一種快速檢測(cè)茶樹中茶氨酸和谷氨酰胺水解酶活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及茶樹中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水 解酶的酶活檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引茶氨酸燈heanine，N-乙基-丫-k谷氨酷胺）系茶樹中特征性非蛋白質(zhì)氨基酸。 目前僅在覃狂erocomusbadius)和某些山茶屬植物（CamelliajaponicaandCamellia sasanqua)中有見報(bào)道。茶氨酸占茶樹新梢芽葉游離氨基酸總量的70%左右，是綠茶品質(zhì) 形成的重要影響因子。同時(shí)，茶氨酸具有鎮(zhèn)靜安神、抗癌、抗抑郁等重要的生理活性及藥理 功能。
[0003] 茶氨酸代謝過(guò)程中茶氨酸合成酶、茶氨酸水解酶直接參與了茶氨酸的合成與分 解，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸脫簇酶、谷氨酸脫氨酶、谷氨酷胺合成酶、G0GAT、胺氧化酶等參與了 茶氨酸合成前提物質(zhì)谷氨酸和乙胺的代謝。茶氨酸的代謝可分為根部茶氨酸的合成與葉部 茶氨酸分解兩個(gè)過(guò)程：茶樹根本的丙氨酸脫簇形成的乙胺與谷氨酸在茶氨酸合成酶的作用 下生成茶氨酸；然后轉(zhuǎn)移至葉部，在茶氨酸水解酶的作用下分解成谷氨酸和乙胺，乙胺在胺 氧化酶的作用下形成乙醒參與葉部?jī)翰杷氐拇x。
[0004] 目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)茶樹中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶酶活力的測(cè)定方法均采 用高效液相色譜OffLC)檢測(cè)產(chǎn)物積累。但HPLC方法存在W下缺點(diǎn)：1、方法繁瑣，需要對(duì)反 應(yīng)產(chǎn)物萃取分離純化、濃縮和衍生；2、成本高，需要昂貴的儀器設(shè)備及衍生試劑，包括HPLC 系統(tǒng)、巧光檢測(cè)器、2, 4-二硝基氣苯值NFB)、鄰苯二甲醒（OPT)等；3、對(duì)人體有毒性，使用的 試劑包括DNFB、OPT、乙酸乙醋、甲醇和乙臘等對(duì)人體具有毒性，另外易于污染環(huán)境；4、分析 時(shí)間長(zhǎng)，采用HPLC法檢測(cè)一個(gè)樣品需要1-2小時(shí)，工作效率不高，無(wú)法適用于大規(guī)模篩選分 析。而茶氨酸、谷氨酷胺和谷氨酸性質(zhì)、結(jié)構(gòu)較為接近，目前所知的可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模分析的紙 色譜層析方法又無(wú)法將Ξ者完全分離開來(lái)，因而也無(wú)法用于茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解 酶的活性檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的目的是提供一種針對(duì)茶樹中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶活力的高 通量、快速的檢測(cè)方法，為研究茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝、茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶的分 離純化、酶蛋白的基因克隆及其功能驗(yàn)證奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 一種檢測(cè)茶樹中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶酶活力的方法，包括如下步驟： 陽(yáng)00引 （1)粗酶液的制備；
[0009] 似粗酶液中蛋白質(zhì)含量P的檢測(cè)；
[0010] (3)將步驟（1)制得的粗酶液平分，一份粗酶液加入茶氨酸溶液或谷氨酷胺溶液 得到水解反應(yīng)體系樣品，反應(yīng)完成后離屯、，取上清液；另一份粗酶液經(jīng)處理作為對(duì)照液；
[0011] (4)利用高效薄層色譜（HFTLC)檢測(cè)上清液中水解反應(yīng)產(chǎn)物谷氨酸的吸光值，代 入線性方程，計(jì)算得到谷氨酸的濃度N，進(jìn)而計(jì)算得到谷氨酸含量M、茶氨酸水解酶活力或 谷氨酷胺水解酶活力；其中，
[0012] 谷氨酸含量Μ=谷氨酸濃度NX水解反應(yīng)體系樣品的體積V;
[0013] 茶氨酸水解酶活力或谷氨酷胺水解酶活力==Μ/水解時(shí)間（min) /Ρ。
[0014] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中，步驟（1)中，將茶樹鮮葉樣品加入液氮后，快速研磨成 粉末狀，按1. 0 : 0. 2~1. 0 (W/W)加入聚乙締化咯燒酬（PVP巧混勻，再按1 : 10~30 (W/ V)加入-20°C預(yù)冷的憐酸緩沖液，勻漿20s，靜置3-5分鐘，重復(fù)3次；冰浴靜置比，過(guò)4層紗 布，濾液離屯、（4°C，18000Xg，15min)，所得上清液即為粗酶液。其中，所述憐酸緩沖液配方 為：100mM憐酸緩沖鹽，ImM二硫蘇糖醇值TT)，5%甘油，ImM乙二胺四乙酸二鋼巧DTA-Naz)， ImM苯甲基橫酷氣（PMSF)。
[0015] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中，步驟（1)中，將制得的粗酶液進(jìn)一步利用注射器過(guò)凝 膠柱Se地adexG-25,具體操作可參見操作手冊(cè)；收集前2個(gè)柱體積度V)酶液，W作備用。 通過(guò)凝膠柱過(guò)濾，可有效去除粗酶液中所含茶氨酸、谷氨酷胺和谷氨酸，消除本底干擾。
[0016] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中，步驟似中，采用蛋白含量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量 (P);本發(fā)明中采用采用Bio-rad公司的RCDC蛋白含量試劑盒的操作程序測(cè)定蛋白質(zhì)含 量。
[0017] 為了更準(zhǔn)確、快速、低成本的檢測(cè)茶樹中水解酶的酶活力，本發(fā)明還對(duì)水解反應(yīng)條 件做進(jìn)一步優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，隨著反應(yīng)溫度的上升，茶氨酸水解酶產(chǎn)物和谷氨 酷胺水解酶產(chǎn)物谷氨酸呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，35°C左右酶活力達(dá)到峰值。但由于粗酶液中殘 留的多酪等物質(zhì)，體系反應(yīng)副產(chǎn)物明顯增加；如圖3所示，茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶 活力隨著抑值升高逐漸上升，抑值8. 5左右時(shí)達(dá)到最高，隨后酶活力開始下降。如圖4所 示，茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶活力在反應(yīng)60min左右達(dá)到最大，隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行， 反應(yīng)產(chǎn)物有一定程度的降低。如圖5所示，茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶活力在茶氨酸 和谷氨酷胺濃度分別為50mM和70mM時(shí)，酶活力達(dá)到最大；隨著底物濃度的繼續(xù)升高，酶反 應(yīng)產(chǎn)物趨于穩(wěn)定，無(wú)顯著性變化。因此，綜合考慮，步驟（3)中，所述水解反應(yīng)條件為：25~ 38°C水浴，反應(yīng)30~90min，抑7~9。進(jìn)一步優(yōu)選，所述水解反應(yīng)條件為：35°C水浴，反應(yīng) 60min，抑8. 5。所述茶氨酸溶液的濃度為50mM;所述谷氨酷胺溶液的濃度為70mM。
[0018] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中，步驟（3)中，所述對(duì)照液配制如下：將粗酶液置于 100°C水浴中處理lOmin，離屯、（4°C，ISOOOXg，15min)，上清液即為對(duì)照液。
[0019] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中，步驟（4)中，所述檢測(cè)步驟如下：
[0020]a)、將硅膠預(yù)制板（lOcmX10cm)于120°C條件下活化化，后放于干燥器冷卻；
[0021] b)、將展開劑I、II倒入展開缸，靜置飽和約30min;其中，展開劑I由正下醇： 丙酬：乙酸：水按體積比14:14:3:4配制，展開劑II由正下醇：丙酬：乙酸：水按體積比 14:14:3:4 配制，并含 0.2% (W/V)巧Ξ酬；
[0022]C)、取10μL水解反應(yīng)體系樣品，帶狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣數(shù)6條，寬度8mm，點(diǎn)樣高度距底端 10mm；
[0023]d)、點(diǎn)樣后，將硅膠板于展開劑I中展開，待展開劑跑至硅膠板頂端1cm時(shí)取出， 熱風(fēng)吹干；待硅膠板冷卻至室溫后于展開劑II中展開，待展開劑跑至硅膠板頂端1cm時(shí)取 出，熱風(fēng)吹干至條帶氨基酸顏色逐漸清晰；
[0024] e)、將谷氨酸條帶自硅膠板刮取于離屯、管中，加入5血75%乙醇，于50°C水浴提 取lOmin，室溫離屯、（12000Xg，lOmin)，取上清液，冷卻待測(cè)；
[00巧]f)、W75%乙醇作為空白對(duì)照，在570皿處測(cè)定步驟e)所得上清液的吸光值A(chǔ)s7。。 [00%] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法中，步驟（4)中，為了獲得精確的谷氨酸含量，每次檢測(cè) 需W1.OOmmol/L~10.OOmmol/L谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品制作吸光值對(duì)谷氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 出線性方程；將樣品測(cè)定的Ae^nm代入線性方程中，計(jì)算得到谷氨酸濃度（腳，進(jìn)而計(jì)算得 到谷氨酸含量Μ;再利用酶活力計(jì)算方法，計(jì)算茶氨酸或谷氨酷胺水解酶活力，即在上述 最佳檢測(cè)條件下，計(jì)算每分鐘每毫克酶催化形成的酶產(chǎn)物谷氨酸的量，單位為μmol/min/ m邑(protein)。計(jì)算公式女曰下：
[0027] 茶氨酸水解酶活力/谷氨酷胺水解酶活力=M/水解時(shí)間（min)/P
[0028] 式中：Μ表示水解時(shí)間內(nèi)形成的酶產(chǎn)物谷氨酸的量；P表示樣品中蛋白質(zhì)含量。
[0029] 本發(fā)明所述檢測(cè)方法具有幾方面的優(yōu)點(diǎn)：
[0030] 1、通量大、速度快、效率高；采用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法能一次性檢測(cè)10-20個(gè)樣 品檢測(cè)并能在2-3小時(shí)內(nèi)完成，方法簡(jiǎn)單，不需要對(duì)反應(yīng)樣品進(jìn)行萃取濃縮、衍生等處理。
[0031] 2、成本低，不需要昂貴儀器和試劑；
[0032] 3、環(huán)保安全，不需要使用有毒試劑和溶劑。
[0033] 4、本發(fā)明所述粗酶液通過(guò)凝膠柱過(guò)濾，可有效去除粗酶液中所含茶氨酸、谷氨酷 胺和谷氨酸，消除本底干擾。
[0034] 5、本發(fā)明所述的檢測(cè)方法首次采用HPTLC結(jié)合紫外分光光度法檢測(cè)谷氨酸的生 成量，并W此計(jì)算檢測(cè)茶氨酸水解或谷氨酷胺水解酶的酶活力。本方法利用HPTLC實(shí)現(xiàn)二 次展開分離性質(zhì)較為接近的底物（茶氨酸、谷氨酷胺）和產(chǎn)物（谷氨酸）（圖1)，并能夠完 全分離性質(zhì)結(jié)構(gòu)接近的酶反應(yīng)產(chǎn)物谷氨酸與酶反應(yīng)底物茶氨酸產(chǎn)物。
[0035] 6、本發(fā)明所述的檢測(cè)方法為研究茶樹體內(nèi)茶氨酸代謝、茶氨酸水解酶和谷氨酷胺 水解酶的分離純化、酶蛋白的基因克隆及其功能驗(yàn)證奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)茶樹 品種資源種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1水解反應(yīng)產(chǎn)物谷氨酸的HPTLC分離圖譜。其中，STD:混合標(biāo)準(zhǔn)品（茶氨酸+ 谷氨酸+谷氨酷胺）；Thea:茶氨酸；Glu:谷氨酸；Gin:谷氨酷胺；TS:茶氨酸水解酶樣品反 應(yīng)產(chǎn)物；TC茶氨酸水解酶對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)物；GS:谷氨酷胺水解酶樣品反應(yīng)產(chǎn)物；GC:谷氨酷胺 水解酶對(duì)照反應(yīng)產(chǎn)物。 陽(yáng)037] 圖2茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶最適反應(yīng)溫度。其中，（a)為茶氨酸水解酶， 化）為谷氨酷胺。
[0038] 圖3茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶最適反應(yīng)抑。其中，（a)為茶氨酸水解酶， 化）為谷氨酷胺。
[0039] 圖4茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶最適反應(yīng)時(shí)間。其中，（a)為茶氨酸水解酶， 化）為谷氨酷胺。
[0040]圖5茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶最適底物濃度。其中，（a)為茶氨酸水解酶， (b)為谷氨酷胺。
【具體實(shí)施方式】
[0041]W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0042] 實(shí)施例1測(cè)定茶樹中茶氨酸水解酶酶活力的方法
[0043] 本實(shí)施例提供一種測(cè)定茶樹中茶氨酸水解酶酶活力的方法，包括：
[0044] 主要設(shè)備：1.薄層電動(dòng)點(diǎn)樣儀；2.紫外可見分光光度計(jì)； W45] 3.恒溫水浴鍋；4.離屯、機(jī)點(diǎn)抑計(jì)。
[0046] 材料與試劑
[0047] 1.材料：茶樹鮮葉，-80°C保存?zhèn)溆谩?W48] 2.主要試劑： W例 （1)聚乙締化咯燒酬（PVP巧：用來(lái)吸附粗酶液中多酪類物質(zhì)，保持酶蛋白的較高 活力。
[0050] 似1M抑7. 0憐酸鐘緩沖液配置：
[0051] 儲(chǔ)備液A:稱取Ξ水合憐酸氨二鐘化甜P04 ·3肥0) 114.l