專利名稱：一種l-ncc酰胺水解酶和編碼基因及其重組表達(dá)蛋白質(zhì)的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及來源于假單胞菌的一種L-NCC酰胺水解酶的編碼基因，以及重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(N-carbomyl-L-cysteine amidohydrolase)， 即L-NCC酰胺水解酶，是一種催化N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine， L-NCC)水解生成L-半胱氨酸的酶。因?yàn)锳TC消旋酶催化拆分DL-ATC生成L-ATC ；L-ATC水解酶水解ATC噻唑環(huán)中C-S單鍵，生成中間產(chǎn)物L(fēng)-NCC ；再經(jīng)L-NCC酰胺水解酶催化生成終產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸，所以L-NCC酰胺水解酶是參與酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC生產(chǎn)L-半胱氨酸的重要成員之一，具體過程參見附圖1。L-半胱氨酸(L-cysteine)是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，是一種α氨基酸， 它的存在可以保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，同一條或不同多肽鏈兩個(gè)L-半胱氨酸殘基間以二硫鍵(-S-S-)連接，使蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的空間立體結(jié)構(gòu)。L-半胱氨酸在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)具有廣泛的用途，日益受到重視。目前L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法主要有毛發(fā)水解后還原法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法合成法等。近年來，以微生物為酶源，采用酶法制備氨基酸的技術(shù)有了快速的發(fā)展。微生物酶法具有特異性強(qiáng)、生產(chǎn)工藝簡單、副反應(yīng)和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。特別是近年來，以酶法合成替代難于用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸，有了顯著的進(jìn)步。目前，有3種微生物酶法轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸的工藝路線(1)以3-氯-L-丙氨酸為前體物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以0-乙酰絲氨酸為前體物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以 DL-ATC為前體物的酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸。DL-ATC是以丙烯酸甲酯為前體物合成的化工產(chǎn)品。對DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化途徑的研究最早開始于1979年，日本學(xué)者Sano提出了完成該轉(zhuǎn)化過程的兩種假設(shè) 一種是以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine，L-SCC)為中間產(chǎn)物的S-代途徑；另一種是以L-NCC為中間產(chǎn)物的N-代途徑，反應(yīng)過程和酶系如附圖1所示。其中以 L-NCC為中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑最初于1998年由Tamura報(bào)道。該學(xué)者對L-半胱氨酸合成菌株假單胞菌ON-如和惡臭假單胞菌AJ3865進(jìn)行研究，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果分別以DL-ATC、 L-NCC和L-SCC為誘導(dǎo)物進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞加入不同的底物進(jìn)行酶活測定，僅 DL-ATC誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有L-ATC水解酶活性；而且各種細(xì)胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而無L-SCC酰胺水解酶活性，而且各種細(xì)胞均不能夠利用N-氨甲酰-D-半胱氨酸、L-SCC和 S-氨甲酰-D-半胱氨酸為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)生成L-半胱氨酸。Tamura還對中間產(chǎn)物進(jìn)行了純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)過紅外光譜掃描、質(zhì)譜分析、核磁共振分析和元素分析，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的L-NCC完全相同，因此證明了這兩株菌進(jìn)行以L-NCC為中間產(chǎn)物的L-半胱氨酸合成代謝途徑。目前，有關(guān)酶法合成L-半胱氨酸相關(guān)酶系的報(bào)道不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的L-NCC酰胺水解酶及其編碼基因，獲得活力較高的重組酶，并且這種L-NCC酰胺水解酶可在酶法制備L-半胱氨酸中應(yīng)用。本發(fā)明從污泥中分離得到了一株新的假單胞菌I^seudomonas sp. QR-101，于2011 年10月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號CGMCC No. 5315。該菌株進(jìn)行以L-NCC為中間產(chǎn)物的L-半胱氨酸合成代謝途徑，涉及ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶等3個(gè)酶的協(xié)同催化作用。本發(fā)明提供的L-NCC酰胺水解酶，來源于假單胞菌I^seudomonas sp. QR-101，是序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No. 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代或添加且具有與SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸殘基序列是由420個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的L-NCC酰胺水解酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)是序列表SEQ ID No. 2的核苷酸序列，由1260個(gè)堿基組成；(2)編碼序列表中SEQ ID No. 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列。本發(fā)明同時(shí)提供了含本發(fā)明基因(SEQ ID No. 2)的表達(dá)載體及細(xì)胞體系。所述的細(xì)胞體系為原核細(xì)胞系統(tǒng)。本發(fā)明重組L-NCC酰胺水解酶蛋白質(zhì)可以通過以下方法獲得培養(yǎng)含有L-NCC酰胺水解酶表達(dá)載體的宿主菌E. C0liBL21/pET-21a(+)-atCC，該細(xì)胞體系為原核細(xì)胞體系， 在所規(guī)定的蛋白質(zhì)表達(dá)條件下，獲得表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)-NCC酰胺水解酶。本發(fā)明的L-NCC酰胺水解酶及其編碼基因可在微生物酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸中應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明從一株假單胞菌中成功地克隆到一個(gè)新的L-NCC酰胺水解酶基因并進(jìn)行了表達(dá)、重組酶的制備和轉(zhuǎn)化等研究，本發(fā)明涉及的L-NCC酰胺水解酶的氨基酸序列通過 GenBank Blast 發(fā)現(xiàn)，與來自 Pseudomonas sp. Strain BS 的 atcC (GenBank :BAD15360. 1)的同源性為88%，它們的核苷酸序列同源性為83%。利用高效表達(dá)L-NCC酰胺水解酶的大腸桿菌E. coliBL21/pET-21a (+) -atcC,水解L-NCC生產(chǎn)L-半胱氨酸，催化效率高，發(fā)酵成本低，且反應(yīng)液中成分單一，后續(xù)分離純化方便，因此本發(fā)明在L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域具有良好的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。


圖1 是酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的S-代和N-代途徑示意圖；圖2 是I^seudomonas sp. QR-101的L-NCC酰胺水解酶與數(shù)據(jù)庫中已知序列L-NCC 酰胺水解酶(GenBank :BAD15360. 1)的核苷酸序列比對，其中，A是基因序列的l_640bp，B 是基因序列的641-1260bp ；圖3 是重組質(zhì)粒pET21-a(+)/atCC的圖譜；
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圖4 是基因工程菌E. coliBL21/pET-21a(+)-atcC的酶切鑒定圖；圖 5:是基因工程菌 E. coliBL21/pET-21a(+)_atcC 表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE 電泳圖。其中，泳道1 :Pseudomonas sp. QR-101 ；泳道2 基因工程菌Ε· coli BL21/ pET-21a(+)-atcC ；泳道 3 :Ε· coli BL21/pET_21a(+)。圖6 是酶催化L-NCC生成L-半胱氨酸的薄層層析圖譜。其中，第1道L_NCC標(biāo)準(zhǔn)品；第2道L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；第3道酶催化反應(yīng)液。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1L-NCC酰胺水解酶的酶活測定方法(1)原理采用酸性茚三酮法。L-NCC酰胺水解酶分解L-NCC生成L-半胱氨酸， L-半胱氨酸在煮沸的條件下與酸性茚三酮試劑生成紅色物質(zhì)，在560nm下有最大吸收，其顏色深淺與L-半胱氨酸的量成正比。(2)方法準(zhǔn)確在10A的L-NCC的溶液中加入6 %的K2HPO4至pH值7. 5配成底物終濃度為0. 75%的溶液，然后取ImL的底物溶液，加入0. 5mL酶液，于37°C水浴中反應(yīng)lOmin。反應(yīng)液中L-半胱氨酸含量測定采用酸性茚三酮法，取反應(yīng)液0. 2mL，加入0. 2mL冰醋酸，再加入0. 2mL酸性茚三酮試劑(稱取250mg茚三酮，溶于6mL乙酸和4mL濃鹽酸的混合液中)，于沸水浴中反應(yīng)lOmin，然后立即在冷水中冷卻，最后加入2. 4mL工業(yè)酒精，總體積3mL，放置IOmin后于560nm下比色，以不加酶液的反應(yīng)液作空白對照。L-半胱氨酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精確配制lmmol/L L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用蒸餾水稀釋至以下濃度:0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9，1. Ommol/L0 分別取 0. 2mL不同稀釋度的溶液加入0. 2mL冰醋酸，再加入0. 2mL酸性茚三酮試劑，于沸水浴中反應(yīng)lOmin，然后立即在冷水中冷卻，最后加入2. 4mL工業(yè)酒精，總體積3mL，放置IOmin后于 560nm下比色，以L-半胱氨酸的濃度為橫坐標(biāo)、以A56tlnm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力定義在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1微摩爾L-半胱氨酸產(chǎn)物所需的酶量定為一個(gè)酶活力單位。實(shí)施例2L-NCC酰胺水解酶的克隆及一級結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明人從假單胞菌I^seudomonas sp. QR-101中提取基因組DNA，然后用HindIII 酶切基因組DNA，用膠回收試劑盒從1. 2%的瓊脂糖凝膠上分別回收2-91Λ的HindIII酶切片段，將回收的酶切片段連接在經(jīng)相同酶切處理的PuclS載體上，轉(zhuǎn)入E. coli JM109中，在涂有X-gal和IPTG的平板上進(jìn)行藍(lán)白初篩。將上述含有插入片段的重組白色單菌落，分別挑入每孔含50 μ L LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L,酵母粉:5g/L,氯化鈉10g/L)，37 V過夜培養(yǎng)后，加入100 μ L 0. 75 % L-NCC作為底物，35°C振蕩30min，分別加入酸性茚三酮試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過微孔板復(fù)篩較高活性的重組子，并抽提質(zhì)粒，然后進(jìn)行DNA序列測定，結(jié)果顯示陽性重組子PU113中含有插入片段為2630bp，在其中位于748_2007bp間有一個(gè)完整的讀碼框，為1260bp(SEQ ID N02)，G+C含量為62. 78 %，編碼420aa，其計(jì)算分子量為 44. 41kD。將該 DNA 序列通過 GenBank Blast 發(fā)現(xiàn)，與來自 Pseudomonas sp. Strain BS 的atcC(GenBank :BAD15360. 1)的同源性為88 %，它們的核苷酸序列同源性為83%。因此， 本發(fā)明的L-NCC酰胺水解酶基因序列不同于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的類似酶的序列，它是一個(gè)新基因。實(shí)施例3大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建及重組L-NCC酰胺水解酶的表達(dá)根據(jù)實(shí)施例2測序結(jié)果，按照該蛋白質(zhì)編碼基因的兩末端序列設(shè)計(jì)引物Pl和P2， 其中上游 Pl :5，-CCG GAA TTC ATG AGT GGA GTC AAC AGC ATG AA-3，含有 EcoRI 酶切位點(diǎn)；下游引物 P2 5' -CCC AAG CTT TCA GCC GGT GCG GCT GTC CGC CA-3，含有 HindIII 酶切位點(diǎn)。以菌株I^seudomonas sp. QR-101的基因組為模板，按如下PCR程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增94°C變性lmin，66°C復(fù)性lmin，72°C延伸Imin，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和HindIII雙酶切后，連接到經(jīng)相同酶切后的載體 pET21a(+)，構(gòu)建重組子 pET_21a(+) /atcC。獲得的重組子pET-21a(+)/atCC采用CaC12法轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)鑒定后獲得BL21 (pET-21a(+)/atcC)工程菌。將BL21(pET_21a(+)/atcC)工程菌于37°C活化過夜，按1 100轉(zhuǎn)接到IOOmL含 100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期；加入終濃度為ImM的IPTG， 37°C繼續(xù)培養(yǎng)池；4°C，6，000r/min離心lOmin，收集菌體，加入0. lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)懸浮洗滌后，6，000r/min離心lOmin，收集菌體，重復(fù)洗滌一次，加入磷酸鉀緩沖液制成酶源細(xì)胞懸液，采用實(shí)施例1的方法測定相應(yīng)的酶活力，大腸桿菌基因工程菌酶源細(xì)胞的酶活可達(dá)1500U/g。取100g/L的酶源細(xì)胞懸液20mL，加入6. 25g/L的L-NCC底物溶液80mL混合，在 35°C下進(jìn)行催化反應(yīng)池，反應(yīng)完畢后的反應(yīng)液經(jīng)三氯乙酸去除蛋白后進(jìn)行薄層層析(展層液配比為異丙醇濃氨水=1 1)，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照，結(jié)果見圖6。從圖中可以看出，在第3道，酶催化L-NCC后的產(chǎn)物為L-半胱氨酸(圖中所示還有少部分底物L(fēng)-NCC未轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸)。實(shí)施例4以重組大腸桿菌的發(fā)酵菌體為酶源細(xì)胞，轉(zhuǎn)化L-NCC生產(chǎn)L-半胱氨酸L-NCC是酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC (或L-ATC)合成L-半胱氨酸過程的中間產(chǎn)物。L-ATC水解酶能夠催化水解L-ATC生成L-NCC，L-NCC再經(jīng)L-NCC酰胺水解酶催化生成終產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸，L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料工業(yè)。①酶反應(yīng)體系組成底物5g/L的 L-NCC反應(yīng)溫度;35°CPH 8. 0酶源細(xì)胞(實(shí)施例3制備):3g/L②酶的轉(zhuǎn)化率酶量為3g/L，底物L(fēng)-NCC的濃度為5g/L，反應(yīng)體系為3L，35°C反應(yīng)池后，在上述酶反應(yīng)的條件下，底物轉(zhuǎn)化率約為90%。
權(quán)利要求
1.一種L-NCC酰胺水解酶，是序列表SEQ ID No. 1中氨基酸殘基序列或?qū)EQ IDNo. 1 的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代或添加且具有與SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ IDNo. 1衍生的蛋白質(zhì)。
2.—種權(quán)利要求1所述的L-NCC酰胺水解酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)是序列表SEQID No. 2的核苷酸序列；2)編碼序列表中的SEQID No. 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列。
3.一種含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。
4.一種含有權(quán)利要求2所述基因的細(xì)胞體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞體系，其特征在于，所述的細(xì)胞體系為原核細(xì)胞系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求1所述的L-NCC酰胺水解酶在微生物酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-NCC酰胺水解酶)的基因序列及其重組表達(dá)蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的來源于假單胞菌(保藏號CGMCCNo.5315)的L-NCC酰胺水解酶是序列表中SEQIDNo.1的氨基酸殘基序列或?qū)EQIDNo.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代、缺失或添加具有與SEQIDNo.1相同活性的由SEQIDNo.1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明將來源于假單胞菌L-NCC酰胺水解酶基因克隆并表達(dá)制備重組酶，可用于生物法水解N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)獲得L-半胱氨酸，所以可以用于酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸。
文檔編號C12N15/70GK102409033SQ201110364640
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉磊, 姚瑞娟, 王文芳, 高智慧 申請人:天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司