本發(fā)明涉及生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物、試劑盒及方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微量元素在體內(nèi)含量很少，它通過(guò)參與體內(nèi)的新陳代謝、生理、生化反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)換等過(guò)程，在機(jī)體的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。微量元素不能在體內(nèi)自身合成，必須從食物和飲水中攝取，并且膳食中的其他成分能影響到微量元素的吸收代謝。vdr基因編碼維生素d受體蛋白2，是維生素d調(diào)節(jié)反饋系統(tǒng)中重要蛋白。維生素d在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)促進(jìn)身體對(duì)鈣、磷元素的吸收，維持鈣、磷的正常代謝，生物學(xué)原理是維生素d在身體內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)化，形成其在體內(nèi)最有效的1，25-二羥膽鈣化(甾)醇形式，1，25-二羥膽鈣化(甾)醇能夠通過(guò)與維生素d受體蛋白(vdr)的作用打開(kāi)細(xì)胞表面的鈣元素吸收離子通道，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)鈣的吸收。鐵是人體必需微量元素之一，具有廣泛的生理作用。正常生理狀態(tài)下，5％-10％的鐵來(lái)源于腸道吸收，90％-95％的鐵來(lái)源于脾臟巨噬細(xì)胞從衰老紅細(xì)胞中回收后釋放的鐵。血紅蛋白和鐵蛋白含量是臨床上反映體內(nèi)鐵貯存狀況的常用指標(biāo)。體內(nèi)鐵減少會(huì)導(dǎo)致貧血；鐵增多除了會(huì)引起以臟器鐵蓄積為主要病理改變的血色病外，還會(huì)增加2型糖尿病的罹患風(fēng)險(xiǎn)。肝臟分泌的鐵調(diào)素hepcidin通過(guò)調(diào)節(jié)腸鐵吸收和巨噬細(xì)胞鐵的釋放來(lái)維持鐵代謝平衡。tmprss6基因編碼的膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶matriptase-2能夠降解細(xì)胞膜上的調(diào)控蛋白hjv，進(jìn)而下調(diào)bmps-smad信號(hào)通路，抑制hepcidin表達(dá)。人體內(nèi)鋅的來(lái)源主要是通過(guò)膳食獲得，一些基因的突變能夠影響我們對(duì)食物中鋅的代謝能力，slc30a8基因上面一個(gè)位點(diǎn)的突變，能夠降低我們鋅元素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，這個(gè)基因上面有突變的人群，每日需要適量多攝入鋅元素才能滿足身體需要。slc30a8基因編碼鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(znt8)，主要在胰島β細(xì)胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)把鋅元素從細(xì)胞胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞囊泡中，在胰島細(xì)胞中，znt8蛋白主要存在于胰島素分泌顆粒中，對(duì)胰島素的結(jié)晶、儲(chǔ)存和分泌都是必不可少的。目前，對(duì)于多種微量元素的檢測(cè)由于所用的引物不同，pcr條件不同，使得對(duì)不同種微量元素的檢測(cè)只能分別進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本過(guò)高且檢測(cè)效率偏低。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述引物組合物在檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，本發(fā)明的第四個(gè)目的載體提供上述試劑盒在檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用，本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的對(duì)于多種微量元素的檢測(cè)只能分別進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本過(guò)高且檢測(cè)效率偏低的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，所述引物組合物包括如下(a)-(c)：(a)用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seqidno.1所示序列，所述下游引物具有如seqidno.2所示序列；(b)用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seqidno.3所示序列，所述下游引物具有如seqidno.4所示序列；(c)用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物和下游引物，所述上游引物具有如seqidno.5所示序列，所述下游引物具有如seqidno.6所示序列。進(jìn)一步地，所述用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物、用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物的5’端均經(jīng)過(guò)磷酸化修飾。本發(fā)明還提供了上述的引物組合物在檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物組合物和用于捕獲rna的探針。進(jìn)一步地，所述用于捕獲rna的探針具有如seqidno.7所示序列。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，所述方法包括：使用上述的引物組合物分別對(duì)待測(cè)樣本dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用上述的試劑盒中的探針捕獲所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)片段，將所述目標(biāo)片段進(jìn)行連接，得到連續(xù)dna片段，使用上述的引物組合物中至少一個(gè)上游引物和下游引物擴(kuò)增所述連續(xù)dna片段并得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物，將所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序處理，檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變。進(jìn)一步地，還包括將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。進(jìn)一步地，所述待測(cè)樣本dna來(lái)源于組織、血液或口腔上皮細(xì)胞中的一種或多種。進(jìn)一步地，所述微量元素為維生素d、鐵和鋅。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，包括用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的引物、用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的引物和用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的引物，能夠有效檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，包含上述的引物組合物和用于捕獲rna的探針，能夠?qū)⒉煌恢玫娜齻€(gè)突變進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。本發(fā)明提供的檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的試劑盒，使用先pcr后捕獲的方法，提高檢測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)率。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例3步驟(1)中提供的應(yīng)用本發(fā)明提供的引物組合物對(duì)待測(cè)樣本dna進(jìn)行pcr的結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例3步驟(6)中提供的使用引物rs2228570f和rs13266634r對(duì)連接后的連續(xù)dna片段進(jìn)行pcr的結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3步驟(7)中提供的pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果峰圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，包括如下(a)-(c)：(a)用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物和下游引物：上游引物的核苷酸序列為：5’-po4-ggaagtgctggccgccat-3’(seqidno.1)；下游引物的核苷酸序列為：5’-cactgactctggctctgaccgt-3’(seqidno.2)；(b)用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和下游引物：上游引物的核苷酸序列為：5’-po4-ctcacttctgcccttgacca-3’(seqidno.3)；下游引物的核苷酸序列為：5’-cacagcatgcgtggcgtcac-3’(seqidno.4)；(c)用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物和下游引物：上游引物的核苷酸序列為：5’-po4-ccctgtgcttctttatcaacag-3’(seqidno.5)；下游引物的核苷酸序列為：5’-agcttttgctaagggctttg-3’(seqidno.6)。其中，rs2228570位點(diǎn)位于vdr基因上，rs2228570位點(diǎn)的突變能夠增強(qiáng)維生素d對(duì)鈣元素的吸收促進(jìn)作用；rs855791位點(diǎn)位于tmprss6基因上，rs855791位點(diǎn)與血紅蛋白以及鐵蛋白含量之間存在顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系；rs13266634位點(diǎn)位于slc30a8基因上，rs13266634位點(diǎn)的突變，能夠影響slc30a8基因的表達(dá)，基因型為cc的人slc30a8基因表達(dá)低于tt或者ct的人群，他們患上2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)也相比增加33％和16.5％，則提示這類人群需要每日多攝入鋅元素才能降低患病的風(fēng)險(xiǎn)。在本發(fā)明中，微量元素為維生素d、鐵和鋅。在本發(fā)明中，用于擴(kuò)增rs2228570位點(diǎn)的上游引物、用于擴(kuò)增rs855791位點(diǎn)的上游引物和用于擴(kuò)增rs13266634位點(diǎn)的上游引物的5’端均經(jīng)過(guò)磷酸化修飾，以加強(qiáng)t4連接酶連接效率。本發(fā)明還提供了上述的引物組合物在檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物，能夠有效檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，包括上述的引物組合物和用于捕獲rna的探針。在本發(fā)明中，用于捕獲rna的探針的核苷酸序列為：agcuuuugcuaagggcuuuagcaauuucucuccgaaccacuuggcugucccggcuggcugcuguugauaaagaagcacagggcacugacucuggcucugaccguggccugcuugcuguucuuacagggauggaggcaauggcggccagcacuucccacagcaugcguggcgucaccugguagcgauagaccucgcugcacagguccugugggaucaacugcacauccacuuucugcagagcguugcugauggggccuguccguggucaagggcagaagugag(seqidno.7)。本發(fā)明還提供了上述的試劑盒在檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，微量元素為維生素d、鐵和鋅。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的試劑盒，能夠?qū)⒉煌恢玫娜齻€(gè)突變進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。另外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，包括：使用本發(fā)明提供的引物組合物分別對(duì)待測(cè)樣本dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用本發(fā)明提供的試劑盒中的探針捕獲第一擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)片段，將目標(biāo)片段進(jìn)行連接，得到連續(xù)dna片段，使用本發(fā)明提供的引物組合物中至少一個(gè)上游引物和下游引物擴(kuò)增連續(xù)dna片段并得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物，將第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序處理，檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變。其中，將目標(biāo)片段進(jìn)行連接所使用的為t4連接酶。本發(fā)明提供的引物組合物中至少一個(gè)上游引物和下游引物優(yōu)選為rs2228570f和rs13266634r。在本發(fā)明中，還包括將第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。在本發(fā)明中，待測(cè)樣本dna來(lái)源于組織、血液或口腔上皮細(xì)胞中的一種或多種。在本發(fā)明中，微量元素為維生素d、鐵和鋅。本發(fā)明提供的檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的方法，應(yīng)用了本發(fā)明提供的試劑盒，使用先pcr后捕獲的方法，提高檢測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)率。為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1設(shè)計(jì)引物和探針本發(fā)明提供的引物組合物通過(guò)如下方法設(shè)計(jì)得到：根據(jù)所選擇的微量元素吸收能力易感突變，設(shè)計(jì)出特異性針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段為包括突變位點(diǎn)內(nèi)的一段dna序列，通過(guò)ncbiblast軟件進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證，得到了擴(kuò)增效率高、特異性好、能夠正確區(qū)分待檢測(cè)突變的引物。本發(fā)明提供的用于捕獲rna的探針序列通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到。本發(fā)明設(shè)計(jì)的針對(duì)所述的微量元素吸收能力易感突變突變位點(diǎn)信息如表1所示，擴(kuò)增引物參見(jiàn)表2。表1易感突變突變位點(diǎn)信息基因突變位點(diǎn)vdrrs2228570tmprss6rs855791slc30a8rs13266634表2針對(duì)所述pcr擴(kuò)增的pcr擴(kuò)增引物序列seqidno.擴(kuò)增引物名稱引物序列5'-3'1rs2228570fpo4-ggaagtgctggccgccat2rs2228570rcactgactctggctctgaccgt3rs855791fpo4-ctcacttctgcccttgacca4rs855791rcacagcatgcgtggcgtcac5rs13266634fpo4-ccctgtgcttctttatcaacag6rs13266634ragcttttgctaagggctttg用于捕獲rna的探針的核苷酸序列為：agcuuuugcuaagggcuuuagcaauuucucuccgaaccacuuggcugucccggcuggcugcuguugauaaagaagcacagggcacugacucuggcucugaccguggccugcuugcuguucuuacagggauggaggcaauggcggccagcacuucccacagcaugcguggcgucaccugguagcgauagaccucgcugcacagguccugugggaucaacugcacauccacuuucugcagagcguugcugauggggccuguccguggucaagggcagaagugag(seqidno.7)。實(shí)施例2樣本制備dna提取取樣方式：使用棉簽在面頰內(nèi)擦拭15次。提取dna采用異硫氰酸胍法進(jìn)行提取。實(shí)施例3微量元素吸收能力易感突變檢測(cè)(1)以本發(fā)明實(shí)施例2中提取的dna為模板，使用本發(fā)明實(shí)施例1提供的pcr擴(kuò)增引物分別通過(guò)pcr擴(kuò)增，獲得靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，其中，第一泳道為marker，第二泳道為rs2228570，第三泳道為rs855791，第四泳道為rs13266634，擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度符合預(yù)期，目的片段單一。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系參見(jiàn)表3。表3pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑體積10×pcrbufferwithmg2+2.5μldntpmixture(2.5mmeach)2μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.125μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl模板dna2μlddh2o16.375μlpcr反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共擴(kuò)增45循環(huán)；最終72℃延伸300s。(2)將步驟(1)中pcr產(chǎn)物混合后，取8μl總混合產(chǎn)物，通過(guò)sap酶和exoi酶處理，除去步驟(1)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的未反應(yīng)的dntp和引物。反應(yīng)體系參見(jiàn)表4。表4pcr產(chǎn)物純化體系試劑體積sap(1u/μl)2μlexoi(5u/μl)0.5μl10×exonucleasebuffer1.2μlpcr混合產(chǎn)物8μltotal12μl將反應(yīng)體系置于pcr儀上，37℃孵育保溫1h，然后75℃保溫15min以滅活sap和exoi酶。純化好的模板可以在4℃保存24h或-20℃長(zhǎng)期保存。(3)預(yù)先將2×hybridizationbuffer65℃預(yù)熱。分別加入rna探針和步驟(2)的產(chǎn)物，進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)體系參見(jiàn)表5。表5雜交反應(yīng)體系試劑體積步驟(2)的樣品7μl2×hybridizationbuffer13μlrna探針6μltotal26μl混勻后，pcr儀上65℃雜交12h。(4)使用磁珠純化雜交產(chǎn)物，用20μl水溶解。(5)使用t4連接酶連接步驟(4)連接捕獲片段，連接反應(yīng)體系參見(jiàn)表6。混合后在thermomixer中20℃溫浴15min。表6連接反應(yīng)體系試劑體積步驟(4)的樣品20μl2×rapidligationbuffer25μlt4dnaligase5μltotal50μl(6)使用引物rs2228570f和rs13266634r擴(kuò)增步驟(5)獲得的產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，說(shuō)明步驟5中t4連接酶連接成功。擴(kuò)增反應(yīng)體系參見(jiàn)表7。表7擴(kuò)增反應(yīng)體系(7)將pcr產(chǎn)物使用abi3730xl進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。所得到的結(jié)果使用chromas軟件進(jìn)行分型，得到分型結(jié)果，結(jié)果如圖3所示，說(shuō)明本檢測(cè)能連續(xù)檢測(cè)3個(gè)snp，并能準(zhǔn)確檢測(cè)其周圍序列情況。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>杭州祥音生物醫(yī)藥科技有限公司<120>用于檢測(cè)影響微量元素吸收能力的基因易感突變的引物組合物、試劑盒及方法和應(yīng)用<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1ggaagtgctggccgccat18<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2cactgactctggctctgaccgt22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ctcacttctgcccttgacca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cacagcatgcgtggcgtcac20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5ccctgtgcttctttatcaacag22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6agcttttgctaagggctttg20<210>7<211>282<212>rna<213>人工序列<400>7agcuuuugcuaagggcuuuagcaauuucucuccgaaccacuuggcugucccggcuggcug60cuguugauaaagaagcacagggcacugacucuggcucugaccguggccugcuugcuguuc120uuacagggauggaggcaauggcggccagcacuucccacagcaugcguggcgucaccuggu180agcgauagaccucgcugcacagguccugugggaucaacugcacauccacuuucugcagag240cguugcugauggggccuguccguggucaagggcagaagugag282當(dāng)前第1頁(yè)12