一種木聚糖酶XynRBM26及其編碼基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物和基因工程技術領域，尤其涉及的是一種木聚糖酶XynRBM26 及其編碼基因。
【背景技術】
[0002] 木聚糖是植物細胞壁中半纖維素的主要組成成分，其完全水解需要木聚糖酶 和木糖苷酶等多種酶的協(xié)同作用，木聚糖酶包括內切-I，4_f3-D-木聚糖酶（endo-1， 4_β -D_xylanase，EC 3. 2. 1. 8)和 a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶（a -L-arabinofuranosidase， EC 3· 2.I.55)等（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005,29:3-23)。內切-1， 4- β -D-木聚糖酶能水解木聚糖主鏈的β -I，4糖苷鍵，是木聚糖降解過程中發(fā)揮最主要作 用的酶。由于木聚糖酶具有降解植物木聚糖的作用，被廣泛應用于食品、飼料、釀酒、造紙、 麻類脫膠和燃料生產等工業(yè)領域。
[0003] 植食性動物胃腸道中存在豐富的與木質纖維素降解有關的多種酶類，但不同動 物之間存在差異（Hess et al.Science，2011，331:463-467;Dai et al.PLoS 0ne，2012， 7:e40430)。近年來，研宄者通過微生物分離培養(yǎng)和宏基因組學等方法從天牛胃腸道、奶牛 瘤胃、山羊瘤胃等動物中獲取了多種木聚糖酶（Zhou et al. J Ind Microbiol Biotechnol， 2011,38:523-530 ；Cheng et al. J Agric Food Chem,2012,60:12516-12524 ；ffang et al. Bioresour Technol，2011，102:3330-3336)。漬金絲猴（Rhinopithecus bieti)是典型 的植食性靈長類動物，由于攝食種類和物種的差異，其胃腸道中可能蘊含有不同于其它動 物的新的微生物木聚糖酶基因資源，但到目前為止，還未見滇金絲猴胃腸道微生物來源相 關酶基因的報道。
[0004] 木聚糖酶來源比較廣泛，在細菌、真菌、陸地植物組織中都存在（Collins et al. FEMS Microbiol Rev，2005, 29:3-23)，其中微生物主要來源于芽孢桿菌屬（Bacillus)、 曲霉屬（Aspergillus)、里氏木霉屬（Trichoderma)等，然而來自Massilia的木聚糖 酶尚未見報道。不同菌屬來源的木聚糖酶酶學性質差異較大（Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem，2000,64:1230-1237 ;Gessesse et al. Appl Environ Microbiol， 1998,64:3533-3535)，因此研宄鑒定不同來源的木聚糖酶對其在不同領域的應用具有重要 意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述木聚糖酶的基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組表達載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供用所述的重組表達載體轉化宿主細胞所得的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明從滇金絲猴糞便中分離到Massilia sp. RBM26,通過基因組測序，獲得第10 家族的木聚糖酶編碼基因，并將其轉入大腸桿菌進行異源表達和重組酶的酶學特性分析， 發(fā)現(xiàn)獲得的木聚糖酶XynRBM26在高濃度NaCl下仍然具有催化活性，可應用于高鹽食品和 海產品加工及其它高鹽環(huán)境生物技術領域，且本發(fā)明中的木聚糖酶來源于動物胃腸道，因 此其性質具有進一步應用于飼料等領域的潛力。
[0010] 本發(fā)明所述木聚糖酶XynRBM26可得自Massilia sp. RBM26,其編碼基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本發(fā)明所述木聚糖酶XynRBM26的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共383個氨基 酸，其理論分子量為43. 17kDa。
[0012] 本發(fā)明的木聚糖酶XynRBM26的最適pH值為5. 5，在ρΗ5· 0-7. 0之間可以保持90 % 以上的酶活性；在pH5. 0-10. 0的緩沖液處理lh，酶活力剩余82%以上；最適反應溫度為 45°C，在37°C、45°C和50°C下處理lh，剩余酶活分別為95. 6%、81. 2%和59. 7% ;反應體系 中0. 5-1. 5M的NaCl對酶活影響較小，在5M時仍可以保持86%的活性；經0. 5-5M的NaCl 在37°C下處理lh，發(fā)現(xiàn)0.5-3. 5M的NaCl可提高酶活；在反應體系中加入10% (v/v)的乙 醇進行酶促反應，可保持50 %的酶活性，酶經3. 0-15. 0% (v/v)的乙醇在37°C下處理lh， 該酶仍能保持80%左右的酶活性；在pH5. 5及45°C下該酶對0. 5% (w/v)的燕麥木聚糖、 山毛櫸木聚糖能有效地水解，而不能水解羧甲基纖維素鈉、昆布多糖和β -葡聚糖、微晶纖 維素、p-nitrophenyl- β -D_xylopyranoside〇
[0013] 本發(fā)明通過基因組測序的方法克隆了木聚糖酶的編碼基因 XynRBM26,其全長為 1152bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。
[0014] 本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重組載體，優(yōu)選為 pEasy-E2-XynRBM26。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達載體中，使其核苷酸序列與表達 調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，將本發(fā)明木聚糖酶基因和表達載 體pEasy-E2通過T-A方式相連接，得到重組大腸桿菌表達質粒pEasy-E2_XynRBM26。
[0015] 本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因 XynRBM26的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為 大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21 (DE3)/XynRBM26。
[0016] 本發(fā)明制備木聚糖酶XynRBM26的方法按以下步驟進行：
[0017] 1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
[0018] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶基因 XynRBM26表達；
[0019] 3)回收并純化所表達的木聚糖酶XynRBM26。
[0020] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /XynRBM26。
[0021] 本發(fā)明提供了一個新的木聚糖酶基因，其編碼的木聚糖酶最適pH為5. 5,最適溫 度為45°C，在反應體系中加入5M的NaCl仍然具有86%的酶活，酶經2M NaCl在37°C下處 理lh，活性高達120%;該酶能有效地水解燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖，而不能水解羧甲基纖 維素鈉、昆布多糖和β _葡聚糖、微晶纖維素、P_nitrophenyl- β -D-xylopyranoside。以上 性質表明本發(fā)明的木聚糖酶作為一種新型的酶制劑，可廣泛應用于飼料、食品和生物燃料 等行業(yè)。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :在大腸桿菌中表達的重組木聚糖酶XynRBM26的SDS-PAGE分析，其中，1 : 500mM咪挫洗脫親和于Nickel-NTA Agarose中的重組XynRBM26 ;M :蛋白質Marker。
[0023] 圖2 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的pH活性。
[0024] 圖3 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的pH穩(wěn)定性。
[0025] 圖4 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的熱活性。
[0026] 圖5 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的熱穩(wěn)定性。
[0027] 圖6 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的NaCl抗性。
[0028] 圖7 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的NaCl穩(wěn)定性。
[0029] 圖8 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的乙醇抗性。
[0030] 圖9 :純化的重組木聚糖酶XynRBM26的乙醇穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0031] 以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0032] 試驗材料和試劑
[0033] 1、菌株及載體：Massilia sp. RBM26是本研宄室2013年從我國云南省維西縣白馬 雪山國家級自然保護區(qū)的滇金絲猴糞便微生物中分離得到，其16s rRNA基因序列比對結 果與 Massilia aurea shain AP13(NR_042502)的相似性為 99%。大腸桿菌 Escherichia coli BL21 (DE3)和表達載體pEasy-E2購于北京全式金生物技術有限公司。
[0034] 2、酶類及其他生化試劑：DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；山毛櫸木聚糖 (Beechwood xylan)、p-nitrophenyl-β -D-xylopyranoside 購自 Sigma 公司；燕麥木聚糖 (Xylan from oat spelts)購自 SERVA 公司；Genomic DNA Clean&Concentration 試劑盒購 自 Zymo Research 公司，TureseqTM DNA Sample Preparation Kit 購自 Illumima 公司，其 它都為國產試劑（均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0035] 3、培養(yǎng)基：
[0036] LB 培養(yǎng)基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸饋水至 1000ml，pH 自 然（約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎上加2. 0% (w/v)瓊脂。
[0037] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。
[0038] 實施例1 :木聚糖酶基因 XynRBM26的克隆
[0039] 提取Massilia sp. RBM26基因組DNA:將