一種新型甲型肝炎病毒株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒領域,具體講,涉及一種新型甲型肝炎病毒株及其應用。
【背景技術】
[0002] 甲肝病毒屬于小RNA病毒科(Picornaviridae),在1991年甲肝病毒被劃分為 h印atovirus屬且該屬僅包含甲肝病毒一個種;甲型肝炎病毒是一種顆粒較小,在體外為 無包膜狀態(tài)的球形顆粒,其基因組為單股正鏈RNA,基因組長度約為7400個核苷酸,主要通 過糞口途徑傳播,并在肝臟中復制。主要可以感染人和猴,根據(jù)基因組分析,目前甲肝病毒 分為6個基因型,其中I、II和III型主要感染人,IV、VandVI主要感染猴子,但甲肝病毒 僅包含一個血清型。甲肝病毒感染的臨床癥狀主要表現(xiàn)為疲乏,食欲減退,肝腫大,肝功能 異常,部分病例出現(xiàn)黃疸,主要表現(xiàn)為急性肝炎,無癥狀感染者常見。任何年齡均可患本病, 但主要為兒童和青少年。成人甲肝的臨床癥狀一般較兒童為重。
[0003] 甲型肝炎病毒常引起急性的肝炎,我國是甲型肝炎的高發(fā)區(qū)之一,其發(fā)病為各型 肝炎的首位,甲肝病毒有時也引起暴發(fā)。該病毒在體外較穩(wěn)定,耐熱且耐酸性條件,因此的 體外傳播的風險和時間也大大增加。甲肝病毒感染期較長,多數(shù)感染者病程在15-45天,平 均病程也長達30天,由于該病的高發(fā)病率及較長的病程,給人民健康及經(jīng)濟發(fā)展帶來嚴重 影響。甲肝病毒感染目前仍無有效的治療藥物,接種疫苗是目前人類對抗甲肝病毒的主要 手段和最經(jīng)濟的措施。迄今為止,甲肝病毒僅在人類、靈長類動物中發(fā)現(xiàn),未在其他動物中 發(fā)現(xiàn)有甲肝病毒的存在。但是目前我國采用的甲肝疫苗為減毒疫苗,存在毒力返祖和次傳 播問題,對接種者及其密切接觸者構成潛在的安全隱患。其次,對免疫功能低下或缺陷者高 度危險。此外,減毒活疫苗還存在熱穩(wěn)定性差、運輸貯存條件要求苛刻等缺點。
[0004] 然而,目前對于各種類型甲型肝炎病毒的基因組還了解甚少。對于新型甲型肝炎 病毒的發(fā)現(xiàn)并對其基因組特征和病毒特性的解析對于診斷、治療或預防人類甲肝將有很大 益處。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種新的型別的甲型肝炎病毒株,此病毒株多 聚蛋白區(qū)與已知人甲肝病毒氨基酸同源性為67%,同時可以定義為新的甲肝病毒血清型, 該病毒株的保藏編號為CGMCCN0. 11200。該甲型肝炎病毒株的全基因序列如SEQIDN0: 1所示。
[0006] 本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該甲型肝炎病毒株在制備用于預防和/或治療 甲型肝炎的藥物中的應用。其中,藥物選自甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗 或甲肝基因工程疫苗,所述的甲肝滅活疫苗包括亞單位疫苗。
[0007] 本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出一種甲型肝炎的疫苗,該疫苗中含有本發(fā)明的甲 型肝炎病毒株;所述的疫苗優(yōu)選為甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基 因工程疫苗,所述的甲肝滅活疫苗包括亞單位疫苗。
[0008] 本發(fā)明的第四發(fā)明目的在于提出一種用于制備抗體、雜交瘤細胞或抗血清的方 法,根據(jù)本發(fā)明的病毒株、該病毒株的裂解成份、該病毒株的基因工程蛋白或該病毒株的多 肽為免疫原進行制備。
[0009] 本發(fā)明的第五發(fā)明目的在于提出采用上述方法得到的制備抗體、雜交瘤細胞或抗 血清。
[0010] 本發(fā)明的第六發(fā)明目的在于提出該甲型肝炎病毒株在制備甲肝診斷制劑中的應 用。
[0011] 其中:診斷制劑包括抗原檢測試劑盒、抗體檢測試劑盒和核酸檢測試劑盒;抗原 檢測試劑盒中的抗原選自甲肝病毒、病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程蛋白或病毒株 的多肽;;抗體檢測試劑盒中的抗體選自甲肝病毒、病毒株的裂解成份、病毒株的基因工程 蛋白或病毒株的多肽制備的單抗或多抗;核酸檢測試劑盒包括普通PCR和實時熒光PCR等。
[0012] 下面對本發(fā)明的技術方案做進一步的解釋和說明。
[0013] 本發(fā)明涉及一種全新的甲型肝炎病毒株,其保藏號為CGMCCN0. 11200 ;通過對甲 型肝炎病毒基因組進行全序列的測定,全基因組長7581bp,其序列如SEQIDN0 :1所示。最 后進行病毒序列的全基因組擴增。本發(fā)明為檢測甲型肝炎病毒、研究甲型肝炎病毒感染機 制等目的奠定可靠的基礎。
[0014] 該甲型肝炎病毒株的分離和純化方法為:取帶毒動物的糞便加入到離心管中,加 入緩沖溶液震蕩后離心,粗純化病毒懸液;采用熒光定量PCR檢測病毒中甲型肝炎的RNA 載量;利用蔗糖/甘油密度離心收集甘油和30%蔗糖密度的樣品,脫糖后作為純化后抗原; 本發(fā)明采用土撥鼠糞便進行病毒的分離培養(yǎng),利用real-time實時定量初步鑒定為甲肝病 毒,RT-PCR技術獎病毒的VP1區(qū)進行基因擴增后測序,經(jīng)Genbank比對結果表明,該病毒為 甲型肝炎病毒一個新的型別。
[0015] 本發(fā)明的基因組全長序列或其片段通??梢杂肞CR擴增法和RACE方法獲得。
[0016] 本發(fā)明涉及該甲型肝炎病毒株在制備用于預防和/或治療甲型肝炎的藥物中的 應用。其中,藥物選自甲肝減毒活疫苗、甲肝滅活疫苗、甲肝多肽疫苗或甲肝基因工程疫苗。 其中減毒活疫苗、滅活疫苗、多肽疫苗或基因工程疫苗的制備可采用現(xiàn)有技術的方法進行 制備。這些技術在下列文獻中有全面的描述:《動物基因工程疫苗原理與方法》,《疫苗學》 (StanleyA.Plotkin和WaalterA編,梁曉峰等譯,2011)《疫苗研究與應用》(趙鎧編著, 2013年),《疫苗關鍵技術詳解》第二版(李琦涵著)。
[0017] 本發(fā)明還涉及制備抗體、雜交瘤細胞或抗血清的方法,具體可采用本發(fā)明的病毒 株、該病毒株的裂解成份、該病毒株的基因工程蛋白或該病毒株的多肽為免疫原按照現(xiàn)有 技術的方法進行制備。
[0018] 本發(fā)明的另一發(fā)明目的在于提出該甲型肝炎病毒株在制備甲肝診斷制劑中的應 用。診斷試劑盒的設計和制備可采用現(xiàn)有技術中的方法進行制備。對于PCR擴增法,可根據(jù) 本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列,尤其是開放閱讀框序列來設計引物,并按本領域技術人 員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板,擴增而得有關序列。在獲得線全長序列后, 根據(jù)初步全長序列設計引物,擴增2000~3000bp的長片段,以保證全長序列準確性。
[0019] 本發(fā)明的病毒株,可感染美洲旱獺,lX107C〇pieS/ml的病毒量能夠引起1-3美洲 旱獺的發(fā)病或死亡。
【附圖說明】:
[0020] 圖1為病毒接種于單層FRhK4細胞后的增殖變化圖;
[0021] 圖2為免疫電鏡結果圖;
[0022] 圖3為對動物攻毒后血液中轉氨酶含量變化圖;
[0023] 圖4為熒光定量PCR檢測份糞便中HAVRNA載量的結果圖;
[0024] 圖5為肝臟病理分析結果,圖A攻毒后旱獺肝臟病理分析結果,肝臟出現(xiàn)了細胞顆 粒樣變性;圖B為正常未攻毒旱獺肝臟病理分析結果。
[0025] 保藏說明:
[0026] 本發(fā)明中的甲型肝炎病毒株保藏編號為CGMCCN0. 11200,分類命名為!fepatitis Avirus。保藏單位:中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),地址:北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號,保藏日期:2015年9月29日。
[0027] 本發(fā)明的【具體實施方式】僅限于進一步解釋和說明本發(fā)明,并不對本發(fā)明的內(nèi)容構 成限制。
【具體實施方式】 [0028] 實施例1
[0029] 病毒的分離和純化:
[0030] 1.取2g糞便加入到離心管中,10mlPBS(+)(含終濃度為100U/ml的青霉素、 100ug/ml的鏈霉素)在震蕩器上強力震蕩20分鐘。
[0031] 2. 4°C、8000RPM離心20分鐘,取上清作為粗純化病毒懸液。
[0032] 3.采用熒光定量PCR(探針法)檢測糞便病毒懸液中新型HAVRNA載量:所述的 熒光定量PCR
[0033] 3.蔗糖梯度離心
[0034] 利用蔗糖/甘油密度離心,38000rpm,離心6小時,收集甘油和30%蔗糖密度的樣 品,脫糖后作為純化后抗原。
[0035] 4.病毒序列的全基因組擴增:
[0036] 在通過高通量測序獲得部分新型甲肝病毒序列的基礎上,通過Genomewalking Kit獲得6000bp的基因組,然后采用SMARTERRACEcDNAAmplificationKit擴增 3' 末端 和5末端的獲得全基因組序列,在此基礎上設計引物對全基因組進行長片段的驗證,保證 序列的準確性。
[0037] 經(jīng)檢驗,其全基因序列如SEQIDN0:1所示。
[0038] 5.病毒的分離培養(yǎng):上述粗純化病毒接種于單層FRhK4細胞,接種后每天收集 200微升細胞上清,培養(yǎng)到28天,用定量PCR檢測細胞上清中病毒,細胞雖為出現(xiàn)明顯CPE, 但細胞在培養(yǎng)過程中有增殖。病毒增殖含量變化圖如圖1所示。
[0039] 實施例2 :本發(fā)明的甲型肝炎病毒免疫小鼠制備抗血清及評價
[0040] 實驗動物:Balb/c小鼠,6周齡,共8只;
[0041] 將實施例1提純后定量的病毒皮下注射8只,首次劑量分別為1.0X105C〇pieS、 2. 5X104copies、1. 0X104copies、5. 0X103copies、1. 0X103copies、5. 0X102copies、 1. 5X102c〇pies/ml,每個劑量免疫1只小鼠(加相同體積弗氏完全佐劑),1只作為對照組, 兩周后劑量減半加強免疫一次(此時的佐劑為弗氏不完全佐劑),每只小鼠注射體積為100 微升純化病毒加100微升佐劑,采用多點注射方式。以PBS免疫組為對照,21天眼球采血, 收集血清備用;
[0042] 采用ELISA方法:將蔗糖/甘油純化病毒作為抗原包被96孔板,以小鼠免疫血清 作為一抗將蔗糖/甘油純化病毒作為抗原用包被液(20mMNaHC03pH9.0)稀釋,37°C包被 2h,PBS-T洗板3次,每孔加入200μ1 5%脫脂奶粉,37°C封閉lh,待檢測血清1:200稀釋后 加入包被好的板子,37°Clh;PBS-T洗3次,加入100μ1兔抗旱獺IgG(1:3000) 37°C,30min; PBS-T洗3次,TMB顯色lOmin;加入終止液50μ1終止反應,將酶標板置于酶標儀中,450nm 波長測定吸光度;測定結果如表2所示:
[0043] 表2 :小鼠多克隆抗體制備
[0044]
[0045] 實施例3 :本發(fā)明的甲型肝炎病毒的免疫電鏡
[0046] 1.將純化病毒材料0. 9m