一種嗜熱纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用。所述嗜熱纖維素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明提供了一個(gè)新的纖維素酶，可作應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶。
【專利說(shuō)明】
一種嗜熱纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成。纖維素是一種重要的 多糖，它是植物細(xì)胞支撐物質(zhì)的材料，是自然界最豐富的生物質(zhì)資源，纖維素的結(jié)構(gòu)確定為 β-D-葡萄糖單元經(jīng)β -（ 1-4)糖苷鍵連接而成的直鏈多聚體，結(jié)構(gòu)中沒(méi)有分支，其能夠被纖 維素酶降解為葡萄糖。
[0003]纖維素酶是指能夠水解葡萄糖苷鍵，將纖維素分解成纖維二糖和葡萄糖的一組酶 的總稱。其對(duì)纖維素的水解過(guò)程主要包括三步:第一步是內(nèi)切型纖維素酶作用于纖維素內(nèi) 部的無(wú)定形區(qū)，隨即水解β -（1-4)糖苷鍵將纖維素分子截短，隨后外切型纖維素酶，作用 于纖維素線狀分子末端，水解β -（1-4)糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，最后，葡萄糖 苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。
[0004] 纖維素酶已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開(kāi)采、精細(xì)化工 及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。纖維素酶廣泛存 在于細(xì)菌、放線菌、真菌、植物、動(dòng)物等生物中。不同的微生物產(chǎn)生的纖維素酶，其結(jié)構(gòu)和功 能差異較大。嗜熱纖維素酶與常溫纖維素酶相比具有諸多優(yōu)勢(shì)，如催化效率高，底物專一性 強(qiáng)，熱處理木質(zhì)纖維素時(shí)酶穩(wěn)定性好，因而對(duì)反應(yīng)體系具有良好的兼容性等。到目前為止， 嗜熱纖維素酶多來(lái)源于細(xì)菌，主要來(lái)源海棲熱孢菌屬、熱子囊菌T h e rm 〇 a s c u s aurantiacus)等。然而，高溫細(xì)菌來(lái)源的嗜熱纖維素酶表達(dá)量低，難以進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。
[0005] 目前商業(yè)化的纖維素酶主要由真菌產(chǎn)生，如木霉、青霉、曲霉等。真菌來(lái)源的纖維 素酶最適溫度多在4 5到65 °C之間，在高溫時(shí)容易喪失活性。本發(fā)明從嗜熱藍(lán)狀菌 Talaromyces leycettanus JCM 12802菌株中得到了一個(gè)新的纖維素酶基因，其編碼的纖 維素酶具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：嗜熱、酸性、廣泛的底物特異性、容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有這些優(yōu)點(diǎn)都 意味著新發(fā)明的纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會(huì)比以前報(bào)道的纖維素酶更有應(yīng) 用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種嗜熱、酸性、底物特異性比較廣泛的纖維素酶。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的基因。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶基因的重組菌株。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供一種制備纖維素酶的方法。
[0011] 本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用的新的纖維素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1:
[0014] 其中，該酶全長(zhǎng)409個(gè)氨基酸，N端18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列"MKFSNVILAA SASSLVLA" 。
[0015] 因此，成熟的嗜熱纖維素酶的理論分子量為42.5kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：
[0018] 該纖維素酶的最適pH為3.5，在pH2.5-pH5.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其60%以上的 酶活力；最適溫度80°C，在85°C時(shí)依然具有30%的酶活力，在70°C下處理60min，酶活基本不 損失，在75°C下處理5min，能夠保持70%以上的酶活力，在80°C下處理2min，能夠保持60% 以上的酶活力，具有良好的熱穩(wěn)定性。
[0019] 本發(fā)明還提供了編碼上述纖維素酶的基因。該酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所 示：
[0021]本發(fā)明通過(guò)PCR的方法分離克隆了這個(gè)纖維素酶基因，DNA全序列分析結(jié)果表明， 纖維素酶結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1464bp，含有4個(gè)內(nèi)含子，+96~162，+374~429，+495~551，+650~ 7.3為其內(nèi)含子序列，cDNA長(zhǎng)1230bp，其cDNA序列如SEQIDN0.4所示 ：
[0023]其中，信號(hào)肽的堿基序列為：
[0025] 因此，成熟基因的編碼序列為
[0026] SEQIDN0.5K*:

[0029] 該酶屬于糖基水解酶第5家族。將纖維素酶基因 cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列 在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)確定該纖維素酶是一種新的纖維素酶。
[0030] 本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組載體，優(yōu)選為畢赤酵母表達(dá)載體。 將本發(fā)明的纖維素酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可 操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將纖維素酶 基因 cDNA插入到質(zhì)粒pPIC9上的SnaBI和Notl限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于 Α0Π 啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。
[0031] 本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組畢赤酵母菌株。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種制備纖維素酶的方法，包括以下步驟：
[0033] 1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0034] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組纖維素酶的表達(dá)；以及
[0035] 3)回收并純化所表達(dá)的纖維素酶。
[0036] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母（Pichia pastoris)細(xì)胞、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞或多型漢遜酵母(Hansenula polymorpha)細(xì)胞，優(yōu)選將 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris)GS115,得到重組菌株。
[0037] 本發(fā)明還提供了上述纖維素酶的應(yīng)用。運(yùn)用基因工程手段來(lái)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)纖維素 酶。本發(fā)明提供了一個(gè)新的纖維素酶，可作應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技 術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶。
【附圖說(shuō)明】
[0038]圖1纖維素酶在畢赤酵母中表達(dá)的SDS-PAGE分析。
[0039]圖2本發(fā)明重組纖維素酶的最適pH值。
[0040]圖3本發(fā)明纖維素酶的pH穩(wěn)定性。
[0041 ]圖4本發(fā)明纖維素酶最適反應(yīng)溫度。
[0042]圖5本發(fā)明纖維素酶熱穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 試驗(yàn)材料和試劑
[0044] 1、菌株及載體:畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)為本實(shí)驗(yàn)室保存;畢赤酵母表 達(dá)載體pPIC9及菌株GS115購(gòu)自于Invitrogen公司。
[0045] 2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自Invitrogen公司，其 它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到）。
[0046] 3、培養(yǎng)基：
[0047] (I)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：30g/L麥麩，30g/L玉米芯粉，30g/L豆柏，5g//L大麥葡聚糖，5g/L (NH4)S〇4，lg/L KH2P〇4,0.5g/LMgS〇4 · 7H20,0.01g/L FeS〇4 · 7H20,0.2g/L CaCl2于 1L去離 子水中，121°C，15鎊條件下滅菌處理20min
[0048] (2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(126蛋白胨、0.5%酵母提取物、126NaCI，pH7.0)。
[0049] (3 )BMGY 培養(yǎng)基；1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1 · 34 % YNB，0 · 000049〈Biot in，1 % 甘 油(v/v) 〇
[0050] (4)BMMY培養(yǎng)基:除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4.0。
[0051] 說(shuō)明：以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書 進(jìn)行。
[0052] 實(shí)施例1纖維素酶編碼基因的克隆
[0053] 提取Talaromyces 1 eycettanus JCM 12802基因組DNA，設(shè)計(jì)克隆引物F : atgaagttttccaacgtgattcttgcggc和R:ctacaggcactggtagtaataggggttcag，以Talaromyces leycettanus JCM 12802總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95°C5min;94°C30sec， 60°〇3086(：，72 1€6086(3,30個(gè)循環(huán)，72°(：101^11。得到一約1.51^6?片段，測(cè)序正確后獲得全長(zhǎng) 基因。
[0054] 提取Talaromyces leycettanus JCM 12802總RNA，利用01igo(dT)2〇和反轉(zhuǎn)錄酶得 到cDNA的一條鏈，然后設(shè)計(jì)擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框的引物F和R，擴(kuò)增該單鏈cDNA，獲得纖維素酶的 cDNA序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送測(cè)序。
[0055]通過(guò)對(duì)纖維素酶的基因組序列和cDNA序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該纖維素酶結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng) 1464bp，含有4個(gè)內(nèi)含子，cDNA長(zhǎng)1230bp，編碼409個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，N端18個(gè)氨基 酸為其信號(hào)肽序列，經(jīng)比對(duì)證明從Talaromyces leycettanus JCM12802中分離克隆得到的 編碼纖維素酶的基因?yàn)樾禄颉?br>[0056]實(shí)施例2纖維素酶工程菌株的構(gòu)建 [0057] (1)表達(dá)載體的構(gòu)建及在酵母的表達(dá)
[0058]以測(cè)序正確的纖維素酶的cDNA為模板，設(shè)計(jì)合成了帶有SnaB I和Not I限制性酶 切位點(diǎn)的弓丨物cdna-sF : acttacgtagctcccaagagcaagaccaagcgcacatc和cdnaR : atagcggccgcctacaggcactggtagtaataggggttcag，對(duì)纖維素酶的成熟蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò) 增。并利用SnaB I和Not I酶切PCR產(chǎn)物，連接進(jìn)入表達(dá)載體pPIC9(Invitrogen，San Diego)，纖維素酶成熟蛋白的序列插入到上述表達(dá)載體的信號(hào)肽序列的下游，與信號(hào)肽形 成正確的閱讀框架，構(gòu)建成酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn) 行DNA測(cè)序，測(cè)序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶Bgl II進(jìn) 行線性化表達(dá)質(zhì)粒載體DNA，電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，30 °C培養(yǎng)2-3天，挑取在MD平 板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)實(shí)驗(yàn)，具體操作請(qǐng)參考畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)。
[0059]以同樣的方式構(gòu)建含纖維素酶信號(hào)肽序列的cDNA的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化。
[0060] (2)高纖維素酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選
[0061]用滅過(guò)菌的牙簽從長(zhǎng)有轉(zhuǎn)化子的MD板上挑取單菌落，按照編號(hào)先點(diǎn)到MD平板上， 將MD平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天，至菌落長(zhǎng)出。按編號(hào)從MD平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種 于裝有3mL BMGY培養(yǎng)基的離心管中，30°C、220rpm搖床培養(yǎng)48h;將搖床培養(yǎng)48h的菌液3， 000 X g離心15min，去上清，離心管中再加入lmL含有0 · 5 %甲醇的BMMY培養(yǎng)基，在30 °C、 220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng);誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，3，000 X g離心5min，取上清用于酶活性檢測(cè)，從中篩選出 高纖維素酶活性的轉(zhuǎn)化子，具體操作請(qǐng)參考畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)。
[0062] 實(shí)施例3重組纖維素酶的制備
[0063] (1)纖維素酶基因在畢赤酵母中搖瓶水平的大量表達(dá)
[0064]篩選出酶活較高的轉(zhuǎn)化子，接種于300mL BMGY液體培養(yǎng)基的1L三角瓶中，30°C， 220rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h; 5，OOOrpm離心5min，輕柔棄上清，再向菌體加入100mL含有0.5 % 甲醇的BMMY液體培養(yǎng)基，30°C，220rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)72h。誘導(dǎo)培養(yǎng)期間，間隔24h補(bǔ)加一次甲醇 溶液以補(bǔ)償甲醇的損失，使甲醇濃度保持在〇. 5 %左右；（3) 12，000 X g離心1 Omin，收集上清 發(fā)酵液，檢測(cè)酶活性并進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析(圖1)。
[0065] (2)重組纖維素酶的純化
[0066]收集搖瓶表達(dá)的重組纖維素酶上清液，通過(guò)10kDa膜包進(jìn)行濃縮，同時(shí)用低鹽緩沖 液置換其中的培養(yǎng)基，然后用l〇kDa超濾管進(jìn)一步的濃縮。濃縮能稀釋到一定倍數(shù)的重組纖 維素酶，通過(guò)離子交換層析進(jìn)行純化。具體地，取重組纖維素酶濃縮液2. OmL經(jīng)預(yù)先用20mM Tris_HCl(pH 7.5)平衡過(guò)的HiTrap Q Sepharose XL陰離子柱，然后用〇-lmol/L的NaCl進(jìn) 行線性梯度洗脫，對(duì)分步收集的洗脫液檢測(cè)酶活性和進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。
[0067]實(shí)施例4重組纖維素酶部分性質(zhì)分析
[0068]采用DNS法對(duì)本發(fā)明的纖維素酶進(jìn)行活性分析。具體方法如下:在pH 3.5,80°C條 件下，lmL的反應(yīng)體系包括100yL適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00yL底物，反應(yīng)lOrnin，加入1.5mL DNS 終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測(cè)定0D值。纖維素酶活性單位定義:在一定條件下，每 分鐘分解羧甲基纖維素生成Uimol還原糖所需的酶量為1個(gè)活性單位(U)。
[0069] (1)纖維素酶的最適pH及pH穩(wěn)定性
[0070]經(jīng)純化的實(shí)施例4表達(dá)的纖維素酶在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。 所用緩沖液為pH 1.0~3.0甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH2.2~8.0的檸檬酸一磷酸氫二鈉系列緩 沖液，pH 8.0~9. OTris-HC緩沖液，1ρΗ9.0~12甘氨酸-NaoH系列緩沖液。純化的纖維素酶 在不同pH的緩沖體系。80°C下測(cè)定的pH適性結(jié)果（圖2)表明：。該纖維素酶的最適pH為3.5， 在pH2.5-pH5.0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其60%以上的酶活力。
[0071] 將酶液在不同pH值的緩沖液中于37 °C下處理60min，再測(cè)定酶活性以研究酶的pH 穩(wěn)定性。結(jié)果表明（圖3)，分析結(jié)果表明該酶在pH2.0-pHl 1.0之間穩(wěn)定，具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定 性。
[0072] (2)纖維素酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性
[0073]純化的纖維素酶在pH 3.5條件下，測(cè)定不同溫度(40-90°C )下的酶活性，分析實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明顯示，最適溫度80 °C，在85 °C時(shí)依然具有30 %的酶活力（圖4)，在70 °C下處理 6〇111；[11，酶活基本不損失，在75<€下處理51]1；[11，能夠保持70%以上的酶活力，在80 <€下處理 2min，能夠保持60%以上的酶活力，具有良好的熱穩(wěn)定性(圖5)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嗜熱纖維素酶，其特征在于，所述嗜熱纖維素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或 SEQ ID NO .2所示。2. -種嗜熱纖維素酶基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的嗜熱纖維素酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜熱纖維素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。4. 包含權(quán)利要求2所述纖嗜熱纖維素酶基因的重組表達(dá)載體。5. 包含權(quán)利要求2所述纖嗜熱纖維素酶基因的重組菌株。6. -種權(quán)利要求1所述的嗜熱纖維素酶的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： 1) 構(gòu)建包含權(quán)利要求2所述纖嗜熱纖維素酶基因的重組表達(dá)載體； 2) 以獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株； 3) 表達(dá)并分離權(quán)利要求1所述的嗜熱纖維素酶。7. 權(quán)利要求1所述的嗜熱纖維素酶的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK105886484SQ201610262105
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月25日
【發(fā)明人】姚斌, 羅會(huì)穎, 鄭菲, 王苑, 蘇小運(yùn), 柏映國(guó), 黃火清, 王亞茹, 馬銳
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所