一種檢測(cè)奶制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方 法，尤其涉及一種基于熒光底物探針的熒光值定量檢測(cè)奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方法
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，青霉素和頭孢菌素作為內(nèi)酰胺類(lèi)藥物是治療牛乳腺炎的首選，是牛奶 中最常見(jiàn)的殘留抗生素，而乳品中殘留的抗生素危害食品安全和人體健康。我國(guó)無(wú)公害生 鮮牛乳的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中明文規(guī)定，生鮮牛乳中氨芐青霉素< 10yg/kg，青霉素不得檢出。因 此，國(guó)內(nèi)多數(shù)乳品企業(yè)對(duì)抗生素殘留超標(biāo)的牛乳采取降價(jià)收購(gòu)原則，出于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)， 一些不法奶站為了謀求自己的經(jīng)濟(jì)利益，人為地使用一些生物制劑達(dá)到降解牛乳中殘留的 抗生素的目的，生產(chǎn)人造"無(wú)抗奶"。有研宄表明，牛奶中的抗生素分解劑是革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn) 生的內(nèi)酰胺酶，是人為添加的，而不是內(nèi)源性?xún)?nèi)酰胺酶。內(nèi)酰胺酶可以分解牛 乳中的抗生素殘留使其降到允許量。但是目前為止，尚未有關(guān)于內(nèi)酰胺酶本身及其分 解產(chǎn)物對(duì)人體是否健康的安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，所以，國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟、美國(guó)都不允 許0 -內(nèi)酰胺酶在食品中使用，我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB-2760)的食品用酶制 劑名單中也不包括內(nèi)酰胺酶。因此，內(nèi)酰胺酶是非法的食品添加劑，目前國(guó)際和國(guó) 內(nèi)均不允許該酶在牛奶中作為添加劑使用。
[0003] 因此，確立針對(duì)這種人造"無(wú)抗奶"的違規(guī)情況，相應(yīng)的檢測(cè)方法具有十分重要的 意義。目前比較成熟的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法、碘量法、微生物法、頭孢菌素顯 色法、酸量法和免疫學(xué)方法。
[0004] (1)微生物法可以定性和定量地檢測(cè)牛奶中的內(nèi)酰胺酶。該方法可以檢測(cè)出 牛奶中未反應(yīng)完全（未失活）的內(nèi)酰胺酶，可用于檢測(cè)未經(jīng)過(guò)任何加工的牛奶，檢出限 較低。但也存在檢測(cè)種類(lèi)有限、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、只能給出定性結(jié)論等局限性。不適用于快速、 大規(guī)模的樣品檢測(cè)，但是，微生物法仍然是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)牛奶中內(nèi)酰胺酶的主要方法。
[0005] (2)碘量法作為快速篩選方法，該法方便快捷、操作簡(jiǎn)單、試劑易得，檢測(cè)革蘭陽(yáng) 性細(xì)菌胞外酶陽(yáng)性率高，為實(shí)驗(yàn)室所普遍使用。該方法可檢出牛奶中已反應(yīng)及未反應(yīng)的 0-內(nèi)酰胺酶，可用于檢測(cè)鮮奶及奶制品中的內(nèi)酰胺酶，檢出限較高。但該方法對(duì)反應(yīng) 時(shí)間等條件要求較嚴(yán)格，有假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象，每次試驗(yàn)均需要設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，而 且靈敏度較差，重現(xiàn)性差。碘量法雖然經(jīng)典、快速，但其試劑配制較復(fù)雜，淀粉試劑易失效， 必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0006] (3)酸量法簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，最易獲取結(jié)果，且較靈敏，結(jié)果穩(wěn)定性好，假陽(yáng)性 和假陰性結(jié)果較少，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，雖然快速檢測(cè)，但檢測(cè)靈敏度偏低，且不能用于 酶動(dòng)力學(xué)分析。
[0007] (4)高效液相色譜法具有檢測(cè)時(shí)間短、可以定量分析等優(yōu)點(diǎn)，但是存在靈敏度低、 檢測(cè)成本高、前處理操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。
[0008] (5)頭孢菌素顯色法：該方法比較方便快捷，操作簡(jiǎn)單，但是所用試劑價(jià)格昂貴， 定量檢測(cè)不準(zhǔn)確。
[0009] (6)免疫分析法可通過(guò)特異性抗體的制備，直接識(shí)別目標(biāo)分子本身，特異性強(qiáng)，靈 敏度高，成本低，不需要大型復(fù)雜的設(shè)備即可進(jìn)行，但是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法需要多步洗 滌，比較耗時(shí)耗力，因此其使用也受到一定的限制。
[0010] CN101710122A公開(kāi)了一種快速免疫檢測(cè)牛奶中0-內(nèi)酰胺酶的方法，該方法利 用包被與酶標(biāo)板上的鼠抗0-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體，與兔抗0-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體和 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體組成三抗體夾心法試劑，進(jìn)行三抗體夾心法免疫學(xué)檢測(cè)。 CN103134937A公開(kāi)了一種檢測(cè)牛奶中0 -內(nèi)酰胺酶的雙抗體夾心法，該方法通過(guò)政策的免 疫、細(xì)胞融合、篩選后得到15株0 -內(nèi)酰胺酶單克隆抗體，并與辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行兩兩配 對(duì)，以0 -內(nèi)酰胺酶為標(biāo)準(zhǔn)品建立了 0 -內(nèi)酰胺酶的夾心ELISA分析方法。但這些方法都 需要制備抗體，多次洗滌，耗時(shí)耗力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)奶制品中0 _內(nèi)酰胺酶的方法，特別是一種基于 熒光底物探針的熒光值定量檢測(cè)奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方法。該檢測(cè)方法具有靈敏度 高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0012] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0013] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)奶制品中0 _內(nèi)酰胺酶的方法，該方法以熒光素-0 _內(nèi)酰 胺類(lèi)抗生素作為熒光底物探針進(jìn)行酶促反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強(qiáng)度計(jì)算內(nèi)酰胺酶 的含量。
[0014] 本發(fā)明中的熒光底物探針可以被0-內(nèi)酰胺酶特異性地催化，其內(nèi)酰胺鍵斷裂， 然后變成兩個(gè)分子，其中一個(gè)為熒光素的基本結(jié)構(gòu)單元，其熒光得到很大程度地增強(qiáng)，而該 熒光強(qiáng)度和樣品中的內(nèi)酰胺酶的含量成正比，因此可以快速、特異性地檢測(cè)內(nèi)酰胺 酶的含量。
[0015] 本發(fā)明中，所述熒光底物探針的濃度為0.1-lyM，例如可以是0.lyM、0. 2yM、 0? 3yM、0. 4yM、0. 5yM、0. 6yM、0. 7yM、0. 8yM、0. 9yM或 1yM，優(yōu)選為 0? 4yM。
[0016] 優(yōu)選地，所述熒光底物探針對(duì)-內(nèi)酰胺酶具有廣譜性。
[0017] 本發(fā)明中，所述熒光底物探針由熒光素和0-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素通過(guò)有機(jī)合成的方 式合成。本發(fā)明的熒光底物探針被0-內(nèi)酰胺酶特異性催化的反應(yīng)過(guò)程如下：
[0018]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)奶制品中0-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于，所述方法以熒光素-0-內(nèi)酰 胺類(lèi)抗生素作為熒光底物探針進(jìn)行酶促反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強(qiáng)度計(jì)算內(nèi)酰胺酶 的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光底物探針的濃度為0. 1-1yM，優(yōu) 選為0? 4yM; 優(yōu)選地，所述熒光底物探針對(duì)內(nèi)酰胺酶具有廣譜性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述熒光底物探針由熒光素和0 -內(nèi) 酰胺類(lèi)抗生素通過(guò)有機(jī)合成的方式合成； 優(yōu)選地，所述內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素為青霉素、頭孢菌素、頭霉素或硫霉素中的任意一 種，優(yōu)選為青霉素或頭孢菌素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述酶促反應(yīng)時(shí)間為5-60min， 優(yōu)選為l〇_30min，進(jìn)一步優(yōu)選為15min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括在酶促反應(yīng)前，進(jìn) 行內(nèi)酰胺酶的富集； 優(yōu)選地，所述富集為利用免疫磁珠進(jìn)行富集。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 將免疫磁珠表面偶聯(lián)上0 _內(nèi)酰胺酶抗體，得到特異性識(shí)別0 _內(nèi)酰胺酶的免疫磁 珠探針； (2) 將步驟（1)得到的免疫磁珠探針置于待測(cè)分析液中，形成抗原-抗體免疫磁珠復(fù)合 物； (3) 將步驟（2)得到的復(fù)合物進(jìn)行磁分離，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)酰胺酶的富集，得到免疫磁 珠-0-內(nèi)酰胺酶復(fù)合物； (4) 向步驟（3)得到的免疫磁珠-0 -內(nèi)酰胺酶復(fù)合物中加入熒光底物探針進(jìn)行酶促反 應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強(qiáng)度計(jì)算內(nèi)酰胺酶的含量。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述免疫磁珠為超順納米磁珠； 優(yōu)選為粒徑在200-2000nm的超順納米磁珠； 優(yōu)選地，所述免疫磁珠為具有60-100emu/g的比飽和磁化強(qiáng)度的免疫磁珠； 優(yōu)選地，所述偶聯(lián)為共價(jià)偶聯(lián)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 采用比飽和磁化強(qiáng)度為60-100emu/g，粒徑在200-2000的超順納米磁珠，通過(guò)共價(jià) 偶聯(lián)的方式將識(shí)別內(nèi)酰胺酶的抗體偶聯(lián)在超順納米磁珠的表面，制備成超順納米免疫 磁珠，得到特異性識(shí)別內(nèi)酰胺酶的免疫磁珠探針； (2) 將步驟（1)得到的免疫磁珠探針置于待測(cè)分析液中，形成抗原-抗體免疫磁珠復(fù)合 物； (3) 將步驟（2)得到的復(fù)合物在室溫下渦流震蕩反應(yīng)20min，然后進(jìn)行磁分離，從而實(shí) 現(xiàn)0 -內(nèi)酰胺酶的富集，得到免疫磁珠-0 -內(nèi)酰胺酶復(fù)合物； (4) 向步驟（3)得到的免疫磁珠-0-內(nèi)酰胺酶復(fù)合物中加入0. 1-1yM的熒光 素_內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素作為熒光底物探針進(jìn)行酶促反應(yīng)5-60min，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強(qiáng) 度計(jì)算0-內(nèi)酰胺酶的含量。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)奶制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法。所述方法設(shè)計(jì)了一個(gè)能被β-內(nèi)酰胺酶特異性催化的熒光底物探針，該熒光底物探針的主要結(jié)構(gòu)是由熒光素的母環(huán)和β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素通過(guò)化學(xué)合成得到。β-內(nèi)酰胺酶可以催化熒光底物探針發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，根據(jù)反應(yīng)得到的熒光強(qiáng)度計(jì)算β-內(nèi)酰胺酶的含量。通過(guò)本發(fā)明的方法能檢測(cè)到0.1ng/mL的β-內(nèi)酰胺酶，比傳統(tǒng)的ELISA方法靈敏度提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)時(shí)間縮短到45min，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，而且可以大大降低檢測(cè)費(fèi)用。
【IPC分類(lèi)】G01N21-64, G01N33-53
【公開(kāi)號(hào)】CN104714006
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510058885
【發(fā)明人】蔣興宇, 陳翊平, 吳景, 曹豐晶, 張曉青, 王卓, 牛亞靜
【申請(qǐng)人】國(guó)家納米科學(xué)中心
【公開(kāi)日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日