專利名稱：一種雜合酶P450sca2-BMR及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜合酶P450sca2-BMR及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著冠心病成為當(dāng)今社會(huì)的主要致命病癥之一，研究高效的調(diào)血脂藥物成為制藥 工業(yè)的一個(gè)重要的目標(biāo)和責(zé)任。利用化學(xué)法羥基化美伐他汀生產(chǎn)普法他汀在經(jīng)濟(jì)上是不可 行的，生物法簡(jiǎn)單易行逐漸發(fā)展成普法他汀的主要生產(chǎn)方法。普法他汀的生物法工業(yè)生產(chǎn) 是兩步發(fā)酵過(guò)程，首先由橘青霉(Penicillium citrinum)發(fā)酵生產(chǎn)美伐他汀，由濃堿處理 為鈉鹽形式，再利用微生物轉(zhuǎn)化的方法將美伐他汀鈉羥基化生成普法他汀鈉。野生型細(xì)胞色素P450SCa-2是含有410個(gè)氨基酸的蛋白，存在于澳大利亞 土樣中發(fā)現(xiàn)的嗜碳鏈霉菌 Sti^ptomyces Carbophilus 中(Matsuoka T, Miyakoshi S. PureCytochrome P_450Enzyme are Obtained from Streptomyces CarbophiIus and Used forHydroxylation especially ofMacrolide Antibiotics :Japan, US5179013A. 1993-01-12.)。該菌株對(duì)美伐他汀具有強(qiáng)羥基化作用并且副產(chǎn)物很少，因而用 于普法他汀的生物法工業(yè)生產(chǎn)，其中其主要催化作用的是細(xì)胞色素P450sCa-2。生物法發(fā)酵 美伐他汀生產(chǎn)普伐他汀的過(guò)程具有低效高成本等劣勢(shì)，因此通過(guò)重組表達(dá)和改造細(xì)胞色素 P450sca-2實(shí)現(xiàn)酶法生產(chǎn)普伐他汀具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。細(xì)胞色素P450sca-2催化美伐他汀羥基化生成普伐他汀的過(guò)程是典型的細(xì)胞色 素P450催化小分子有機(jī)物單加氧反應(yīng)的過(guò)程。野生型細(xì)胞色素P450sCa-2催化體系屬于 雙組分細(xì)胞色素P450催化體系，需要氧化還原輔酶的協(xié)助將來(lái)自NAD (P) H的電子傳遞到細(xì) 胞色素P450的活性中心。不同于其他雙組分細(xì)胞色素P450催化體系，細(xì)胞色素P450sca-2 的催化體系不是結(jié)合在膜結(jié)合錨點(diǎn)上而是存在于細(xì)胞液中。電子在不同蛋白分子間的傳遞 影響了體系的電子傳遞效率和利用率，也影響了細(xì)胞色素P450sca酶的催化活性。因此希 望通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞色素P450sca-2雜合酶實(shí)現(xiàn)電子的自給自足，設(shè)計(jì)出滿足酶法生產(chǎn)普伐他 汀工業(yè)需求的蛋白。細(xì)胞色素P450BM3是人們發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)單組分體系細(xì)胞色素P450酶，最早 由 Fulco 等在 Bacillus megaterium 中獲取(Narhi L 0, Fulco A J. Phenobarbital Induction of aSoluble Cytochrome P-450-dependent Fatty Acid Monooxygenase in Bacillus megaterium. The Journal ofBiological Chemistry. 1982,257 (5) 2147-2150.)。細(xì)胞色素P450BM3電子傳遞效率高于大部分其它細(xì)胞色素P450酶，其結(jié)構(gòu) 和空間折疊為酶體系提供了有效的自給自足的電子傳遞系統(tǒng)，可將NAD(P)H產(chǎn)生的電子 100%用于產(chǎn)物生成，催化效率也遠(yuǎn)高于許多其它酶系統(tǒng)，為研究細(xì)胞色素P450單加氧催 化體系的電子傳遞機(jī)制和進(jìn)行雜合酶設(shè)計(jì)提供了良好的參照。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有羥基化美伐他汀的催化活性的蛋白。
本發(fā)明提供的蛋白，命名為P450sca2-BMR，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有羥基化美伐他汀的催化活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中序列2所示的蛋白有1010個(gè)氨基酸殘基，第1-410位為P450sca的酶功 能域(HEME功能域)、第411-432位為連接肽、第433-1010位為P450BM3的天然氧化還原 域。蛋白P450sca2-BMR的具體示意圖如圖1所示。為了使1)中的P450sca2_BMR便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序 列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述幻中的P450sca2-BMR可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá) 得到。上述2)中的P450sca2-BMR的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中 缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在 其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白P450sca2_BMR的編碼基因(命名為P450sca2_BMR)也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。進(jìn)一步，上述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。序列表中的序列1由3033個(gè)堿基組成，其開(kāi)放閱讀框架(ORF)為第1-3033位堿 基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的蛋白。其中第1-1230位堿基編碼P450sca的 酶功能域；第U97-3033位堿基編碼P450BM3的天然氧化還原域。上述嚴(yán)格條件可為用0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。含有上述基因(P450sca2-BMR)的重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。
進(jìn)一步講，上述重組載體為在pET30a(+)載體的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求2或 3所述基因得到的重組表達(dá)載體。含有上述基因(P450sca2-BMR)的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。進(jìn)一步講，上述重組菌是含有上述重組載體的重組菌。具體地講，上述重組菌是含有上述重組載體的重組大腸桿菌。上述蛋白(P450sca2_BMR)、上述基因(P450sca2_BMR)、上述的重組菌在催化美伐 他汀羥基化生成普伐他汀中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述蛋白(P450sca2_BMR)、上述基因(P450sca2_BMR)、上述的重組菌在制備調(diào)血 脂藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明細(xì)胞色素雜合酶P450sca2-BMR表達(dá)活性高，可在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高 活性表達(dá)，并提高了野生型細(xì)胞色素的可溶性；( 本發(fā)明細(xì)胞色素雜合酶P450sca2-BMR 穩(wěn)定性好，成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞外純化；C3)本發(fā)明細(xì)胞色素雜合酶P450sca2-BMR保留了野 生型細(xì)胞色素P450sca-2的催化活性并且有的12. 7%提高；(4)本發(fā)明細(xì)胞色素雜合酶 P450sca2-BMR具有催化美伐他汀生產(chǎn)高效降血脂藥物普伐他汀的活性，為進(jìn)一步提高酶活 和實(shí)現(xiàn)工業(yè)酶法生產(chǎn)普伐他汀的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明提供的細(xì)胞色素雜合酶蛋白P450sca2-BMR構(gòu)成示意圖；其中，1為HEME功能域；2為連接肽段，包含P450BM3上449-470位的22個(gè)氨基酸 殘基；3為還原域，包含P450BM3上471-1048位的氨基酸殘基。圖2為細(xì)胞色素P450Sca2-BMR催化美伐他汀羥基化生成普伐他汀的反應(yīng)式。圖3為細(xì)胞色素雜合酶P450Sca2-BMR催化美伐他汀生成普法他汀的機(jī)理示意 圖；其中，M為美伐他汀，P為普法他汀。圖4為細(xì)胞色素雜合酶P450sca2_BMR在大腸桿菌E. coli BL 21(DE3)中的表達(dá)
結(jié)果；其中，S代表不可溶蛋白，P代表不可溶蛋白。1為陰性對(duì)照空白實(shí)驗(yàn)，2為野生型 細(xì)胞色素P450sca-2表達(dá)結(jié)果，3為野生型細(xì)胞色素P450sca_2與細(xì)胞色素P450BM3的還原 域直接相連不含連接肽段的細(xì)胞色素P450sCa-2雜合酶表達(dá)結(jié)果，4為本發(fā)明提供的細(xì)胞 色素雜合酶P450sca2-BMR表達(dá)結(jié)果；圖5為本發(fā)明提供的細(xì)胞色素雜合酶P450sca2-BMR的SDS凝膠電泳檢驗(yàn)純化結(jié) 果；其中，1為細(xì)胞色素雜合酶P450Sca2-BMR表達(dá)粗提液的穿透峰組分，0. 02mM IPTG誘導(dǎo)； 2為本發(fā)明提供的細(xì)胞色素P450sca-2雜合酶純酶，0. 02mM IPTG誘導(dǎo)；3為蛋白Marker。圖6為HPLC檢測(cè)細(xì)胞色素雜合酶P450Sca2-BMR全細(xì)胞催化美伐他汀鈉生成普伐 他汀鈉色譜圖；其中，1為空載體pET30a的陰性空白實(shí)驗(yàn)；2為野生型細(xì)胞色素P450sca-2 全細(xì)胞催化美伐他汀鈉生成普伐他汀鈉的峰圖；3為本發(fā)明提供的雜合酶P450sca2-BMR全 細(xì)胞催化美伐他汀鈉生成普伐他汀鈉的峰圖。圖7為本發(fā)明提供的細(xì)胞色素P450sca-2雜合酶全細(xì)胞催化活性測(cè)試結(jié)果；
其中，1為陰性對(duì)照空白實(shí)驗(yàn)；2為野生型細(xì)胞色素P450sca-2 ；3為本發(fā)明提供的 細(xì)胞色素雜合酶P450sca2-BMR。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。生物材料的獲得重組質(zhì)粒pET30a_P450sca2 制備序列表中序列1的第1-1230位的DNA片段，將 該DNA片段插入pET30a(+)的XbaI和Xho I位點(diǎn)間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET30a_P450sca2。重組質(zhì)粒pET28a_BM3 制備序列表中序列1的第1231-3033位的DNA片段，將該 DNA片段插入pET28a(+)的XbaI和XhoI位點(diǎn)間，構(gòu)成重組質(zhì)粒pET28a_BM3。實(shí)施例1、雜合酶(P450sca2_BMR)的制備純化一、雜合酶編碼基因的獲得以重組質(zhì)粒 pET30a-P450sca2 為模板，利用引物 P450scaGFPF(5，-ACAATTCCCCT CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGG-3’, XbaI)和弓丨物 hyE fl-rev(5' -CCAAGCGGAATTT TTTTCGATTT CCAGGTCACC GGTAATTCGT-3，)擴(kuò)增 P450sca2 基因。以重組質(zhì)粒pEI^8a_BM3為模板，利用引物hyE f2-for (5，- ACGAATTACCGGTGACCTGG AAATCGAAAAAAATTCCGCTTGG _3，)和 P450BM3_rev (5， -GATCTCTCGAGTTACCCAGCCCACACGTCTTTT-3 ’，XhoI)擴(kuò)增細(xì)胞色素 P450BM3 的連接肽段 (449-470aa)和還原酶結(jié)構(gòu)域 BMR (471-1，048aa)。二、重組表達(dá)載體pET30a-P450sca2_BMR的構(gòu)建以上述擴(kuò)增的P450sca2基因和BMR基因?yàn)槟０澹靡颬450scaGFPF和 P450BM3-rev,通過(guò)Overlapping PCR擴(kuò)增出本發(fā)明中的P450sca2_BMR基因(序列 見(jiàn)列表1)。利用)(ba I和BioI雙酶切，純化后，與用同樣內(nèi)切酶進(jìn)行雙切的表達(dá)載 體pET30a(+)過(guò)夜連接，隨后轉(zhuǎn)入化轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，即獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pET30a-P450sca2-BMR。經(jīng)測(cè)序，pET30a-P450sca2-BMR結(jié)構(gòu)正確。三、重組菌的獲得將步驟二獲得的pET30a-P450sca2_BMR 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3) (Novagen 公司)， 得到重組菌 E. coli BL21 (DE3)/pET30a-P450sca2_BMR。然后在含卡那霉素(50yg/mL)的LB平板上劃線，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，再挑取生 長(zhǎng)良好的的單菌落接種于ImL LB液體培養(yǎng)基(含50yg/mL卡那霉素)中，同時(shí)以 E. coliBL21(DE3)/pET30a為空白對(duì)照，37°C，250rpm過(guò)夜培養(yǎng)，以1 50的接種量進(jìn)行步 驟四的實(shí)驗(yàn)。四、雜合酶的獲得1、雜合酶的表達(dá)以上述1 50的接種量轉(zhuǎn)接于IOmL新鮮的液體LB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL卡那 霉素)中，1 50的繼續(xù)培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6 0. 8。加入終濃度為ImM的5-氨基酮戊酸 (5-aminolevulinic acid，5-ALA，購(gòu)于百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)和終濃度為0. 5mM的I^eCl3(購(gòu)于北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)，在23°C，250rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)20min。
然后加入終濃度為0. 02mM的IPTG，在23°C，250rpm條件下培養(yǎng)4h 他，誘導(dǎo)細(xì)胞 色素P450sca2-BMR雜合酶的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，取30ml OD6tltl菌液，于4°C，3，500rpm 條件下離心lOmin，菌體沉淀用ImL細(xì)菌裂解緩沖液重懸(IOOmMTris-HCl，pH 7. 5，其中含 有20% glycerol v/v,2mM EDTA和1.5mM DTT)。重懸液用超聲破碎方法提取可溶蛋白(超 聲時(shí)間4s，間隔時(shí)間3s，超聲30次)，超聲前向重懸液中加入終濃度為ImM的苯甲基磺酰氟 (phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF, Amresco 分裝)，以防止細(xì)胞色素 P450sca2_BMR 雜合酶蛋白被蛋白酶分解。將裂解液13，OOOrpm條件下離心lOmin，取上清即為蛋白可溶部 分，利用等體積的裂解緩沖液重懸沉淀，再用SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況(10%丙烯酰 胺凝膠)。結(jié)果如圖4所示，0. 02mM IPTG誘導(dǎo)條件下，野生型P450sca-2相比于陰性對(duì)照 pET30a有明顯的可溶表達(dá)，但多以包涵體形式存在；本發(fā)明提供的雜合酶P450sca2-BMR幾 乎完全可溶表達(dá)，分子量大致均在1 IOkDa左右，與目標(biāo)蛋白的理論計(jì)算值相近，相比野生 型P450sca-2的單獨(dú)表達(dá)，本發(fā)明的雜合酶P450可溶性因?yàn)锽MR的融合而大大提高，可知 BMR具有一定的增溶作用。2、雜合酶的純化使用安瑪西亞(AmershamBiosciences)公司的 Hitrap Chelating HP 柱，以鎳離 子作為親和離子，依靠不同咪唑濃度梯度洗脫目的蛋白。在0.02mM IPTG誘導(dǎo)條件下，表達(dá) 雜合酶His-P450sca2-BMR。離心后，用buffer A重懸菌體沉淀，并超聲99次破碎并再次離 心，得到目標(biāo)蛋白的粗提液。取出離心后的上清液，用0.22μπι低蛋白質(zhì)結(jié)合的濾膜過(guò)濾后，上樣至已結(jié)合Ni2+ 的HiTrap Chelating HP柱(體積ImL)，再用30_330mM的咪唑濃度梯度洗脫蛋白。由于 P450酶比較容易失活，故實(shí)驗(yàn)所有操作都要在4°C進(jìn)行，并保證預(yù)冷所有相關(guān)緩沖液。此 外，P450酶在420nm都有特定吸收峰，故在純化過(guò)程中，用420nm檢測(cè)蛋白峰可以有效防止 雜蛋白干擾。純化得到的蛋白保存于20%的甘油中，分裝后在-70°C冷凍保存。蛋白純度 由SDS-PAGE(10%丙烯酰胺凝膠)檢驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示，純化時(shí)穿透峰組分中幾乎沒(méi)有雜 合酶P450Sca2-BMR，大部分結(jié)合在鎳柱上被純化出來(lái)，分子量大致均在IlOkDa左右，與目 標(biāo)蛋白的理論計(jì)算值相近，收集的蛋白純度大于90%。實(shí)施例2、雜合酶的催化活性檢測(cè)將重組菌E. coli BL21(DE3)/pET30a-P450sca2-BMR 在 0. 02mM IPTG 誘導(dǎo)下表達(dá) 4h后，取30ml OD600菌液，于4°C，3，500rpm條件下離心lOmin，菌體沉淀用ImL細(xì)菌裂解緩 沖液重懸(IOOmM Tris-HCl,pH 7. 5, 20% glycerol v/v,2mM EDTA，1. 5mMDTT)，加入底物美 伐他汀鈉(浙江海正藥業(yè)股份有限公司贈(zèng)送)(終濃度為0. 05mg/mL)，隨后在30°C下進(jìn)行 美伐他汀鈉的羥基化反應(yīng)(羥基化反應(yīng)式如圖2所示，催化機(jī)理示意圖如圖3所示)。反 應(yīng)結(jié)束后，利用HPLC分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。HPLC圖譜如圖6所示，野生型P450sca-2和本發(fā)明提 供的雜合酶P450sca2-BMR在保留時(shí)間tK 4. 5min處出現(xiàn)普伐他汀鈉色譜峰，在保留時(shí)間tK 16min處出現(xiàn)美伐他汀鈉色譜峰，且雜合酶P450sca2-BMR的普伐他汀鈉產(chǎn)物峰略高于野生 型 P450sca-2。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物普伐他汀鈉色譜峰的面積如圖7所示，其中本發(fā)明提供的雜合酶 P450sca2-BMR通過(guò)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，催化美伐他汀鈉生成普伐他汀鈉的量比野生型細(xì)胞色素P450sca-2提高約12. 7%，說(shuō)明P450sca2-BMR在提高可溶性的基礎(chǔ)上，保留了野生型細(xì)胞 色素P450sca-2的催化活性并有約12. 7%的提高。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有羥基化美伐他汀催化活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pET30a(+)載體 的多克隆位點(diǎn)間插入權(quán)利要求2或3所述基因得到的重組表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權(quán)利要求4或5所 述重組載體的重組菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權(quán)利要求4或5所 述重組載體的重組大腸桿菌。
9.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求6-8中任一所述的重組菌 在催化美伐他汀羥基化生成普伐他汀中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求6-8中任一所述的重組 菌在制備調(diào)血脂藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雜合酶P450sca2-BMR及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有羥基化美伐他汀的催化活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的P450sca2-BMR保留了野生型細(xì)胞色素P450sca-2的催化活性并且有的12.7％提高，具有催化美伐他汀生產(chǎn)高效降血脂藥物普伐他汀的活性，為進(jìn)一步提高酶活和實(shí)現(xiàn)工業(yè)酶法生產(chǎn)普伐他汀的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102093984SQ20101056117
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者巴麗娜, 張玲玲, 朱玉山, 林章凜 申請(qǐng)人:清華大學(xué)