一種植物抗旱、耐鹽相關蛋白AsSnRK及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關蛋白 AsSnRK及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 小麥作為我國重要的糧食作物之一，在國民經濟中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件對我國小麥造成的減產約800億公斤，嚴重影響著小麥的 產量和品質，制約著我國小麥糧食安全。隨著現代分子生物學的發(fā)展，利用基因工程技術從 分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關系，揭示植物對逆境脅迫信號傳導及基因 表達調控分子機理，為培育作物抗逆新種質提供了理論基礎。
[0003] 近年來，通過蛋白激酶的結構與功能分析來鑒定、闡明各種條件下基因表達調控 的機理得到了廣泛關注。蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶家族（SnRKs)在植物的許多生理過程中 起著重要的作用，例如激素信號傳導、非生物脅迫和植物的生長發(fā)育等 [45 48]。SnRK蛋白激 酶屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超級家族，由于基因序列的相似性和基因結構的不同，被 分為三個亞家族分別是：SnRKl，SnRK2和SnRK3。SnRK蛋白激酶三個亞家族都有相似的結 構特點，N-端都有一段能與其他蛋白相互作用的激酶結構域，并且結構在三個家族中是高 度變化的。
[0004] 第一個SnRK2成員是從ΑΒΑ處理的小麥胚胎cDNA文庫中分離得到的PKABA1， PKABA1的表達除受ΑΒΑ和干旱脅迫所誘導。SnRK2家族基因在功能上表現出一定的差異性， 擬南芥中SnRK家族成員中有9個基因被高滲脅迫（甘露醇或NaCl)誘導，5個基因被ΑΒΑ 誘導，但均不受冷脅迫誘導。擬南芥SnRK2. 6基因通過參與調控主要的新陳代謝過程和ΑΒΑ 途徑來控制氣孔的開度。水稻中SnRK基因，通過蛋白磷酸化分析表明所有成員都能被高滲 脅迫激活，但是只有0sSAPK8、0sSAPK9和OsSAPKIO這三個基因受ΑΒΑ誘導表達。小麥中 得SnRK2家族基因在功能上也有一定不同，在擬南芥中過表達TaSnRK2. 4基因可以明顯增 強植物的抗逆性；TaSnRK2. 7基因功能分析顯示，在糖代謝、降低滲透勢、增強光系統(tǒng)II的 活性以及促進植物生根等生理生化過程中起著重要作用；過表達TaSnRK2. 8基因的擬南芥 對干旱、低溫、高鹽等脅迫均有一定耐性。因此，利用抗旱、耐鹽的燕麥克隆、分離抗逆相關 SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性，對抗逆育種和農業(yè)生產會產生巨大推動作用 和經濟效益，具有非常重要應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關蛋白AsSnRK。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關蛋AsSnRK的基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組細胞。
[0009] 本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關蛋白AsSnRK的應用。
[0010] 本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關蛋白AsSnRK，來源于燕麥，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0011] 本發(fā)明的蛋白激酶由360個氨基酸殘基組成，是SnRK類蛋白激酶。自SEQIDNO. 1 的氨基末端第25-40位氨基酸殘基是ATP結合域，自SEQIDNO. 1的第128-142位氨基酸 殘基為絲氨酸/蘇氨酸結合域。
[0012] SEQIDNO. 1
[0013]
[0014] 為了使蛋白AsSnRK便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白 質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0015] 表1標簽的序列
[0016]
[0017] 根據本發(fā)明所公開的SEQIDNO. 1序列，本發(fā)明的轉錄因子AsSnRK可人工合成， 也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。
[0018] 根據本發(fā)明的AsSnRK編碼基因具有如SEQ ID N0. 2所示cDNA序列。
[0019]SEQIDNO. 2
[0022] 含有AsSnRK基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發(fā)明 的保護范圍。
[0023] 可用現有的植物表達載體構建含有AsSnRK基因的重組表達載體。
[0024] 所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與 mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導（Ti)質粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因3'端轉錄 的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
[0025] 使用AsSnRK構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒（CaMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子 (Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構 建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以 是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整 個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。
[0026] 為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 螢光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標記物（慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）或是 抗化學試劑標記基因（如抗除莠劑基因）等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0027] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育耐逆植物的方法。
[0028] 本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有AsSnRK基因的重組 表達載體導入植物細胞中，得到耐逆植物。
[0029] 利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的SnRK 蛋白激酶AsSnRK基因導入植物細胞，可獲得對干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強的 轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植 物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞 或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以 是雙子葉植物，如：擬南芥、小麥、燕麥、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿 等。
[0030] 本發(fā)明以抗旱、耐鹽性較強的燕麥（AvenasativaL.)為實驗材料，得到了抗逆相 關的AsSnRK蛋白及其編碼基因，并將其導入擬南芥，顯著提高了植物的抗旱、耐鹽性。本發(fā) 明的抗旱、耐鹽相關蛋白及其編碼基因對改良、增強擬南芥抗逆性，提高產量、加速抗逆分 子育種進程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實際意義。
[0031] 下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
【附圖說明】
[0032] 圖1為T1代AsSnRK轉基因煙草株系的鑒定。M:marker;1 :陰性對照；2 :水對照； 3~11 :不同轉基因煙草株系。
[0033] 圖2為轉基因煙草耐旱性鑒定。CK是野生型煙草，L1、L2、L3是3個獨立的AsSnRK轉基因煙草株系。
[0034] 圖3轉基因煙草耐鹽性鑒定。CK是野生型煙草，Ll、L2、L3是3個獨立的AsSnRK 轉基因煙草株系。
【具體實施方式】
[0035] 以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
[0036] 以下的實施例便于更好