專(zhuān)利名稱(chēng)：用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇，具體涉及的是一種用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇。
背景技術(shù)：
四霉素(tetramycin)為刺孢吸水鏈霉菌北京變種的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，對(duì)鞭毛菌、子囊菌和半知菌亞門(mén)真亞門(mén)真菌和細(xì)菌(革蘭氏陰性和陽(yáng)性)均有極強(qiáng)的殺滅作用，尤其對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病、斑點(diǎn)落葉病和水稻稻瘟病等具有明顯的預(yù)防和治療作用，并能促進(jìn)病疤、傷口、剪鋸口組織愈合，對(duì)果樹(shù)開(kāi)甲后的甲口愈合有明顯的作用。四霉素是經(jīng)微生物發(fā)酵獲得，內(nèi)含多種營(yíng)養(yǎng)成分，能促進(jìn)弱苗根系發(fā)達(dá)、老化根系復(fù)蘇，提高作物抗病能力和優(yōu)化作物品質(zhì)，毒性低、無(wú)公害、高效廣譜、不污染環(huán)境，是生產(chǎn)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)殺菌劑。關(guān)于 tetramycin的生物合成途徑至今尚未闡明，根據(jù)結(jié)構(gòu)推測(cè)其是由丁酸起始單元，10個(gè)丙二酰輔酶A及1個(gè)甲基丙二酰輔酶A為延伸單元形成碳骨架，后經(jīng)過(guò)兩個(gè)氧化還原酶，氨基海藻糖合成/轉(zhuǎn)移酶等酶對(duì)其進(jìn)行后修飾后形成的聚酮化合物。Tetramycin的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，隨著tetramycin整個(gè)生物合成基因簇的克隆與功能分析，可以從分子水平上闡明tetramycin獨(dú)特的生物合成機(jī)理，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用代謝工程的原理，合理修飾tetramycin的生物合成途徑，探索生物利用度高，活性更好，并能通過(guò)微生物發(fā)酵大量生產(chǎn)的新型藥物。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未見(jiàn)到有關(guān)于四霉素生物合成基因簇的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇。本發(fā)明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇，該蛋白系統(tǒng)及基因簇能夠?qū)崿F(xiàn)生物合成四霉素，可用于醫(yī)藥，工業(yè)，農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的第一方面，本發(fā)明涉及一種用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)，包括(a)由SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或(b)在SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼前述蛋白質(zhì)系統(tǒng)的四霉素生物合成基因簇。
優(yōu)選地，所述基因簇包括如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述基因簇的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。第三方面，本發(fā)明還涉及前述的四霉素生物合成基因簇在生產(chǎn)四霉素中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果利用本發(fā)明的基因簇可實(shí)現(xiàn)以下目的本發(fā)明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇，該蛋白系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)生物合成四霉素，能夠用于醫(yī)藥，工業(yè)，農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法或包含本發(fā)明序列的DNA作為探針進(jìn)行Southern雜交的方法從其他微生物中得到四霉素生物合成基因的同源基因。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆DNA可用于從 Streptomyces hygrospinosusvar. bei jingensis基因組文庫(kù)中定位更多的文庫(kù)質(zhì)粒。這些文庫(kù)質(zhì)粒至少包含本發(fā)明中的部分序列，也包含有基因組中以前臨近區(qū)域未克隆的DNA。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通過(guò)中斷四霉素生物合成的一個(gè)或幾個(gè)步驟或者引入其他同源基因而得到新的四霉素的前體或衍生物。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以用來(lái)提高四霉素或其衍生物的產(chǎn)量。例如，轉(zhuǎn)入更多拷貝的正調(diào)節(jié)基因或增強(qiáng)其表達(dá)。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過(guò)遺傳重組來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒以獲得新型生物合成途徑，也可以通過(guò)插入、置換、缺失或失活進(jìn)而獲得新型生物合成途徑。本發(fā)明所提供的序列或部分序列的克隆基因可以通過(guò)合適的表達(dá)系統(tǒng)在外源宿主中表達(dá)以得到修飾的酶或更高的生物活性或更高的產(chǎn)量。這些外源宿主包括鏈霉菌，大腸桿菌，芽孢桿菌，酵母，植物和動(dòng)物細(xì)胞等。本發(fā)明所提供的序列或部分序列可以通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合轉(zhuǎn)移等方式轉(zhuǎn)入到其他抗生素產(chǎn)生菌中，從而產(chǎn)生該抗生素的衍生物。本發(fā)明所提供的核苷酸序列可以被修飾或突變。這些途徑包括插入或置換，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，錯(cuò)誤介導(dǎo)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，位點(diǎn)特異性突變，或與其它來(lái)源的同源序列進(jìn)行直接進(jìn)化(DNA shuffling)，或提供紫外線(xiàn)或化學(xué)試劑誘變等。本發(fā)明所提供的氨基酸序列或部分序列可以用來(lái)分離所需要的蛋白質(zhì)并可用于抗體的制備。本發(fā)明所提供的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學(xué)活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特征或其它致力于得到的性質(zhì)。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達(dá)并通過(guò)DNA芯片技術(shù)了解它們?cè)谒拗鞔x鏈中的功能。本發(fā)明提供的核苷酸序列或多個(gè)序列可以與載體序列融合而得到重組序列和相應(yīng)的DNA分子。


圖1為四霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為突變株構(gòu)建及發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果；圖3為四霉素合成基因簇結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為四霉素生物合成途徑示意圖；圖5為實(shí)施例發(fā)酵液的提取物HPLC分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。以下實(shí)施例中所涉及的菌種保藏信息如下本發(fā)明中所涉及的“刺孢吸水鏈霉菌北京變種(Sti^ptomyces hygrospinosus var. beijingensis)，，已在《陶天申，岳瑩玉等，刺抱吸水鏈霉菌新變種-北京變種，微生物學(xué)通報(bào)，1983年02期，49 50》中公開(kāi)發(fā)表，相關(guān)菌種可從北京中國(guó)農(nóng)科院農(nóng)業(yè)菌種保藏中心取得，菌種編號(hào)為ACCC40033.該單位的地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)中國(guó)農(nóng)科院農(nóng)業(yè)菌種保藏中心，郵編100081。大腸桿菌DHlOB 購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)馬里蘭州蓋色斯堡生物制劑公司Gibco_BRL。棚列1、隨胃物☆成細(xì)馳雄1. 1 提耳又四霉素產(chǎn)牛菌 Streptomyces hygrospinosus var. bei iingensis 基因組 DNA接禾中 Streptomyces hygrospinosus var. beijingensis 至 TSBY(10. 3%蔴糖)培養(yǎng)基于含有彈簧的三角瓶中30°C培養(yǎng)48h。離心收集菌體，重懸于5ml SET 緩沖液中(75mM NaCl, 25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl ρΗ7· 5)。加入100 μ 1溶菌酶溶液(50mg/ml)，置37°C約60分鐘。溶菌后然后加入140 μ 1蛋白酶K溶液(20mg/ml)混均勻，再加600 μ 1 10% SDS, 通過(guò)顛倒混勻，置55°C溫浴2h，期間偶爾顛倒幾次。再加入aiil 5M NaCl，徹底混勻，冷卻置37°C后，加入5ml氯仿，于室溫輕輕混勻。20°C、4500g 離心 15 分鐘。轉(zhuǎn)移上清至新管中，加入0. 6倍體積的異丙醇顛倒混勻，約3分鐘后用玻棒挑取至含70% (ν/ν)乙醇的新管中洗滌，重復(fù)2次，空氣中干燥，溶解在TE中。1. 2四霉素生物合成基因簇的克隆通過(guò)刺抱吸水鏈霄菌北京變種(Streptomyces hygrospinosus var. beijingensis)進(jìn)行4 全基因組掃描計(jì)劃，得到704個(gè)基因組序列重疊群(contig)，相加有187Mb。參考鏈霉菌常規(guī)基因組大小均在8Mb左右，故該掃描序列以約20倍覆蓋率涵蓋全基因組信息。使用生物信息學(xué)軟件對(duì)187Mb序列進(jìn)行功能分析，先用軟件Glimmer將核酸序列翻譯為氨基酸序列，再通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Blast比對(duì)，找到同源蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)這段核酸編碼蛋白的功能預(yù)測(cè)。通過(guò)以上生物信息學(xué)手段，找到一個(gè)501Λ大小的重疊群A，其序列編碼包含有典型I型聚酮合酶并與匹馬霉素同源。設(shè)計(jì)基因缺失突變株進(jìn)行2139bp基因中斷試驗(yàn)。用BamHI對(duì)cosmid IlAll進(jìn)行酶切，回收6. 8_kb片段插入pJTU412的BamHI位點(diǎn)構(gòu)成質(zhì)粒PJTU5擬6。從質(zhì)粒pIJ773上回收1371_bp的HindIII-EcoRI片段，并以此為模板，用引物41TGF/41TGR進(jìn)行KOD PCR擴(kuò)增1449_bp包含有oriT的阿泊拉霉素抗性基因 (aac (3) IV cassette)以及用于同源交換的39_bp序列。
通過(guò)PCR targeting的方法得到將6. 8-kb上的2139-bp片段替換1449-bp阿泊拉霉素抗性基因片段的過(guò)渡質(zhì)粒，該質(zhì)粒上保留了用于雙交換的左右臂各^63-bp和 1754-bp。通過(guò)接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入野生型刺孢吸水鏈霉菌北京變種(Sti^ptomyces hygrospinosus var. bei jingensis)中，通過(guò)篩選得到雙交換突變株。對(duì)突變株和野生型菌種發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，突變株構(gòu)建及發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果如圖2A、2B所示，其中A 為四霉素生物合成基因tetrB，tetraK的中斷實(shí)驗(yàn)示意圖，B為其突變株的HPLC檢測(cè)圖；由圖2B可知該突變株喪失了產(chǎn)生四霉素的能力。1. 3四霉素牛物合成基因簇邊界的確定通過(guò)對(duì)重疊群41序列的詳細(xì)分析，只包含部分典型I型聚酮合酶，缺少了大部分的后修飾基因及調(diào)節(jié)基因，表明該重疊群只包含部分四霉素生物合成基因簇。為了獲得全部的生物合成基因簇，接下來(lái)設(shè)計(jì)引物探針2對(duì)探針探針1 Forward 5 □ -CCTCGGTGACGAGTTCCGCCTGCTG-3 □，Reverse 5 □ -GGTGCCCCGTCCCGAACTGCTCATG-3 □；探針2 Forward 5 □ -CCGACCGGGCGATGCTGCGCTGGAC-3 □，Reverse 5 □ -GAGGACGGACGGGGTTCGGCGAGCAC-3 □。通過(guò)染色體步移(chromosome walkig)得到了另外四個(gè)粘粒，包含另外三個(gè)全基因組測(cè)序重疊群(重疊群79，445，150)的序列信息，加上重疊群41，共涵蓋約1401Λ的序列。分析顯示，這1401Λ的序列包含從tetrj到tetrE的基因，編碼蛋白可以完成對(duì)四霉素的生物合成。四霉素結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如圖1所示。根據(jù)基因編碼蛋白的功能分析，四霉素的生物合成基因簇被確定為從基因tetrj 到tetrE，涵蓋了染色體上約1001Λ的區(qū)域，包含20個(gè)開(kāi)放讀碼框，其序列如SEQ ID NO. 1 所示。根據(jù)生物信息學(xué)分析，tetrj上游為跨膜蛋白，沒(méi)有顯示明顯的四霉素生物合成相關(guān)性。tetrE是典型I型聚酮合酶，為四霉素合成所必須，而其下游基因編碼的蛋白均為未知功能的蛋白，因此tetrj和tetrE被確定為四霉素生物合成基因簇的邊界。四霉素合成基因簇結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示，包括的20個(gè)基因如下所述基因tetrj，其基因核苷酸序列位于序列1中第5796 4447位，編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示；所述基因tetrT I，其基因核苷酸序列位于序列1中第7647 4447位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示；所述基因tetrT II，其基因核苷酸序列位于序列1中第9610 7625位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示；所述基因tetrM I，其基因核苷酸序列位于序列1中第9809 10837位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 5所示；所述基因ttrR I，其基因核苷酸序列位于序列1中第11237 14131位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示；所述基因ttrR II，其基因核苷酸序列位于序列1中第14157 16940位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 7所示；
所述基因ttrR III，其基因核苷酸序列位于序列1中第16989 19625位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述基因ttrR IV，其基因核苷酸序列位于序列1中第20083 20706位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；所述基因tetrC，其基因核苷酸序列位于序列1中第21037 49549位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；所述基因tetrD，其基因核苷酸序列位于序列1中第49560 54941位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示；所述基因tetrE，其基因核苷酸序列位于序列1中第54976 62004位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所述基因tetrK，其基因核苷酸序列位于序列1中第63260 62070位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 13所示；所述基因tettB，其基因核苷酸序列位于序列1中第63516 83873位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 14所示；所述基因tetrL，其基因核苷酸序列位于序列1中第85605 84484位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15所示；所述基因tetrA，其基因核苷酸序列位于序列1中第91044 85837位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示；所述基因tetrF，其基因核苷酸序列位于序列1中第91306 91115位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 17所示；所述基因tetrG，其基因核苷酸序列位于序列1中第92574 91399位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 18所示；所述基因tetrMII，其基因核苷酸序列位于序列1中第93664 擬606位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 19所示；所述基因tetrMIII，其基因核苷酸序列位于序列1中第95109 93721位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 20所示；所述基因tetrO，其基因核苷酸序列位于序列1中第96987 95321位；編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 21所示。1. 4四霉素的生物合成途徑通過(guò)四霉素基因簇上每個(gè)基因的生物信息學(xué)分析以及相關(guān)H(S的研究報(bào)道，四霉素的生物合成途徑經(jīng)歷以下幾個(gè)過(guò)程(推導(dǎo)的四霉素生物合成途徑示意圖如圖4所示)首先通過(guò)iTetrA加載乙酸起始單位，后經(jīng)過(guò)四個(gè)聚酮合酶基因(tetrB、tetrC、tetrD、 tetrE)共12個(gè)模塊和TE的作用延伸、環(huán)化并釋放四霉素的聚酮骨架；其次，經(jīng)過(guò)P450單加氧酶、氨基海藻糖轉(zhuǎn)移酶等后修飾基因的共同作用對(duì)聚酮骨架進(jìn)行甲基化、羥化等后修飾并加載氨基海藻糖，形成具有生物活性的四霉素；最后通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等作用將合成的四霉素轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。 按照實(shí)施例1. 1的方法提取四霉素產(chǎn)生菌Mi^ptomyces hygrospinosus var. beijingensis基因組DNA。之后進(jìn)行如下步驟的操作
2. 1用于構(gòu)津突變株的載體的構(gòu)津用PCR方法以基因組DNA為模板擴(kuò)增預(yù)敲除基因組DNA的兩臂各約1. 51Λ，用KpnI 和McI將兩臂中間(即如SEQ ID NO. 1所示的基因簇序列)插入卡那霉素抗性基因，形成三片段連接的中間載體。之后將該三片段連接于游離性質(zhì)粒pSJT1278(He Y, J Microbiol Biotechnol,2010)，完成用于構(gòu)建突變株的質(zhì)粒載體。2. 2 四霍素產(chǎn)生菌 Streptomyces hyRrospinosus var. bei jinRensis 接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的律立收集生長(zhǎng)于SFM培養(yǎng)基刺孢吸水鏈霉菌北京變種(Sti^ptomyces hygrospinosus var. bei jingensis)的新鮮孢子備用。步驟2. 1得到的質(zhì)粒載體必須在輔助質(zhì)粒pUZ8002(Bierman，Μ.，et al，Gene, 1992)的協(xié)助下，才能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到北京變種(Sti^ptomyces hygrospinosus var. beijingensis)中；先)If 待轉(zhuǎn)移至 Ij Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis 中的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002(Bierman，Μ. , et al, Gene, 1992)，然后培養(yǎng)含目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002，12h后收集菌體，用新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體2次備用。作為受體的鏈霉菌北京變禾中(Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis) 孢子需經(jīng)熱激和預(yù)萌發(fā)處理。將鏈霉菌孢子重新懸浮于5ml 0. 05M pH8. O的TES緩沖液中， 在55°C水浴中熱激10!^11，冷卻至室溫后加入等體積2乂孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基(Oxide酵母膏 10%, Oxide酪蛋白氨基酸1%，CaCl2 0. 01M)(需配制5M的原液，分開(kāi)滅菌后加到酵母膏酪蛋白氨基酸溶液中)預(yù)萌發(fā)2-池，離心收集孢子并重新懸浮于適量的LB中，在混合器上振蕩打散孢子，按IO8 IO8與大腸桿菌細(xì)胞等量混合，26-30h后用Iml無(wú)菌水含適量抗生素和萘啶酮酸(用來(lái)抑制大腸桿菌的生長(zhǎng))來(lái)覆蓋，置30°C培養(yǎng)數(shù)天后即可看到接合子。2. 3基因中斷突變株的構(gòu)建將步驟2. 1得到的用于構(gòu)建突變株的載體通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)至鏈霉菌北京變種(Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis)中，將生長(zhǎng)出來(lái)的接合子在添力口阿泊拉霉素(apramycin)的SFM平板上抗性驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后，在未添加阿泊拉霉素的SFM 平板上擴(kuò)大松弛培養(yǎng)，待孢子生長(zhǎng)豐滿(mǎn)后(約7天)，收集孢子，然后在添加相應(yīng)抗生素的 SFM平板上梯度稀釋每平板約50-100個(gè)單菌落，挑選菌落分別在含阿泊拉抗生素的SFM平板和含硫鏈絲菌素的SFM平板上擴(kuò)大培養(yǎng)，選擇在硫鏈絲菌素平板上未長(zhǎng)但在阿泊拉平板上生長(zhǎng)良好的菌落，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中提取總DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證正確后，獲得突變株，突變株基因組中的四霉素生物合成基因簇已經(jīng)被敲除，發(fā)酵該菌株，其產(chǎn)物中不會(huì)含有四霉素。下面對(duì)該突變株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。2. 4四霉素的發(fā)酵、分離純化及LC-MS分析鑒定分別發(fā)酵步驟2. 3得到的突變株和野生型刺孢吸水鏈霉菌北京變種 (Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis),分析其發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵流程甘油管中取適量孢子(約50ul)接種至80ml TSBY (10. 3%蔗糖)種子培養(yǎng)基(500ml三角瓶)，30°C，220rpm培養(yǎng)2天。以5%的接種量將種子接種至80ml發(fā)酵培養(yǎng)基中(500ml三角瓶)(玉米粉10g，可溶性淀粉20g，黃豆餅粉10g，KH2PO4 0. 2g，NaCl 3g, NH4Cl 3g, CaCO3 4g,蒸餾水 lOOOmL，pH7. 0)，30°C，220rpm 培養(yǎng) 4 天。
分離純化將80ml發(fā)酵液離心下來(lái)的菌絲體用丙酮浸泡，室溫過(guò)夜。然后離心，棄菌體，取上清，45°C旋轉(zhuǎn)蒸掉丙酮，用約Iml甲醇溶解，_70°C保存。LC-MS分離檢測(cè)制備型高壓液相色譜儀為島津公司(SHIMADZU)的LC-8A，色譜柱為PRC-ODS柱，流速4mL · mirT1，檢測(cè)流動(dòng)相甲醇水=7 3，檢測(cè)波長(zhǎng)304nm。為用安捷倫公司的高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用Agilent IlOOseries LC/MS Trap system質(zhì)譜儀進(jìn)行化合物的檢測(cè)和分析，色譜柱為Agilent Z0RBAX-TC-C18柱(5 μ m，4. 6mmX 250mm)，檢測(cè)的流動(dòng)相乙腈0. 005M醋酸銨緩沖液=4 6，流速為0. 6mL · mirT1，檢測(cè)波長(zhǎng)304nm。野生型刺孢吸水鏈霄菌北京變種(Streptomyces hygrospinosus var. beijingensis)的發(fā)酵液的提取物HPLC分析結(jié)果如圖5所示，(A)為發(fā)酵液提取物的分析結(jié)果；(B)為四霉素標(biāo)準(zhǔn)品(sigma)的分析結(jié)果，由此可以看出，發(fā)酵液的提取物含有四霉素。步驟2. 3得到的突變株的發(fā)酵液的提取物HPLC分析結(jié)果如圖2C所示，由圖可以看出 (AtetrB mutant曲線(xiàn))，突變株發(fā)酵液的提取物中沒(méi)有四霉素，由此可以明確證明，本實(shí)施例提供的四霉素生物合成基因簇能夠?qū)崿F(xiàn)生物合成四霉素。顯而易見(jiàn)地，本發(fā)明的保護(hù)范圍也涵蓋如下內(nèi)容本發(fā)明的四霉素生物合成基因簇對(duì)應(yīng)的蛋白系統(tǒng)由SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)必然能夠生物合成四霉素。本領(lǐng)域技術(shù)人員也很容易理解，在SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)也能夠?qū)崿F(xiàn)生物合成四霉素。同樣，對(duì)于包含本發(fā)明中SEQ ID NO. 1所示序列的核苷酸分子也可以實(shí)現(xiàn)生物合成四霉素的功能，這也是本領(lǐng)域的公知常識(shí)。綜上所述，本發(fā)明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇，該蛋白系統(tǒng)及基因簇能夠?qū)崿F(xiàn)生物合成四霉素，可用于醫(yī)藥，工業(yè)，農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)，其特征在于，包括(a)由SEQID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或(b)在SEQID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)系統(tǒng)的四霉素生物合成基因簇。
3.如權(quán)利要求2所述的四霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列。
4.如權(quán)利要求3所述的四霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇的堿基序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
5.一種權(quán)利要求2、3或4所述的四霉素生物合成基因簇在生產(chǎn)四霉素中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇，所述用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)括由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.21所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或在SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；本發(fā)明還涉及編碼所述蛋白質(zhì)系統(tǒng)的四霉素生物合成基因簇以及該生物合成基因簇在生產(chǎn)四霉素中的用途。本發(fā)明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系統(tǒng)及編碼其的基因簇，能夠?qū)崿F(xiàn)生物合成四霉素，用于醫(yī)藥，工業(yè)，農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102516374SQ20111036512
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者姚芬, 曹博, 朱昌雄, 田云龍, 由德林, 鄧子新 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)