專利名稱：一種高通量快速提取真菌基因組dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法，通過這種方法可以進行各種真菌，例如酵母、霉菌、木耳、動植物病原真菌等基因組DNA的快速提取。
背景技術(shù)：
真菌(fungus)在自然界中分布廣泛，種屬很多。真菌的形態(tài)差異很大，有些很小必須在顯微鏡下才可以看見單細胞形態(tài)，例如酵母型菌落；有些很大肉眼可見，例如靈芝等蕈菌的子實體。真菌的營養(yǎng)方式為異養(yǎng)吸收型，即通過細胞表面自周圍環(huán)境中吸收可溶性營養(yǎng)物質(zhì)，它可以產(chǎn)生大量無性和有性孢子進行繁殖。絕大多數(shù)真菌的營養(yǎng)體都是許多菌絲在一起的菌絲體。真菌通常分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌。它們歸屬于不同的亞門。大多數(shù)真菌屬于擔子菌亞門，少數(shù)屬于子囊菌亞門。有些真菌既是重要的菌類蔬菜，又是食品和制藥工業(yè)的重要資源。例如香菇、草菇、金針菇、平菇、木耳、銀耳、竹蓀、羊肚菌等。真菌也是重要的藥材，例如用作名貴藥材的靈芝、茯苓等。香菇、草菇等除了為人類提供蛋白質(zhì)和維生素以外，同時還為人類提供真菌多糖、低聚糖等提高免疫力、抗腫瘤的生物活性物質(zhì)。真菌的某些代謝產(chǎn)物在工業(yè)上具有廣泛用途并大規(guī)模生產(chǎn)，如乙醇，檸檬酸，甘油，酶制劑，留醇，脂肪，促生素，維生素等。真菌在自然界的物質(zhì)轉(zhuǎn)化中也起著不容忽視的作用。它可以將環(huán)境中的各種有機物降解為簡單的復(fù)合物和無機小分子，使許多重要化學(xué)元素得以再循環(huán)。另外，真菌還是進行基礎(chǔ)生物學(xué)研究的重要研究工具。但是真菌也有對人類有害的一面，寄生于動植物體表而導(dǎo)致動植物病害的病原真菌，動物性病原真菌?？梢鹑祟?、家畜和昆蟲類患病。許多真菌可引起人畜的疾病、植物病害、導(dǎo)致工業(yè)原料及農(nóng)產(chǎn)品的霉變、食品和糧食發(fā)霉，甚至在食品和糧食中產(chǎn)生毒素，例如急性黃曲霉毒素中毒，會引起肝臟壞死；慢性黃曲霉毒素中毒，則會引起肝癌。這些給人類帶來了極大的危害和損失。近幾年來，國內(nèi)外對真菌的基因資源愈加重視，各國都加大了研究投資力度。在食品領(lǐng)域，從食用真菌基因組中挖掘和克隆一些有益基因，增加有益代謝產(chǎn)物的表達；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，從水稻、小麥、玉米等重要糧食作物中挖掘和克隆與寄主互作的真菌致病基因，進行抗真菌病害研究，最終獲取抗病新品種；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，從病原真菌中找到致病基因，更好的為人類的健康提供服務(wù)。許多國家已經(jīng)開始了真菌基因組DNA的功能研究，但是這些研究的前提需要提取高質(zhì)量的真菌基因組DNA。由于真菌有特殊的細胞結(jié)構(gòu)，有些真菌是多核細胞，富含多糖和蛋白質(zhì)等次生代謝物。常規(guī)傳統(tǒng)方法使用了液氮研磨進行破壞細胞壁、也有用液氮結(jié)合蛋白酶K和蝸牛酶酶解破壞細胞壁等方法。真菌的核酸物質(zhì)往往是和蛋白質(zhì)緊密結(jié)合在一起的，而提取高質(zhì)量的真菌DNA的關(guān)鍵是有效的分離核酸和蛋白質(zhì)。破壞細胞膜使核酸和蛋白質(zhì)解聚的方法大多使用化學(xué)試劑CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，它不但能夠解聚核酸和蛋白質(zhì)，而且可以去除細胞內(nèi)多糖等復(fù)雜的代謝產(chǎn)物。對于去除細胞破裂釋放的蛋白質(zhì)，大多數(shù)使用了苯酚和巰基乙醇等，而這些藥品毒性很大，對人體健康有較大危害作用。目前國內(nèi)外報道的這些方法消耗大量化學(xué)試劑，實驗步驟煩瑣，提取時間長，最重要的是接觸有毒試劑較多。這些都無法滿足目前高通量真菌基因組研究的需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種簡單安全的高通量快速提取真菌基因組DNA的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法，所述方法包括(1)菌絲體的裂解從培養(yǎng)基上挑取真菌(包括酵母菌、霉菌和蕈菌)菌塊樣品 (直徑約1 2cm)，投入改良的CTAB緩沖液(通常為100 300 μ L)中，用消毒過的研磨棒充分研磨菌塊；所述CTAB緩沖液組成如下CTAB 1 5% (w/v，每IOOmL緩沖液中含有 1 5g CTAB)，NaCll 2mol/L，TrisCl 50 IOOmmo 1/L，EDTA 10 50mmol/L，SDS 0. 5 2% (w/v)，PVP 0. 2 (w/v)，溶劑為去離子水；(2) RNA雜質(zhì)的去除將研磨好的樣品補加CTAB緩沖液(通常為300 600 μ L，目的是使破碎的菌絲體內(nèi)容物與CTAB緩沖液充分作用。)和核糖核酸酶A(RNase A)(目的是水解RNA，對DNA不起作用，常規(guī)催化量，一般3 5 μ L即可，酶液濃度10 50 μ g/ml)，置于60 70°C水浴中，每隔5 IOmins輕輕搖動，20 30mins后取出；(3)蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除加入氯仿異戊醇體積比為M 1的CIA液，振蕩混勻 1 2mins ；(4)DNA的沉淀移取上層水相于1. 5mL離心管中，加入預(yù)冷(_20°C )的異丙醇溶液(體積約為上層水相的0. 7倍)，上下顛倒幾次使樣品混勻，置于_20°C下20 30mins， 使核酸充分沉淀；(5) DNA的溶解離心，棄上清液，將DNA沉淀吸干水分，即得樣品基因組DNA，用TE 緩沖液溶解，-20°C保存DNA樣品備用。所述TE緩沖液組成如下lmol/L TrisCl，0. 5mol/L EDTA，pH8. 0，溶劑為去離子水。本發(fā)明方法能高效快速的去除真菌細胞內(nèi)和細胞外的多糖和類似多糖的代謝物。 免去了使用液氮這種特殊試劑，也避免使用昂貴的酶試劑和毒性較大的化學(xué)試劑β -巰基乙醇和苯酚。提取產(chǎn)物DNA含量高，雜質(zhì)少，純度高，能滿足后續(xù)分子生物學(xué)的基因?qū)嶒灧治鲅芯俊１景l(fā)明方法既適用于絲狀真菌，也適用于酵母型和類酵母型真菌。通過這種方法， 可以成功實現(xiàn)在短時間內(nèi)上萬個真菌菌落的大規(guī)模DNA快速提取。本發(fā)明真菌優(yōu)選為水稻稻曲菌、畢赤氏酵母菌、黑霉菌以及平菇、草菇、香菇、銀耳和黑木耳等大型真菌。優(yōu)選的，所述方法如下(1)取1. 5mL離心管，加入改良的CTAB緩沖液100 μ L，從培養(yǎng)基上挑取真菌菌塊樣品(直徑Icm左右)，投入離心管中，用75% (ν/ν)酒精消毒過的研磨棒充分研磨菌塊； 所述 CTAB 緩沖液組成如下CTAB1. 5%，NaCl 1. 4mol/L, TrisCl IOOmmo 1/L, EDTA 20mmol/ L, SDS 1 %, PVP 1%，溶劑為去離子水；(2)研磨好的樣品補加400 μ L CTAB緩沖液和 3 5 μ 1 RNase Α(10 μ g/ml, sigma 公司)，置于65°C水浴中，每隔IOmins輕輕搖動，30mins后取出；(3)加入氯仿異戊醇體積比為M 1的CIA液700 μ L，振蕩混勻Imin ；(4)移取上層水相(約Iml)于離心管中，加入700yL預(yù)冷的異丙醇，顛倒幾次使樣品混勻，置于_20°C下20mins，使核酸充分沉淀；(5)離心，棄上清，取沉淀吸干水分，即得樣品基因組DNA，用TE緩沖液溶解 DNA，-20°C保存DNA樣品備用。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)免除了現(xiàn)有方法中必須使用特殊試劑液氮進行研磨的復(fù)雜程序，(2)避免了現(xiàn)有方法中使用苯酚等有毒致癌試劑，(3)避免使用有毒難聞的化學(xué)試劑巰基乙醇，(4)本方法只需要1小時，縮短提取時間2小時，大大加快了實驗速度，可實現(xiàn)高通量快速提取。


圖1為利用本發(fā)明方法分別提取的不同基因組DNA的電泳圖；M代表1 Marker (從上到下 DNA 大小依次為15000bp, IOOOObp, 7500bp, 5000bp, 2500bp, 2000bp, IOOObp)，1為水稻稻曲菌基因組DNA，2為畢赤氏酵母基因組DNA，3為黑霉菌基因組DNA，4 為平菇基因組DNA，5為黑木耳基因組DNA。圖2為利用本發(fā)明方法分別提取的不同基因組DNA的PCR擴增真菌核糖體 5. 8SrDNA的電泳圖；M代表DL2000Marker (從上到下DNA大小依次為2000bp，1000bp, 750bp,500bp,200bp, IOObp)，1為以水稻稻曲菌基因組DNA為模板擴增DNA，2為以畢赤氏酵母基因組DNA為模板擴增DNA，3為以黑霉菌基因組DNA為模板擴增DNA，4為以平菇基因組 DNA為模板擴增DNA，5為以黑木耳基因組DNA為模板擴增DNA。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 (1)取1個1. 5ml離心管，提前加入100 μ 1改進優(yōu)化的CTAB緩沖液(1. 5% CTAB, NaCl 1. 4mol/L, TrisCl 1 OOmmo 1/L, EDTA 20mmol/L，1 % SDS，1 % PVP，溶劑為去離子水)；(2)從培養(yǎng)基上挑取直徑1 2cm的水稻稻曲菌山stilaginoidea virens (Cooke) Tak]菌塊，放入離心管中，進行如下操作(3)用75%酒精消毒過的研磨棒充分研磨菌塊；(4)研磨充分后，補加 400 μ 1 CTAB 緩沖液和 4μ 1 RNase Α(10μ g/ml, sigma 公司生產(chǎn))；(5)將研磨好的樣品置于60 70°C的水浴槽中，每隔8 IOmins輕輕搖動，20 30mins后取出；(6)加入700ul CIA液(氯仿異戊醇=24 1，ν/ν)，震蕩混勻Imin ；(7) 12000rpm,離心 IOmins ；(8)小心移取上層水相于另一離心管中，加入0. 7倍體積-20°C預(yù)冷的異丙醇，上下輕微顛倒幾次使樣品混勻，置于_20°C下20mins，使核酸充分沉淀。(9) 12000rpm,離心 IOmins。(10)棄上清，沉淀在吸水紙上倒置1 anins，排干水分。(11)加入 20 50ul TE 緩沖液(lmol/L TrisCL,0. 5mol/LEDTA，ρΗ8· 0，溶劑為去離子水)溶解，-20°C保存DNA樣品備用。實施例2 取直徑約1 2cm的畢赤氏酵母菌(Pichia pastor is)菌塊、黑霉菌(Aspergillus niger)菌絲體、平 (Oyster mushroom)菌絲體禾口黑木耳(Auricularia auricular)菌絲體，分別按照實施例1方法進行基因組DNA提取。提取所得DNA與實施例1所得DNA按下述方法分別進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計方法檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測首先配制0.8%的瓊脂糖凝膠，用IXTAE電泳緩沖液對提取的真菌基因組總DNA進行電泳檢測，所述IXTAE電泳緩沖液組成如下0. 04mol/L iTris-乙酸，0. 001mol/L EDTA。吸取真菌基因組DNA 2 4 μ L，和Iul的6X上樣緩沖液(全式金生物公司生產(chǎn))混合，混合均勻后，按照15v/cm穩(wěn)壓電泳30分鐘。同時用1 Marker (全式金生物公司生產(chǎn))作為DNA的大小參照物。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)來觀察，結(jié)果見圖1，電泳結(jié)果基因組DNA條帶清晰完整，RNA去除的也很干凈。紫外分光光度計方法檢測分別取Iul提取的真菌基因組DNA，利用 NanoDrop ND-1000 紫外-可見光分光光度計(Nano-Drop Technologies, Wilmington,DE,USA)測定提取的DNA樣品，分別在230nm、260nm和^Onm下測定樣品的OD 值。其中0擬60nm/0擬80nm比值在1. 8 2. 0之間表示樣品含雜質(zhì)少，樣品純度比較高； 0D260nm/0D230nm比值用于表示DNA樣品的去鹽程度；0擬60nm/0D230nm比值在1. 9以上表示樣品含鹽量少，樣品純度比較高。按下列公式計算DNA的濃度DNA的濃度(yg/mL)= 0D260X50y g/mLX稀釋倍數(shù)。結(jié)果見表1 表1 采用本發(fā)明方法提取的DNA的純度和濃度
權(quán)利要求
1.一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法，所述方法按如下步驟(1)菌絲體的裂解從培養(yǎng)基上挑取真菌菌塊樣品，投入CTAB緩沖液中，用消毒過的研磨棒充分研磨菌塊；所述CTAB緩沖液組成如下:CTAB 1 5%，NaCl 1 2mol/L, TrisCl 50 1 OOmmol/L, EDTAlO 50mmol/L, SDS 0. 5 2%，PVP 0. 2 1%，溶劑為去離子水；(2)RNA雜質(zhì)的去除將研磨好的樣品補加CTAB緩沖液和RNase A，置于60 70°C水浴中，每隔5 IOmins輕輕搖動，20 30mins后取出；(3)蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除加入氯仿異戊醇體積比為M 1的CIA液，振蕩混勻1 2mins ；(4)DNA的沉淀移取上層水相于1. 5mL離心管中，加入預(yù)冷的異丙醇溶液，上下顛倒幾次使樣品混勻，置于_20°C下20 30mins，使核酸充分沉淀；(5)DNA的溶解離心，棄上清液，將DNA沉淀吸干水分，即得樣品基因組DNA，用TE緩沖液溶解，所述TE緩沖液組成如下-20°C保存DNA樣品備用。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述TE緩沖液組成如下dmol/LTrisCl，0.5mol/L EDTA, pH8. 0，溶劑為去離子水。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)取1.5mL離心管，加入CTAB緩沖液100 μ L，從培養(yǎng)基上挑取真菌菌塊樣品，投入離心管中，用75%酒精消毒過的研磨棒充分研磨菌塊；所述CTAB緩沖液組成如下CTAB`1.5%, NaCl 1. 4mol/L, TrisCl 100mmol/L, EDTA20mmol/L, SDS 1 %, PVP 1%，溶劑為去離子水；(2)研磨好的樣品補加400μ L CTAB緩沖液和3 5 μ 1 RNase Α,置于65°C水浴中，每隔IOmins輕輕搖動，30min后取出；(3)加入氯仿異戊醇體積比為M 1的CIA液700 μ L，振蕩混勻Imin ；(4)移取上層水相于離心管中，加入700μ L預(yù)冷的異丙醇，顛倒幾次使樣品混勻，置于-20°C下20mins，使核酸充分沉淀；(5)離心，棄上清，取沉淀吸干水分，即得樣品基因組DNA，用TE緩沖液溶解DNA，-20°C 保存DNA樣品備用。
4.如權(quán)利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述真菌為下列之一水稻稻曲菌、 畢赤氏酵母菌、黑霉菌、平菇、黑木耳。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高通量快速提取真菌基因組DNA的方法。所述方法利用真菌菌塊或菌絲體，經(jīng)過簡易的物理研磨方法，采用改良的CTAB溶液，經(jīng)過處理去雜后，可得到純化的DNA。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)免除了現(xiàn)有方法中必須使用特殊試劑液氮進行研磨的復(fù)雜程序，(2)避免了現(xiàn)有方法中使用苯酚等有毒致癌試劑，(3)避免使用有毒難聞的化學(xué)試劑β-巰基乙醇，(4)本方法只需要1小時，縮短提取時間2小時，大大加快了實驗速度，可實現(xiàn)高通量快速提取。本發(fā)明所述方法也可適用于其他各種真菌基因組DNA的快速提取。
文檔編號C12N15/10GK102392016SQ20111036530
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者李素芳, 王為民, 胡東維, 鄒克琴 申請人:中國計量學(xué)院