工操作，成本低廉，且處理效率高的高通量提取玉米或蘿h基 因組DNA的方法。
[000引為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案： 一種高通量提取玉米或蘿l·基因組DNA的方法，其特征在于，先批量地獲取待檢測的玉 米或蘿l·的葉片樣品，然后分別加入堿液，在高溫條件下破壞掉植物葉片細胞壁和細胞膜， 將DNA釋放出來，然后加入酸性的中和提取液使之適合PCR擴增，再進行擴增反應(yīng)后實現(xiàn)目 標(biāo)分子檢測。
[0009]本方法，具體包括W下步驟： a、 將待檢測的批量玉米或蘿l·的種子單粒培養(yǎng)長出葉片； b、 按照30-60平方毫米對培養(yǎng)的各玉米或蘿h植株葉片進行取樣，并放入到處理用孔板 各小孔中； C、制備緩沖液A和緩沖液B，緩沖液A為0.1mol/L NaOH與2% Tween20等體積混合得到， 緩沖液B:0.1mol/L Tris-肥1與0.002 mol/L抓TA等體積混合得到；向處理用孔板各小孔 中加入500ul緩沖液A后，將處理用孔板加熱一段時間； d、 再在處理用孔板各小孔中加入500ul緩沖液B，震蕩一段時間，使得液體充分混合，釋 放出DNA; e、 將PCR反應(yīng)體系分裝入反應(yīng)用孔板各小孔中，對應(yīng)移取步驟d中震蕩后的處理用孔板 各小孔內(nèi)液體進入到反應(yīng)用孔板各小孔中，進行擴增反應(yīng)，然后實現(xiàn)目標(biāo)性狀分子檢測。
[0010] 本方法的主要原理是堿性、高溫的條件會破壞植物葉片細胞壁和細胞膜，從而將 DNA釋放出來，然后用酸中和提取液使之適合PCR擴增。濃度在2%W內(nèi)的Tween20既能破解細 胞膜釋放DNA，又不會抑制PCR擴增反應(yīng)。故本方法不需要對樣品進行研磨和預(yù)處理，針對小 型實驗室的現(xiàn)實需求，通過高通量低成本的核酸提取，在不需用機械手的條件下，能實現(xiàn)滿 足育種需求的高通量目標(biāo)性狀的分子檢測。
[0011] 作為優(yōu)化，a步驟中，將待檢測的批量玉米或蘿h的種子單粒分別放入到育種用孔 板各小孔中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長出葉片；育種用孔板優(yōu)選采用96孔板。運樣可W保證批 量處理的效率。
[0012] b步驟中，優(yōu)選采用植物葉片取樣器進行取樣，且處理用孔板優(yōu)選采用96孔PC財反 保證效率。
[0013] C步驟中，緩沖液調(diào)配可W采用W下方法： (1) lOOmM NaOH:將0.2 g NaOH溶解于雙純水中，定容為50 ml; (2) 2% Tween20:取5 g 20% Tween20 溶于50 ml的雙純水； (3) 100mM Tris-肥1:取0.605 g Tris-肥1溶于雙純水中，調(diào)節(jié)PH=8,定容為50ml; (4) 2mM邸ΤΑ:取0.037 g邸ΤΑ溶于雙純水中，調(diào)節(jié)PH=8,定容為50ml; (5) 緩沖液A:0.1mol/L NaOH與2% Tween20等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用； (6) 緩沖液B:0.1mol/L Tris-HCl與0.002 mol/L 邸TA等體積混合。
[0014] 采用上述方法，方便實施調(diào)配，非常利于小型實驗室環(huán)境中實施制備。
[0015] C步驟中，優(yōu)選采用量程lOOOul的12通道移液槍加入緩沖液A，W方便操作并提高 效率;其中加熱目的為利用堿性、高溫的條件破壞植物葉片細胞壁和細胞膜，從而將DNA釋 放出來，優(yōu)選采用熱循環(huán)儀中，95°C加熱lOmin，可W恰好達成該效果又不至于破壞掉DNA。
[0016] d步驟中，采用在震蕩器上震蕩5min，使緩沖液A和緩沖液B充分混合；W保證混合 充分，DNA能夠充分釋放到溶液中。
[0017] e步驟中，反應(yīng)用孔板優(yōu)選采用96孔PCR板保證效率；液體移取優(yōu)選采用量程 lOOOul的12通道移液槍，W方便操作并提高效率;還可W進一步在PCR反應(yīng)體系中加入0.1% 牛血清白蛋白（BSA)和1%聚乙締化咯燒酬(PVP)能有效降低抑制因子的作用，提高檢測效 果。
[0018] 本方法具有W下特點：1、最重要的優(yōu)點是高通量和成本低。利用該方法提取DNA，1 個研究人員1天能夠處理2000多個樣品，提取1個DNA的成本約是0.05美元。比CTAB和SDS法 省時，比試劑盒廉價。2、需要的葉片量少。約為30-60mm2的葉片提取的DM足夠100次PCR擴 增反應(yīng)。3、在具有上述優(yōu)點的同時，該方法提取的DNA能夠在4°C下穩(wěn)定保存1個月，-20°C下 穩(wěn)定保存3個月。4、用該方法提取DNA，W此作為模板進行PCR擴增反應(yīng)，在不需機械手操作 的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)分子檢測的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化。因此，應(yīng)用該方法提取DNA非常適合于小 型實驗室開展分子標(biāo)記輔助選擇工作。
[0019] 綜上所述，本發(fā)明具有操作簡單，利于人工操作，適合小型實驗室開展，成本低廉， 且處理效率高等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0020] 圖1為蘿h試驗驗證時取蘿hDNA提取樣液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，不同蘿h葉片 取量的提取液檢測的結(jié)果示意圖。
[0021] 圖2為蘿h試驗驗證時取蘿hDNA提取樣液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取樣量為5mg 的蘿陽ΝΑ提取液瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0022] 圖3為蘿h試驗驗證時蘿hDNA提取液PCR產(chǎn)物檢測圖。
[0023] 圖4為玉米試驗驗證時取玉米DNA提取樣液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，不同玉米葉 片取量的提取液檢測的結(jié)果示意圖。
[0024] 圖5為玉米試驗驗證時取玉米DNA提取樣液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取樣量為 lOmg的玉米DNA提取液瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0025] 圖6為玉米試驗驗證時玉米DNA提取液瓊脂糖電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和最優(yōu)實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0027] 最優(yōu)實施方式:一種高通量提取玉米或蘿h基因組DNA的方法，具體包括W下步驟： a、 將待檢測的批量玉米或蘿h的種子單粒培養(yǎng)長出葉片； b、 按照30-60平方毫米對培養(yǎng)的各玉米或蘿h植株葉片進行取樣，并放入到處理用孔板 各小孔中； C、制備緩沖液A和緩沖液B，緩沖液A為0.1mol/L NaOH與2% Tween20等體積混合得到， 緩沖液B:0.1mol/L Tris-肥1與0.002 mol/L抓TA等體積混合得到；向處理用孔板各小孔 中加入500ul緩沖液A后，將處理用孔板加熱一段時間； d、 再在處理用孔板各小孔中加入500ul緩沖液B，震蕩一段時間，使得液體充分混合，釋 放出DNA; e、 將PCR反應(yīng)體系分裝入反應(yīng)用孔板各小孔中，對應(yīng)移取步驟d中震蕩后的處理用孔板 各小孔內(nèi)液體進入到反應(yīng)用孔板各小孔中，進行擴增反應(yīng)，然后實現(xiàn)目標(biāo)性狀分子檢測。
[0028] 本實施方式中，a步驟中，將待檢測的批量玉米或蘿h的種子單粒分別放入到育種 用孔板各小孔中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長出葉片;育種用孔板采用96孔板。b步驟中，采用植 物葉片取樣器進行取樣，且處理用孔板采用96孔PC財反。C步驟中，緩沖液調(diào)配可W采用W下 方法： (1) lOOmM NaOH:將0.2 g NaOH溶解于雙純水中，定容為50 ml; (2) 2% Tween20:取5 g 20% Tween20 溶于50 ml的雙純水； (3) 100mM Tris-肥1:取0.605 g Tris-肥1溶于雙純水中，調(diào)節(jié)PH=8,定容為50ml; (4) 2mM邸ΤΑ:取0.037 g邸ΤΑ溶于雙純水中，調(diào)節(jié)PH=8,定容為50ml; (5) 緩沖液A:0.1mol/L NaOH與2% Tween20等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用； (6) 緩沖液B:0.1mol/L Tris-HCl與0.002 mol/L 邸TA等體積混合。
[0029] 本實施方式C步驟中，采用量程lOOOul的12通道移液槍加入緩沖液A。采用熱循環(huán) 儀95°C加熱lOmin。(1步驟中，采用在震蕩器上震蕩5min，使緩沖液A和緩沖液B充分混合。e 步驟中，反應(yīng)用孔板采用96孔PC財反，液體移取優(yōu)選采用量程lOOOul的12通道移液槍。同時 在PCR反應(yīng)體系中加入0.1%牛血清白蛋白和1%聚乙締化咯燒酬。
[0030] 下面，分別針對蘿h種子和玉米種子，W上述【具體實施方式】操作步驟為基礎(chǔ)，采用 W下試驗驗證本發(fā)明效果。
[0031] 一、蘿式驗驗證。
[0032] 蘿hDNA的提取與檢測。
[0033] 1、將蘿h種子放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，葉片取樣梯度預(yù)設(shè)為2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、 20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、50 mg。
[0034] 2、按【具體實施方式】中的操作步驟完成DM提取。
[0035] 3、DNA檢測:取蘿hDNA提取樣液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖1所示為不同蘿h葉 片取量的提取液檢測圖，圖中:M表示DNAmarker;; 1~10點樣孔均是相同體積的不同取樣量 的DNA提取液，從左至右依次為50 mg、40 mg、35 mg、30 mg、25 mg、20 mg、15 mg、10 mg、5 mg、2 mg的蘿h葉片取量的DM提取液。由圖1可知：葉片取樣量多少不影響提取液中DM的濃 度。
[0036] 圖2為取樣量為5mg的蘿陽NA提取液瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中:M表示marker; 1~13 點樣孔依次為提取液6.0 μ1、5.75 μ1、5.5 μ1、5.25 μ1、5.0 山、4.75 μ1、4.5 μ1、4.25 μ 1、4.0 μ1、3.75 μ1、3.50 μ1、3.25 μ1、3.0 μ1。由圖可知:利用本方法能提取蘿Η)ΝΑ，提取 液中含有釋放的DM，DM的濃度隨著檢測的提取液體積增大而提高。
[0037] 4、m亥DNA為模板的PCR擴增反應(yīng)。
[003引 PCR反應(yīng)體系（25 μ1): 12.5 μ1 2XTaq Master MixJTSR上、下引物（10 nmol/ ml)各 1 μΙ,ΟΝΑ提取液化1，Nase 化ee Water 7.5 μ1。
[0039] PCR反應(yīng)程序：
5、進行擴增反應(yīng)電泳檢測，如圖3所示，為蘿hDNA提取液PCR產(chǎn)物檢測圖，圖中：M表示 marker; 1-5依次為葉片取樣量5 mg; 10 mg; 15 mg ;20 mg; 25 mg ;所用引物為ITSR， 其擴增的條帶預(yù)期在75化p。由圖3可知:所有取量的DNA提取液都能擴增出預(yù)期產(chǎn)物，PCR擴 增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳效果與葉片取樣量的多少無關(guān)。將該方法得到的DNA提取液作為 PCR模板，能夠擴增出預(yù)期條帶，證明了該方法在蘿h分子檢測中的可行性。
[0040] 二、玉米試驗驗證。
[0041 ] 玉米DNA的提取與檢測。
[0042] 1、將玉米種子放入培養(yǎng)箱中發(fā)芽，葉片取樣梯度預(yù)設(shè)為2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、 20 m邑、25 m邑、30 m邑、35 m邑、40 m邑、50 mg。
[0043] 2、按【具體實施方式】中的操作步驟完成DNA提取。
[0044] 3、DNA檢測:取玉米DNA提取樣液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果參見圖4,圖4為不 同葉片取量提取出DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中：Μ表示DNA marker; 1~10點樣孔均是相同 體積不同取樣量的DNA提取液。從左至右依次為2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、50 mg的不同玉米葉片取量的DNA提取液。由圖4可知:所有葉片取量DNA提 取液均能檢測出DNA。且可W看出10 mg葉片的提取液DNA濃度最高。圖5為取樣量為lOmg的 玉米DNA提取液瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中：Μ表示DNAmarker; 1-6依次為提取液5 μ1，4.5 μ 1，4 μ1，3.5 μ1，3 μ1，2.5 μ1，7-漠酪藍。由圖5可知:移取4 μ1 DNA提取液進行檢測效果 最好。
[0045] 4、W該DNA為模板的PCR擴增反應(yīng)。
[0046] PCR反應(yīng)體系（25 μ1): 12.5μ1 2XTaq Master Mix，ITSR上、下引物（10 nmol/ ml)各0.5 μ1， DNA為1 yl，Nase Rree Water 10.5 μ1 。
[0047] PCR反應(yīng)程序：
5、擴增反應(yīng)電泳檢測。圖6為玉米DM提取液瓊脂糖電泳檢測圖；圖中：Μ表示 DNAmarker;!~10依次為葉片取樣量2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、 40 mg、50 mg。所用引物為口SR，其擴增出條帶預(yù)期在75化p。由圖6可知:所有取量的DNA提 取液都能擴增出預(yù)期產(chǎn)物，樣品取量為2 mg、5 mg、10 mg也能擴增出產(chǎn)物，但是沒有達到預(yù) 期效果。可W看出玉米的PCR擴增與葉片取樣量相關(guān)，而在葉片取樣量逐漸增大到一定程度 時對PCR反應(yīng)的影響不大。玉米提取DNA的葉片質(zhì)量最好在10 mg~30 mg之間。
[0〇4引試驗總結(jié)：綜上，利用該方法能從玉米、蘿h中提取DNA，且提取的DNA能夠滿足PCR 擴增反應(yīng)的要求，小型實驗室使用該方法，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量與低成本。
【主權(quán)項】
1. 一種高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，先批量地獲取待檢測的 玉米或蘿卜的葉片樣品，然后分別加入堿液，在高溫條件下破壞掉植物葉片細胞壁和細胞 膜，將DNA釋放出來，然后加入酸性的中和提取液使之適合PCR擴增，再進行擴增反應(yīng)后實現(xiàn) 目標(biāo)分子檢測。2. 如權(quán)利要求1所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，具體包括 以下步驟： a、 將待檢測的批量玉米或蘿卜的種子單粒培養(yǎng)長出葉片； b、 按照30-60平方毫米對培養(yǎng)的各玉米或蘿卜植株葉片進行取樣，并放入到處理用孔板 各小孔中； c、 制備緩沖液A和緩沖液B，緩沖液A為0· lmol/L NaOH與2% TWeen20等體積混合得到， 緩沖液B:0.1mol/L Tris-HCl與0.002 mol/L EDTA等體積混合得到；向處理用孔板各小孔 中加入500ul緩沖液A后，將處理用孔板加熱一段時間； d、 再在處理用孔板各小孔中加入500ul緩沖液B，震蕩一段時間，使得液體充分混合，釋 放出DNA; e、 將PCR反應(yīng)體系分裝入反應(yīng)用孔板各小孔中，對應(yīng)移取步驟d中震蕩后的處理用孔板 各小孔內(nèi)液體進入到反應(yīng)用孔板各小孔中，進行擴增反應(yīng)，然后實現(xiàn)目標(biāo)性狀分子檢測。3. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，a步驟中， 將待檢測的批量玉米或蘿卜的種子單粒分別放入到育種用孔板各小孔中，在光照培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)長出葉片;育種用孔板采用96孔板。4. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，b步驟中， 采用植物葉片取樣器進行取樣，且處理用孔板采用96孔PCR板。5. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，c步驟中， 緩沖液調(diào)配可以采用以下方法： (1) 100mM NaOH:將0.2 g NaOH溶解于雙純水中，定容為50 ml; (2) 2% Tween20:取5 g 20% Tween20 溶于50 ml的雙純水； (3) lOOmM Tris-HCl:取0.605 g Tris-HCl 溶于雙純水中，調(diào)節(jié)PH=8,定容為50ml; (4) 2mM EDTA:取0.037 g EDTA溶于雙純水中，調(diào)節(jié)PH=8,定容為50ml; (5) 緩沖液A:0.1mol/L NaOH與2% Tween20等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用； (6) 緩沖液B:0.1mol/L Tris-HCl與0.002 mol/L EDTA等體積混合。6. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，c步驟中， 采用量程l〇〇〇ul的12通道移液槍加入緩沖液A。7. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，c步驟中， 采用熱循環(huán)儀95°C加熱10min。8. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，d步驟中， 采用在震蕩器上震蕩5min，使緩沖液A和緩沖液B充分混合。9. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，e步驟中， 反應(yīng)用孔板采用96孔PCR板，液體移取優(yōu)選采用量程1000ul的12通道移液槍。10. 如權(quán)利要求2所述的高通量提取玉米或蘿卜基因組DNA的方法，其特征在于，e步驟 中，在PCR反應(yīng)體系中加入0.1%牛血清白蛋白和1%聚乙烯吡咯烷酮。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011132SQ201610672468
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月16日
【發(fā)明人】陳發(fā)波, 袁亮
【申請人】長江師范學(xué)院, 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院