一種D型β-葡萄糖苷酶突變體及其表達質(zhì)粒和重組菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種D型β -葡萄糖苷酶突變體及其表達質(zhì)粒和重組菌，具體涉及的 是一種酶活性顯著提高的D型β-葡萄糖苷酶突變體及其表達質(zhì)粒和重組菌，屬于生物工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] D型β -葡萄糖苷酶（β -D-吡喃葡萄糖苷水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 21)是一類能水解 苷類和寡糖的糖苷鍵并釋放非還原性末端葡糖殘基的酶。這些酶普遍存在于所有領(lǐng)域的生 命體中，在古細(xì)菌、真細(xì)菌和真核生物中發(fā)揮多種功能和作用。包括微生物內(nèi)的生物質(zhì)轉(zhuǎn) 換、動物體糖脂和外源性糖苷的降解、細(xì)胞壁寡糖的木質(zhì)化和分解代謝、防御、植物激素結(jié) 合共軛激活作用、植物中氣味釋放以及植物-微生物和植物-昆蟲相互作用等。
[0003] 白蟻是自然界中纖維素的最主要消耗者，白蟻主要通過內(nèi)源和外源纖維素酶的協(xié) 同作用分解纖維素，最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖。白蟻體內(nèi)就是一個微型的生物發(fā)酵器，若能模擬白 蟻的纖維素酶降解系統(tǒng)，工業(yè)化纖維素-葡萄糖-酒精-燃料的生產(chǎn)體系必是解決當(dāng)前環(huán) 境問題能源危機的一條重要途徑。
[0004] 至今，國內(nèi)外對白蟻體內(nèi)的內(nèi)源性D型β-葡萄糖苷酶的研宄已經(jīng)逐步加深， 目前人們主要集中在對該酶進行結(jié)構(gòu)功能研宄，并通過改造獲得高表達、高活性的D型 β-葡萄糖苷酶用于工業(yè)經(jīng)濟應(yīng)用（Zhang，etal.，2010)。目前已有的研宄顯示，該類 纖維素水解酶的催化效率較低、人工提取和表達的酶純化難度較大，若能通過同源建模 等手段進行理性分子設(shè)計，對白蟻內(nèi)源性D型β-葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、穩(wěn)定性、 底物特異性、耐熱性和耐酸堿性等進行合理化改造，將使此類酶具有更大的應(yīng)用前景，實 現(xiàn)巨大工業(yè)經(jīng)濟價值。Hsiao-Iin Lee等人（Mutations in the substrate entrance region of β -glucosidase from Trichoderma reesei improve enzyme activity and thermostability)已經(jīng)在來源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶中研宄了突變后的酶，獲得了 一些活性增強的突變體。
[0005] 本發(fā)明從臺灣家白蟻的cDNA中克隆得到D型β -葡萄糖苷酶CfBG GlulD，根據(jù) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和同源性序列分析，找出了一系列突變位點，在這些氨基酸位點上進行點 突變，得到了一系列突變體酶。經(jīng)過蛋白質(zhì)表達與驗證，發(fā)現(xiàn)有幾個突變體酶的催化活性顯 著增強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種酶活性提高的D型β-葡萄糖苷酶突變體。本發(fā)明通 過基因工程手段對D型β -葡萄糖苷酶進行基因體外克隆和定點突變，然后將含有突變點 基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌宿主細(xì)胞中進行表達，得到5個酶活性顯著提高的D型 β-葡萄糖苷酶突變體。
[0007] 所述親本D型β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 突變體的表示方法為：GlulD-原始氨基酸-位置-替換的氨基酸 所述突變體是將第182位的酪氨酸Y分別變?yōu)樯彼醀、亮氨酸L ;第194位的甲硫氨酸 M分別變?yōu)榱涟彼酟、苯丙氨酸F ;第244位的天冬氨酸D變?yōu)榻M氨酸H。分別表示為611110_ Y182W、GlulD- Y182L、GlulD- M194L、GlulD- M194F、GlulD- D244H。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種包含有D型β-葡萄糖苷酶突變體DNA序列的突變 質(zhì)粒； 本發(fā)明的另一目的是提供一種含有上述突變質(zhì)粒的重組突變菌株。
[0010] 所述突變體構(gòu)建的具體步驟如下： (1)突變體表達菌株的構(gòu)建 本發(fā)明從實驗室飼養(yǎng)的臺灣家白蟻的唾液腺和腸道組織中，提取出RNA， 經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。
[0011] 依據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中的臺灣家白蟻的β-葡萄糖苷酶基因（GenBank登錄號為 JN565080 )，根據(jù)序列同源性，設(shè)計擴增引物，以得到的白蟻cDNA為模板進行PCR擴增，加上 限制酶班fld III和ZAo I的酶切位點，PCR擴增后的產(chǎn)物插入到載體pET-28a(Novagen公 司）上的相應(yīng)多克隆位點之間，轉(zhuǎn)化入DH5 a (Novagen公司）感受態(tài)細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn) 化子，測序后與已有的序列（/#撕5?卻）比對，不完全相同，將本實驗室得到的此重組質(zhì)粒稱 為 pET-28a-GlulD。
[0012] 將重組質(zhì)粒 pET-28a_GlulD 轉(zhuǎn)化入 feoh·· BL21 (DE3) (Novagen 公司）進行表達， 得到的β -葡萄糖苷酶稱為D型β -葡萄糖苷酶（CfBG GlulD)。
[0013] 我們在此酶的基礎(chǔ)上，對其基因進行突變改造，以pET-28a-GlulD為模板，設(shè)計含 有突變位點的核苷酸序列引物，并通過PCR進行定點突變得到目的產(chǎn)物，用Dpn I消化去除 模板DNA后，進行瓊脂糖凝膠電泳割膠回收目的片段，用T4 DNA連接酶進行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn) 化到及?o/i. DH5 a (Novagen公司）感受態(tài)細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒測序驗證，得到含 有突變后目的基因的重組質(zhì)粒稱為pET-28a- GlulD-X (X為原始氨基酸-位置-突變后氨 基酸)，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen公司）感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到含 目的突變的表達菌株。
[0014] (2)突變體表達菌株的誘導(dǎo)表達 將突變體大腸桿菌表達菌株活化后，轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL的卡 那霉素）中振蕩培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑IPTG，振蕩培養(yǎng)后收集菌液，離心收集菌體，超聲波破 碎細(xì)胞，離心取上清即得到CfBG GlulD的突變體酶，測定酶的催化活性。
[0015] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明通過對臺灣家白蟻的D型β-葡萄糖苷酶（CfBG GlulD)的體外表達，并在其基 礎(chǔ)上進行點突變，發(fā)現(xiàn)其中有5個突變體酶的活性有顯著增強。即第182位的酪氨酸Y分 別突變?yōu)樯彼醀、亮氨酸L ;第194位的甲硫氨酸M分別突變?yōu)榱涟彼酟、苯丙氨酸F ;第 244位的天冬氨酸D變?yōu)榻M氨酸Η，所得到的D型β -葡萄糖苷酶突變體的酶活性與突變前 的相比分別提高了 94. 6、92. 9、100. 3、71. 4、69. 9倍。該酶的活性有了大幅度的提高，這對 現(xiàn)今降解生物質(zhì)尤其是纖維素類具有重大的意義，可以使自然界中的秸桿等在葡萄糖 苷酶的促進催化作用下，更好更快速的降解產(chǎn)生葡萄糖，實現(xiàn)催化過程的高效優(yōu)化。產(chǎn)生的 葡萄糖又可以進一步參與更多的工業(yè)過程，如生物燃料乙醇的生產(chǎn)，生物洗滌劑等一系列 相關(guān)工藝。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明中所得的突變體的核苷酸序列發(fā)生突變的位點示意圖，箭頭指向為 突變位點； 圖2為本發(fā)明構(gòu)建的突變株以及原始菌株表達酶的酶活性情況。
【具體實施方式】
[0017] 下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0018] 實施例1 :突變表達質(zhì)粒的構(gòu)建及重組大腸桿菌突變體表達菌株的獲得 1.突變表達質(zhì)粒的構(gòu)建 通過基因工程手段對D型β-葡萄糖苷酶進行基因體外克隆和定點突變，具 體過程如下： 從實驗室飼養(yǎng)的臺灣家白蟻的唾液腺和腸道組織中，提取出RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，得到 cDNAo
[0019] 在NCBI基因數(shù)據(jù)庫查到臺灣家白蟻的β-葡萄糖苷酶基因（/#你5?卻)，根據(jù)序列 同源性，設(shè)計擴增引物，以得到的白蟻cDNA為模板進行擴增，加上限制酶Z/i/xl III和通〇 I 的酶切位點，PCR擴增后的產(chǎn)物插入到載體pET-28a (Novagen公司）上的相應(yīng)多克隆位點 之間，轉(zhuǎn)化入價〇7i. DH5 a (Novagen公司）感受態(tài)細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子，測序后與已有的序 列（/#你5?汾?）比對，不完全相同，本實驗室得到的此重組質(zhì)粒稱為pET-28a-GlulD。
[0020] 帶有限制酶III和ZAo I的酶切位點的擴增引物序列如下： F:Hind III 5' - CCCAAGCTTGCATGAGAGTTTTTCCTCCAAG R:Xho I 5'- CCGCTCGAGTTAAACTCCTTCTGTGCG 將重組質(zhì)粒pET-28a-GlulD轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3) (Novagen公司）進行表達，得到 的β -葡萄糖苷酶稱為D型β -葡萄糖苷酶（CfBG GlulD)。
[0021] 我們在此酶的基礎(chǔ)上，對其基因進行突變改造，以pET-28a-GlulD為突變模板，設(shè) 計含有突變位點的核苷酸序列引物，并以pET-28a-GlulD為擴增模板，通過PCR進行定點突 變得到目的產(chǎn)物。
[0022] 用于定點突變的引物為：（下劃線部分為突變位點） Y182W -F ：P~TGGACTTCTTGTATGCAAGG Y182W -R ：P-AGGTTCATTGAAAGTTGAC Y182L-F ：P~SYGACTTCTTGTATGCAAGG Y182L-R ：P-AGGTTCATTGAAAGTTGAC M194L -F =P-YffCGCTCCTGGAAGGAATATTC M194L -R ：P-GGAACCATATTGATATCCTTG M194F -F=P-YffCGCTCCTGGAAGGAATATTC M194F -R ：P-GGAACCATATTGATATCCTTG D244H-F ：P~GTCANTGGCAAGAGCCTTATAC D244H-R ：P-AATTAACTGCGATTGAAATTG PCR反應(yīng)體系如下：
【主權(quán)項】
1. 一種重組質(zhì)粒，稱為pET-28a-GlulD，其特征在于，所述重組質(zhì)粒源于pET-28a，并 包含有白蟻的葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列，其中所述白蟻的葡萄糖苷酶基因的 GenBank登錄號為JN565080。
2. -種D型0-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述D型0-葡萄糖苷酶由權(quán)利要求1所述 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入價〇7i.BL21 (DE3)表達所得。
3. -種D型0 -葡萄糖苷酶突變體，其特征在于，所述突變體是對權(quán)利要求2所述的D 型e-葡萄糖苷酶進行定點突變得到。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種D型0 -葡萄糖苷酶突變體，其特征在于，所述突變體的 氨基酸序列為以下任意一項所述： (1)SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的第182位的酪氨酸Y變?yōu)樯彼醀或亮氨酸L; (2)SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的第194位的甲硫氨酸M變?yōu)榱涟彼酟或苯丙氨酸 F； (3) SEQIDNO. 1所示氨基酸序列的第244位的天冬氨酸D變?yōu)榻M氨酸H。
5. 編碼如權(quán)利要求4所述的一種D型0 -葡萄糖苷酶突變體的DNA序列。
6. -種突變質(zhì)粒，稱為pET-28a-GlulD-X，其特征在于，所述質(zhì)粒包含有權(quán)利要求5所 述的D型0 -葡萄糖苷酶突變體的DNA序列，其中X為原始氨基酸-位置-突變后氨基酸。
7. -種突變體表達重組菌株，其特征在于，所述菌株包含有權(quán)利要求6所述的突變質(zhì) 粒。
8. -種C型0 -葡萄糖苷酶突變體酶，其特征在于，所述突變體酶由IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo) 權(quán)利要求7所述的突變體表達菌株獲得。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種D型β-葡萄糖苷酶突變體及其表達質(zhì)粒和重組菌，具體涉及的是一種酶活性顯著提高的D型β-葡萄糖苷酶突變體及其表達質(zhì)粒和重組菌，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明將來源于臺灣白蟻的β-葡萄糖苷酶進行定點突變，將第182位的酪氨酸Y分別變?yōu)樯彼醀、亮氨酸L；第194位的甲硫氨酸M分別變?yōu)榱涟彼酟、苯丙氨酸F；第244位的天冬氨酸D變?yōu)榻M氨酸H，分別表示為Glu1D- Y182W、Glu1D- Y182L、Glu1D- M194L、Glu1D- M194F、Glu1D- D244H；本發(fā)明所述的突變體的酶活性與突變前相比分別提高了94.6、92.9、100.3、71.4、69.9倍；本發(fā)明所得β-葡萄糖苷酶突變體酶活性有了大幅度的提高，為工業(yè)化應(yīng)用提供了有利的基礎(chǔ)，更能滿足社會生產(chǎn)的要求，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15-70, C12N1-21, C12N15-56, C12N9-42
【公開號】CN104726432
【申請?zhí)枴緾N201410801030
【發(fā)明人】施海峰, 馮婷婷, 劉海濤, 王繼峰, 吳黎明, 周陽
【申請人】江蘇大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2014年12月22日