一種禽流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的制備方法及其產(chǎn)品和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種禽流感標(biāo)記疫苗的制備方法及其產(chǎn)品和用途，特別涉及一種通過 MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)禽流感病毒、以及采用新的濃縮純化方法制備禽流感標(biāo)記疫苗的方法， 還涉及標(biāo)記疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢定。本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 疫苗接種是特異性預(yù)防禽流感病毒（AIV)的有效手段，制備安全有效的疫苗是成 功地預(yù)防、控制乃至最終消滅AIV的先決條件。疫苗使用的效果取決于快速大量疫苗的生 產(chǎn)和供給，最近幾年的流感流行和新的流感病毒爆發(fā)流行提示及時的疫苗接種是控制、預(yù) 防流感的最重要措施。但是各地流行的高致病性禽流感亞型不同，疫苗株和流行株的抗原 性不匹配或匹配程度低，給疫苗的開發(fā)和研制帶來的極大挑戰(zhàn)。目前國內(nèi)雞胚禽流感疫苗 存在的問題，主要為：
[0003] 1)疫苗誘導(dǎo)抗體妨礙識別感染和免疫禽類；
[0004] 2)疫苗預(yù)防禽流感發(fā)病而不能預(yù)防陰性感染；
[0005] 3)免疫產(chǎn)生的壓力促使禽流感病毒抗原突變逃逸免疫；
[0006] 4)免疫保護(hù)產(chǎn)生的時間晚，免疫保護(hù)期短；
[0007] 5)母嬰抗體對新生禽類免疫的干擾；
[0008] 6)疫苗對各種禽類的免疫效果不是很清楚；
[0009] 7)疫苗的質(zhì)量：安全性、免疫原性、有效性、穩(wěn)定性有待提高。
[0010] 用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗，雞胚供應(yīng)和生產(chǎn)周期長，難以應(yīng)對新發(fā)禽流感的防控；傳 統(tǒng)的獸用流感疫苗由于采用雞胚規(guī)?；a(chǎn)，疫苗盡管安全但容易引起嚴(yán)重的應(yīng)急反應(yīng)， 需要對工藝進(jìn)行改造、驗證。
[0011] 禽流感病毒滅活疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制禽流感的過程中發(fā)揮著 重要作用，但在疫苗制備過程中和產(chǎn)品中的一些宿主細(xì)胞蛋白殘余、核酸、牛血清白蛋白、 化學(xué)試劑等如果不加以控制，則會引起免疫動物產(chǎn)生嚴(yán)重副反應(yīng)甚至死亡，特別是可能使 動物致癌或影響肉類動物的食品安全。
[0012] 用宿主細(xì)胞MDCK培養(yǎng)病毒制備疫苗抗原或重組藥物，從用藥安全性考慮，必須 純化抗原去除影響禽流感病毒疫苗安全性的雜質(zhì)，以使其符合藥品質(zhì)量規(guī)范和安全要求， 同時盡量減少工藝或原輔材料中可能潛在的影響疫苗效果和安全的物質(zhì)，特別是要盡量避 免使用動物源性的原輔材料，以降低傳播動物疫病如流感、犬瘟熱、瘋牛病、狂犬病等傳染 病風(fēng)險。
[0013] 用生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感病毒抗原，提高了細(xì)胞密度、病毒抗原產(chǎn)量，同時增加了 細(xì)胞雜質(zhì)和添加物的量，也增加分離、濃縮、純化禽流感病毒的工藝步驟。過去因為禽流感 病毒疫苗抗原庫主要以雞胚作為抗原生產(chǎn)基質(zhì)，疫苗多為粗制疫苗。純化技術(shù)特別是現(xiàn)代 規(guī)?；瘽饪s、純化病毒抗原技術(shù)，如柱層析、蔗糖梯度超速離心技術(shù)、切向流中空纖維柱、深 層過濾模塊幾乎沒有在獸用疫苗生產(chǎn)中使用。這些技術(shù)和設(shè)備的應(yīng)用易于疫苗質(zhì)量控制和 保證，也易于GMP認(rèn)證和工藝驗證。
[0014] 現(xiàn)行生產(chǎn)滅活禽流感病毒抗原采用MDCK細(xì)胞為疫苗抗原生產(chǎn)基質(zhì)，MDCK細(xì)胞懸 浮培養(yǎng)后繼滅活、濃縮工藝達(dá)到部分純化，后經(jīng)乳化制成疫苗供使用。盡管該疫苗的免疫效 果達(dá)到疫苗規(guī)程要求，但按現(xiàn)代疫苗的安全性要求，雜質(zhì)含量高、總蛋白含量高，有效完整 病毒顆粒含量低，對有效抗原量、MDCK細(xì)胞DNA殘余、MDCK細(xì)胞蛋白殘余、牛血清白蛋白、滅 活劑、防腐劑以及生產(chǎn)過程化學(xué)添加物沒有明確界定和定量。疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和工藝應(yīng)不 斷提高，以保證疫苗穩(wěn)定、安全、有效。
[0015] 純化禽流感疫苗配方中禽流感M2蛋白含量甚微，且在各型流感病毒中高度保守， 含高度純化滅活完整禽流感病毒顆粒的疫苗，不引起動物產(chǎn)生抗M2抗體，而自然感染或隱 形感染禽流感動物產(chǎn)生M2蛋白抗體，因此通過檢測動物體內(nèi)的M2非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體存在 與否，可區(qū)別動物禽流感疫苗免疫和自然感染，發(fā)揮禽流感防控的免疫和檢測作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種大規(guī)模制備禽流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的方法及其 廣品和用途。
[0017] 本發(fā)明的一種禽流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步 驟：
[0018]a)病毒培養(yǎng)
[0019] 10000L生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到3-5X106個/ml，按照感 染復(fù)數(shù)Μ0Ι0. 01-0. 1接種禽流感病毒MDCK細(xì)胞適應(yīng)株，加入胰酶，使其終濃度達(dá)到50μg/ mL，攪拌速度不超過40rpm，4天收獲病毒液，用制備型低速連續(xù)流離心機(jī)離心除去細(xì)胞碎 片，同時收獲上清液和沉淀；沉淀在Triton-X-100存在的條件下裂解禽流感病毒感染細(xì)胞 和細(xì)胞膜碎片，所述Triton-X-100的終濃度為1-2% (v/v)，反復(fù)凍融3次后超聲3次，用 制備型低速連續(xù)流離心機(jī)離心收集上清液，合并上清液；
[0020] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒滴度為多107l〇gTCID5(]/mL，禽流感病毒血 凝素含量為彡30μg/ml，TritonX-100殘余量彡600μg/ml，抗生素殘余量為彡180μg/ ml；
[0021] b)膜深層過濾、微濾、超濾
[0022] 步驟a)得到的病毒上清液，依次經(jīng)過0. 65微米的膜深層過濾以及0. 45微米孔徑 的濾膜微濾后，經(jīng)膜孔截留值為750, 000-1000, 000MWC0的切向流超濾膜超濾，進(jìn)一步除去 完整的MDCK細(xì)胞和大分子物質(zhì)；
[0023] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒滴度為多107logTCID5Q/mL，禽流感病毒血 凝素含量為彡20yg/ml，內(nèi)毒素含量<40EU/ml，；
[0024] c)滅活；
[0025]甲醛滅活，滅活條件：2-8°C，時間7-10天；滅活澄清液經(jīng)膜孔截留值為 750, 000-1000, 000MWC0的切向流超濾膜超濾，進(jìn)一步除去小分子雜質(zhì)和縮小體積以便純 化；
[0026] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒血凝素含量為彡20μg/ml，Triton-X-100 殘余量< 50μg/ml，甲酸殘余量< 300μg/ml;內(nèi)毒素含量< 40EU/ml
[0027]d)親和層析以及在柱核酸酶解：
[0028] 包括：（1)采用硫酸纖維素或肝素作為親和層析介質(zhì)，將滅活后的禽流感病毒澄 清液吸附在介質(zhì)上，洗脫細(xì)胞DNA和細(xì)胞蛋白；（2)經(jīng)過步驟（1)操作后，用非特異的核酸 酶進(jìn)行在柱酶解；（3)經(jīng)步驟（2)操作后洗滌層析介質(zhì)，洗脫禽流感病毒；
[0029] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：體積為2000L，禽流感病毒血凝素含量多100μg/ml， MDCK細(xì)胞蛋白殘余量<50ng/ml，MDCK細(xì)胞殘余DNA量< 1000pg/ml，M2蛋白含量< 100ng/ ml，牛血清白蛋白殘余量< 100ng/ml，Triton-X-100殘余量< 50μg/ml;甲醛殘余量 < 50μg/ml，內(nèi)毒素含量< 30EU/ml;
[0030] e)疏水反應(yīng)層析
[0031] 步驟d)洗脫后的禽流感病毒液上樣于苯基瓊脂糖疏水層析柱，洗脫禽流感病毒， 得到純化后的禽流感病毒液；
[0032] 該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：體積為2000L，禽流感病毒血凝素含量多100μg/ml， MDCK細(xì)胞蛋白殘余量< 30ng/ml，MDCK細(xì)胞殘余DNA量< 500pg/ml，M2蛋白含量< 50ng/ ml，牛血清白蛋白殘余量< 50ng/ml，Triton-X-100殘余量< 50μg/ml;甲醛殘余量 < 50μg/ml，內(nèi)毒素含量< 30EU/ml;
[0033] f)透析、除菌過濾
[0034] 經(jīng)步驟d)純化后的禽流感病毒液稀釋為10000L，進(jìn)行透析，透析后的病毒液經(jīng) 0. 22μm膜除菌過濾；
[0035] 該步驟質(zhì)量控制指標(biāo)為：禽流感病毒血凝素含量多40yg/ml，內(nèi)毒素含量 < 10EU/ml，MDCK細(xì)胞蛋白殘余量< 10ng/ml，MDCK細(xì)胞DNA殘余量< 100pg/ml，甲醛殘余 量< 50μg/ml，TritonX-100殘余量< 5μg/ml，禽流感M2蛋白含量< 10ng/ml，牛血清白 蛋白殘余量< 20ng/ml;
[0036]g)乳化：采用適宜的水包油包水佐劑進(jìn)行乳化即得。
[0037] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟d)中用非特異的核酸酶在柱酶解包括按每毫升病毒液 加入1-100單位的量，將非特異性、高活性的核酸酶加入到層析介質(zhì)中，2-8°C作用9-18小 時。
[0038] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟e)中所述的透析采用的透析液中含有蔗糖6% (w/v)、 單鹽酸精氨酸1% (w/v)、一水谷氨酸鈉0.05% (w/v)、水解明膠0.5% (w/v)、無水磷酸氫 二鉀1%(￥八）以及磷酸氫二鉀0.25%(￥八）。
[0039] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟f)中所述的乳化采用的佐劑包括細(xì)胞因 子、油乳佐劑和合成佐劑，優(yōu)選為ISA25、QS-21、MF59以及鋁佐劑。
[0040] 如上，本發(fā)明提供了一種投入/產(chǎn)出效果明顯的，用于制備高效、高純度的完整禽 流感全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的方法。本發(fā)明與純化流感病毒方法以及質(zhì)量控制方法、質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)，特別是新的純化方法和質(zhì)量控制有關(guān)（圖1和圖2)。
[0041] 1、溶解宿主細(xì)胞
[0042] 由于禽流感病毒在MDCK細(xì)胞中增殖，形成細(xì)胞病變裂解了細(xì)胞，部分病毒釋放， 部分病毒在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞碎片上，本發(fā)明采用連續(xù)低速離心機(jī)收集病毒上清，對沉淀進(jìn)行 超聲、凍融裂解后再進(jìn)行低速離心，合并2部分上清。有許多方法如凍融、高滲、超聲、裂解 劑裂解可溶解細(xì)胞、釋放禽流感病毒，但從規(guī)?；a(chǎn)的方便和適用角度考慮，本發(fā)明采 取凍融、超聲、裂解劑溶解細(xì)胞，以提高禽流感病毒產(chǎn)量。
[0043] 2、裂解劑
[0044] 按照本發(fā)明，幾乎除培養(yǎng)工藝中沒有使用裂解劑，選取藥學(xué)、獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為安全的表 面活性劑TritonX-100作為裂解劑，濃度為1-2% (v/v)。
[0045] 3、核酸酶
[0046] 許多核酸酶可以在實驗室使用，如Benzonase、Pulmozyme或其他DNA酶、核酸酶， 但從獸醫(yī)學(xué)、藥學(xué)安全角度考慮，本發(fā)明選用Benzonase，其可通過斷裂磷酸酯鍵而水解核 酸。使用濃度1-100單位/ml;
[0047] 4、深層過濾、微濾、超濾
[0048] 流感病毒收獲病毒液經(jīng)深層過濾（0. 65微米孔徑）去除碎片，再經(jīng)微濾（0. 45微 米孔徑），切向流超濾（750KD)除去完整的MDCK細(xì)胞和大分子物質(zhì)。滅活澄清液經(jīng)膜孔截 留值為750, 000-1000, 000MWC0的切向流超濾膜超濾后，進(jìn)入親和層析柱，進(jìn)一步除去MDCK 殘余蛋白和殘余DNA，經(jīng)親和層析病毒液通過超濾、除菌過濾、進(jìn)入下一工藝步驟。
[0049] 5、親和層析以及疏水反應(yīng)層析
[0050] 按照發(fā)明，單一的層析或連續(xù)流超速離心或蔗糖密度梯度離心已經(jīng)不能滿足禽流 感標(biāo)記疫苗的質(zhì)量要求和標(biāo)準(zhǔn)，研究表明，中去除效果，親和層析和疏水反應(yīng)層析更適合對 大量禽流感病毒液中雜質(zhì)DNA的處理。
[0051] 本發(fā)明在禽流感病毒純化采用了一種親和層析、在位核酸酶解、疏水反應(yīng)層析的 組合，除去了大量的核酸，并濃縮了病毒原液。由于分子篩層析載量極限為柱體積的20%， 且分離效果依賴蛋白濃度，限制了分子篩層析在禽流感疫苗工業(yè)化生產(chǎn)的使用。本發(fā)明的 優(yōu)點在于：（1)流速快30倍；（2)結(jié)合能力強(qiáng)；(3)收率高，（4)不需安裝和清潔驗證；（5) 做成濾芯，沒有使用壽命和貯存安全的擔(dān)憂；
[0052] 6、超濾、濃縮、透析
[0053] 禽流感病毒培養(yǎng)液、原液、純化液至少需要透析，去除小分子雜質(zhì)和化學(xué)物 質(zhì)殘余，也需要控制可操作體積，發(fā)明中提供了透析和超濾濃縮的步驟，使禽流感病 毒達(dá)到部分純化和濃縮，發(fā)明中的超濾優(yōu)先采用切向流的中空纖維柱，膜孔截留值為 750, 000-1000, 000MWC0,具有對禽流感病毒剪切小、病毒破損少的優(yōu)點。
[0054] 用超濾透析和緩沖液交換除去生產(chǎn)過程中溶液中的糖、鹽、非液體溶劑、低分子物 質(zhì)，改變穩(wěn)定禽流感病毒的粒子和pH環(huán)境，本發(fā)明在收獲裂解后的工藝步驟中在純化步 驟轉(zhuǎn)接之前、疫苗配制之前都用超濾，調(diào)整緩沖液、調(diào)整體積，濃縮病毒液適合后續(xù)純化的 載量要求。
[0055] 7、高度純化
[0056] 細(xì)胞培養(yǎng)后流感病毒包括重組流感病毒去除雜質(zhì)的純化方法是經(jīng)過低速離心、凍 融超聲細(xì)胞沉淀、低速離心收的收獲病毒液合并病毒液，再經(jīng)深層過濾、超濾，親和層析、在 位核酸酶解、疏水反應(yīng)層析組合，連續(xù)流蔗糖密度梯度離心，增強(qiáng)了流感疫苗的安全性，擴(kuò) 展了疫苗的適用種群和范圍，特別是禽的特殊種群。
[0057] 首先，不含有害雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞MDCK蛋白、宿主細(xì)胞MDCK的DNA、不含動物源性 的活性物質(zhì)，如酶或牛血清、工藝過程中的添加的化學(xué)物質(zhì)殘余。盡管目前暫未有國家標(biāo)準(zhǔn) 的細(xì)胞流感疫苗，特別是禽流感細(xì)胞培養(yǎng)疫苗標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)程，但細(xì)胞性流感疫苗如MDCK細(xì)胞 流感疫苗制造過程必須說明、驗證安全。本發(fā)明的標(biāo)記疫苗工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)說明了其安全 性。用傳代的MDCK細(xì)胞制備流感