一種分泌能力提高的天冬酰胺酶突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分泌能力提高的天冬酰胺酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-天冬酰胺酶（EC3. 5. 1. 1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對(duì)某些腫瘤的抑制作用，尤 其對(duì)急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物， 對(duì)骨髓細(xì)胞沒(méi)有抑制作用。
[0003]L-天冬酰胺酶有兩種類型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwiniachrysanthemi、Β·subtilis等均包含這兩種L-天冬酰胺酶，研究證實(shí)僅 L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，來(lái)自Escherichiacoli和ErwiniachrysanthemiL-天 冬酰胺酶II已被開(kāi)發(fā)為治療急性淋巴細(xì)胞白血病的有效藥物，目前研究的大部分是具有 抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
[0004] L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中 的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)生成，在食物中加入天冬酰胺酶可 以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳動(dòng)物及植物被證實(shí)含 有L-天冬酰胺酶。因?yàn)閯?dòng)物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工藝復(fù)雜，微生物具有 易培養(yǎng)，成本低等優(yōu)點(diǎn)，成學(xué)者研究的重點(diǎn)，目前研究的產(chǎn)L-天冬酰胺酶微生物主要包括 Escherichiacoli、Erwiniacarotovora、Erwiniachrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酉先 胺酶產(chǎn)量低，近年來(lái)利用基因工程技術(shù)將L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天 冬酰胺酶的高效表達(dá)，利用工程菌產(chǎn)L-天冬酰胺酶已成為一個(gè)重要來(lái)源。
[0005] 如何在食品安全菌株中表達(dá)L-天冬酰胺酶并提高L-天冬酰胺酶分泌能力，是目 前亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述問(wèn)題，以高效分泌信號(hào)肽菌株為基礎(chǔ)，通過(guò)構(gòu)建p43強(qiáng)啟動(dòng)子菌株， 實(shí)現(xiàn)天冬酰胺酶在食品級(jí)安全菌株-枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)，通過(guò)缺失N端殘基，進(jìn)一 步提高天冬酰胺酶的表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)天冬酰胺酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)，得到了天冬 酰胺酶分泌能力提高的菌株。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是一種分泌能力提高的天冬酰胺酶突變體，所述突變體的氨 基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0008] 所述突變體的核苷酸序列是SEQID N0. 2所示的序列。
[0009] 所述天冬酰胺酶是L-天冬酰胺酶II。
[0010] 本研究中的突變體為使用了WapA外源信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基礎(chǔ)上做的改造， 也就是在天然的（NCBI上公布的NC-000964. 3)天冬酰胺酶的基礎(chǔ)上先替換了信號(hào)肽，然后 再次基礎(chǔ)上對(duì)天冬酰胺酶N端進(jìn)行的缺失。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組枯草芽孢桿菌，所述重組枯草芽孢桿菌以 PP43NMK質(zhì)粒為載體，表達(dá)含有WapA信號(hào)肽的L-天冬酰胺酶突變體基因。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是以枯草芽孢桿菌WB600為 宿主構(gòu)建的。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述含有WapA信號(hào)肽的L-天冬酰胺酶突變體基因 的氨基酸序列是SEQIDN0. 1。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述含有WapA信號(hào)肽的L-天冬酰胺酶突變體基因 的核苷酸序列是SEQIDN0. 2。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述含有WapA信號(hào)肽的L-天冬酰胺酶突變體基因 是連接到PP43NMK質(zhì)粒的ΚρηI，PstI酶切位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600中進(jìn)行 表達(dá)。
[0016] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)天冬酰胺酶的方法，是以所述重組枯草 芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，將種子液按照4 %的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵培養(yǎng)。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法通過(guò)補(bǔ)加酸堿控制pH為7. 0,并控制發(fā)酵 液溶氧高于20%，發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加蔗糖和蛋白胨進(jìn)行高密度發(fā)酵。
[0018] 本發(fā)明還要求保護(hù)編碼所述突變體的核苷酸序列、表達(dá)所述突變體的基因工程 菌。
[0019] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述天冬酰胺酶突變體、所述的重組枯草芽孢桿菌在制備藥物 方面的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：
[0021] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的進(jìn)行氨基酸缺失突變，得到 了一種分泌能力提高的天冬酰胺酶突變體，并構(gòu)建了表達(dá)該突變體的重組菌。與野生天冬 酰胺酶相比，本發(fā)明的突變體的胞外分泌能力提高了 3. 14倍。本發(fā)明構(gòu)建的重組菌，發(fā) 酵生產(chǎn)天冬酰胺酶酶活達(dá)到407. 6U/mL，生產(chǎn)率達(dá)到9. 26lV(mL/h)，為目前報(bào)道的最高的 產(chǎn)量。其產(chǎn)量是含有野生型信號(hào)肽的枯草芽孢桿菌的4. 5倍（Cloning,expression,and characterizationofL-asparaginasefromanewlyisolatedBacillussubtilis B11-06)、重組大腸桿菌的 8. 71 倍（201510102732. 6)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1 :突變株發(fā)酵酶活；
[0023] 圖 2 :SDS_PAGE分析；
[0024] 圖3:補(bǔ)料分批發(fā)酵法WB43H-D30生產(chǎn)L-ASP。
【具體實(shí)施方式】[0025] 培養(yǎng)基：
[0026] LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl10g/L，ρΗ7· 0 ;
[0027] 發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10g/L，玉米漿5g/L，尿素lg/L，蔗糖35g/L，磷酸氫二鉀 2. 3g/L，磷酸二氫鉀L7g/L，硫酸鎂 0· 75g/L，氯化鈉 5g/L;調(diào)節(jié)ρΗ6· 8-7. 0。
[0028] 天冬酰胺酶酶活力的測(cè)定：
[0029] 采用分光光度法測(cè)定天冬酰胺酶酶活。1個(gè)單位天冬酰胺酶酶活定義為：酶活 定義：在37°C反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酰胺釋放Ιμπιο?NH3所需要的酶量 為一個(gè)酶活單位（U/ml)。酶活測(cè)定條件：37°C條件下，lml10mMΚ2ΗΡ04-ΚΗ2Ρ04(ΡΗ7. 5)， 0.lml189mM天冬酰胺，0.lml發(fā)酵上清液，保溫30分鐘，0. 5ml1. 5ΜTCA終止反應(yīng)。利用 ShimadzuUV-1240在436nm處測(cè)定吸光值，通過(guò)硫酸銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶 活。
[0030] 實(shí)施例1:強(qiáng)啟動(dòng)子高效表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0031] 設(shè)計(jì)L-ASP的上下游引物Pl、P2(如表1所示），以前期構(gòu)建的 pMA0911-w