一種禽流感病毒效價(jià)的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種禽流感病毒效價(jià)的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是嚴(yán)重危害家禽和野禽的一種烈性傳 染病原，有可能引起全球的流感大流行，是威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的最重要的疫病之一。目前疫苗 免疫是降低發(fā)病率和死亡率的最主要的方法，在常規(guī)的禽流感疫苗生產(chǎn)過程中，雞胚是禽 流感病毒最為常用的一種培養(yǎng)基質(zhì)，但用雞胚尿囊液制備抗原過程中禽流感病毒易引起抗 原性變異;大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)還存在雞胚數(shù)量不足和潛在外源病毒污染的問題，尤其在禽流感 爆發(fā)時(shí)。因此為了克服運(yùn)些局限和不足，急需要利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)制備的疫苗，運(yùn)樣 的疫苗具有無外源因子污染、易于規(guī)?；a(chǎn)、可W較好的維持病毒抗原穩(wěn)定等特點(diǎn)。
[0003] 目前我國對(duì)于禽流感病毒的效價(jià)測(cè)定方法為利用雞胚培養(yǎng)后測(cè)定血凝效價(jià)，計(jì)算 EID50,該種方法因使用雞胚而受到一定的限制，如夏季高溫對(duì)長途運(yùn)輸?shù)碾u胚質(zhì)量造成一 定的影響，雞胚中可能存在外源性病原污染等，運(yùn)些都會(huì)導(dǎo)致效價(jià)測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定或不準(zhǔn) 確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定 性的禽流感病毒效價(jià)的測(cè)定方法。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種禽流感病毒效價(jià)的測(cè)定方法，包括W下步驟： 1) 細(xì)胞傳代:將處于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并使細(xì)胞密度為1-2 X105個(gè)/ml,然后將MDCK細(xì)胞鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔10化L，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于溫度37 °C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28-3化； 2) 稀釋樣品:將禽流感病毒液用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍倍比稀釋，得到不同稀釋度的禽 流感病毒液，備用； 3) 洗板:將上述步驟1)長滿MDCK細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用0.0 lmol/L 的憐酸鹽緩沖液洗涂3次； 4) 加液:在細(xì)胞培養(yǎng)板上設(shè)樣品組和對(duì)照組，樣品組每孔加入0.1ml含膜酶的DMEM培養(yǎng) 液，對(duì)照組每孔加入0.2ml含膜酶的DMEM培養(yǎng)液，所述DMEM培養(yǎng)液中膜酶的質(zhì)量濃度為50yg /ml;然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于35°C環(huán)境中解育15min; 5) 接毒:取上述步驟2)適當(dāng)稀釋度的禽流感病毒液接種細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種5孔，每 孔0.1ml; 6) 培養(yǎng)：將步驟5)得到的細(xì)胞培養(yǎng)板置于35°C、0)2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)100- 120h； 7) 測(cè)定病毒效價(jià)：觀察細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞病變情況，使用Reed-Muench方法計(jì)算 TCI化ο值，測(cè)定病毒效價(jià)。
[0006] 本發(fā)明細(xì)胞病變的判定方法為：當(dāng)細(xì)胞孔內(nèi)100%細(xì)胞發(fā)生病變判定為有病毒感 染，計(jì)入細(xì)胞發(fā)生CPE數(shù)，根據(jù)觀察到的細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞病變情況（即細(xì)胞發(fā)生CPE數(shù)）， 使用Reed-Muench方法計(jì)算TCIDso值。
[0007] 本發(fā)明所述TCID50的計(jì)算方法按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》中病毒 半數(shù)致死(感染)量(LD日日、E ID日日、TCID日日)的測(cè)定方法。
[0008] 所述細(xì)胞培養(yǎng)板為96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0009] 所述DMEM培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基用超純水配制而成，并調(diào)節(jié)抑至7.4。所述DMEM培養(yǎng) 基為CIBC0公司生產(chǎn)。
[0010] 本發(fā)明采用W上技術(shù)方案，通過對(duì)MDCK細(xì)胞進(jìn)行傳代鋪細(xì)胞板，接種不同稀釋度 的禽流感病毒，一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，通過觀察細(xì)胞病變計(jì)算病毒的含量。本發(fā)明方法 因使用細(xì)胞測(cè)定，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，因排除了細(xì)胞株的外源性病源污染，使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。
[0011] 發(fā)明專利(CN 102703602 B)公開了一種重組禽流感細(xì)胞源滅活疫苗抗原病毒含 量的測(cè)定方法相比，本發(fā)明與該發(fā)明專利相比具有W下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明的操作步驟中具體限定了接毒前的細(xì)胞處理，其中加入含膜酶的DMEM培養(yǎng)液 35°C處理15min，該步驟更利于禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上的增殖，使發(fā)生病變的細(xì)胞孔可達(dá) 到100%病變。
[0012] 2、發(fā)明專利(CN 102703602 B)血凝試驗(yàn)的結(jié)果受所使用的1%雞紅血球的質(zhì)量，溫 度的影響，結(jié)果觀察時(shí)對(duì)血凝情況的判斷存在人為主觀判斷的差異，因此其操作更加繁瑣， 且存在判定誤差;而本發(fā)明只需要將100%細(xì)胞發(fā)生病變的孔計(jì)入細(xì)胞發(fā)生C陽數(shù)，而不需要 利用血凝實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，因此對(duì)病毒效價(jià)的測(cè)定更為準(zhǔn)確。
[0013] 3、本發(fā)明中所使用的膜酶為1:250的普通膜酶，與TPCK-膜酶相比，產(chǎn)毒效果無顯 著差異，但成本降低很多。
【具體實(shí)施方式】
[0014] -種禽流感病毒效價(jià)的測(cè)定方法，包括W下步驟： 1) 細(xì)胞傳代:將處于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并使細(xì)胞密度為1-2 X105個(gè)/ml,然后將MDCK細(xì)胞鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔10化L，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于溫 度37°C、C〇2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28-3化； 2) 稀釋樣品:將禽流感病毒液用pH 7.4的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍倍比稀釋，得到不同稀 釋度的禽流感病毒液，備用； 3) 洗板:將上述步驟1)長滿MDCK細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用0.0 lmol/L 的憐酸鹽緩沖液洗涂3次； 4) 加液:在細(xì)胞培養(yǎng)板上設(shè)樣品組和對(duì)照組，樣品組每孔加入0.1ml含膜酶的pH 7.4的 DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入0.2ml含膜酶的抑7.4的DMEM培養(yǎng)液，所述DMEM培養(yǎng)液中膜酶 的質(zhì)量濃度為50yg /ml;然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于35°C環(huán)境中解育15min; 5) 接毒:取上述步驟2)適當(dāng)稀釋度的禽流感病毒液接種細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種5孔，每 孔0.1ml; 6) 培養(yǎng)：將步驟5)得到的細(xì)胞培養(yǎng)板置于35°C、0)2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)100- 120h； 7)測(cè)定病毒效價(jià)：觀察細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞病變情況，使用Reed-Muench方法計(jì)算 TCI化0值，測(cè)定病毒效價(jià)； 其中細(xì)胞病變的判定方法為：當(dāng)細(xì)胞孔內(nèi)100%細(xì)胞發(fā)生病變判定為有病毒感染，計(jì)入 細(xì)胞發(fā)生CPE數(shù)。
[001引實(shí)施例1 一種禽流感病毒效價(jià)的測(cè)定方法，包括W下步驟： 1) 細(xì)胞傳代:將處于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并使細(xì)胞密度為2 X 105個(gè)/ml,然后將MDCK細(xì)胞鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔10化L，并將細(xì)胞培養(yǎng)板置于溫度 37°C、C02濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28h; 2) 稀釋樣品：將禽流感病毒液用抑7.4的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行10倍倍比稀釋至ΙΟΛ得到 不同稀釋度的禽流感病毒液，備用； 3) 洗板:將上述步驟1)長滿MDCK細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用0.0 lmol/L 的憐酸鹽緩沖液洗涂3次； 4) 加液:在細(xì)胞培養(yǎng)板上設(shè)樣品組和對(duì)照組，樣品組每孔加入0.1ml含膜酶的pH 7.4的 DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入0.2ml含膜酶的抑7.4的DMEM培養(yǎng)液，所述DMEM培養(yǎng)液中膜酶 的質(zhì)量濃度為50yg /ml;然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于35°C環(huán)境中解育15min; 5) 接毒:取上述步驟2)10-6-10-8稀釋度的禽流感病毒液接種細(xì)胞，每個(gè)