一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗制備領域，尤其涉及一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型忠的一些毒株引起的急性呼吸道傳染病。 動物禽流感的大規(guī)模爆發(fā)，不僅給養(yǎng)殖戶帶來嚴重損失，也危害到人類的身體健康，同時帶 來了重大的經(jīng)濟損失。
[0003] -般采用動物禽流感疫苗來預防與治療動物禽流感。
[0004] -方面，現(xiàn)有的技術中，一般選取滅活的毒株來制備疫苗。一般用雞胚生產(chǎn)，病毒 適應雞胚后在雞胚中的生長，疫苗生產(chǎn)周期長。另外病毒在雞胚的傳代的過程中很容易發(fā) 生變異，導致疫苗的免疫效果不好。很難達到有效預防的目的。
[0005] 另一方面，現(xiàn)有的疫苗多采用注射的形式接種，接種復雜，易產(chǎn)生疼痛感，因此，研 宄一款能夠口服的疫苗具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 鑒于現(xiàn)有技術所存在的問題，提供一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法， 具有免疫效果好、服用方便等優(yōu)點。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0008] 一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)構建含有HA基因的重組質(zhì)粒，將其轉染到表達細胞中，進行培養(yǎng)、表達；
[0010] 2)將步驟1)表達的蛋白進行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒；
[0011] 3)將步驟2)得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干；
[0012] 4)將步驟3)得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均 勻，得到混合液；
[0013] 5)將步驟4)得到的混合液，包裝，制劑、福射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫 苗。
[0014] 進一步，所述凍干粉在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為1%。所述單磷酰脂質(zhì)A在混合溶 液中的質(zhì)量分數(shù)為〇. 2 %，所述氫氧化鋁在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為0. 03 %。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法， 通過將凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，制成禽流感亞單位口服疫 苗。不需要注射，緊緊通過口服就可以達到很好的免疫效果。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗對小鼠的免疫效果圖。
【具體實施方式】
[0017] 以下結合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0018] 本發(fā)明所述的實驗方法若無特別說明均采用本領域的常規(guī)技術手段，可參見說明 書或者分子生物學克隆指南第三版。本發(fā)明所使用的實驗試劑若無特別說明均為本領域的 常規(guī)實際，市場上可以購買到。
[0019] 實施例1培養(yǎng)病毒株A/Anhui/1/2013 (H7N9)，提取病毒株中的RNA
[0020] 所述 A/Anhui/1/2013 (H7N9)來自中國疾控中心（CDC)。
[0021] 將禽流感病毒株A/Anhui/1/2013 (H7N9)取0. 2mL接種于15日齡雞胚，37攝氏度 培養(yǎng)40h，置于4攝氏度冰箱過夜，無菌收集尿囊液。取病毒尿囊液500mL4攝氏度條件下 6000rpm離心20min收集上清，25000rpm離心2h超速離心，沉淀用5mLTEN重懸，用質(zhì)量分 數(shù)10 % -40 %的蔗糖梯度離心，35000rpm離心2h，收集質(zhì)量分數(shù)30 % -35 %的病毒帶，透析 脫糖，用無 RNA酶的TE緩沖液懸浮，分裝，凍存。
[0022] 利用QIANGEN Rneasy Mini Kit試劑盒提取RNA，具體操作步驟參見說明書。
[0023] 實施例2利用反轉錄PCR獲得cDNA
[0024] 取RNA菌懸液10微升，加入20pmol引物1 (如SEQ ID NO :3所示核酸序列）混 勻后置于70攝氏度水浴中反應lOmin，再加入5*反轉錄酶緩沖液、0. lmol/LDTT2微升、 2. 5mmol/LdNTP 4微升、RNA酶抑制劑1微升、M-MLV反轉錄酶10U，37攝氏度水浴lh，97攝 氏度作用l〇min。獲得cDNA。
[0025] 實施例3以獲得的cDNA為模板，擴增HA基因
[0026] 按照如下反應體系配置反應液：
[0027]
【主權項】
1. 一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 構建含有HA基因的重組質(zhì)粒，將其轉染到表達細胞中，進行培養(yǎng)、表達； 2) 將步驟1)表達的蛋白進行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒； 3) 將步驟2)得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干； 4) 將步驟3)得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均勻， 得到混合液； 5) 將步驟4)得到的混合液，包裝，制劑、輻射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫苗。
2. 根據(jù)權利要求1所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，所 述凍干粉在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為1%。
3. 根據(jù)權利要求1所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，所 述單磷酰脂質(zhì)A在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為0. 2%。
4. 根據(jù)權利要求1所述一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，其特征在于，所 述氫氧化鋁在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為0. 03%。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組禽流感亞單位口服疫苗的制備方法，包括以下步驟：構建含有HA基因的重組質(zhì)粒，將其轉染到表達細胞中，進行培養(yǎng)、表達；將表達的蛋白進行純化，獲得重組禽流感亞單位顆粒；將得到的重組禽流感亞單位顆粒凍干；將得到的凍干粉溶解于單磷酰脂質(zhì)A和氫氧化鋁的混合溶液中，混合均勻，得到混合液；將得到的混合液，包裝，制劑、輻射滅菌，獲得重組禽流感亞單位口服疫苗。所述凍干粉在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為1％。所述單磷酰脂質(zhì)A在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為0.2％，所述氫氧化鋁在混合溶液中的質(zhì)量分數(shù)為0.03％。本發(fā)明制成禽流感亞單位口服疫苗,不需要注射，僅僅通過口服就可以達到很好的免疫效果。
【IPC分類】A61K39-145, C12N15-85, A61P31-16
【公開號】CN104645325
【申請?zhí)枴緾N201510085590
【發(fā)明人】王華瑞, 李永亮
【申請人】武漢思齊源生物科技有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月16日