一種口蹄疫病毒樣顆粒疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種口蹄疫病毒樣顆粒疫苗及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫的病原是口蹄疫病毒（Foot-andnouth disease virus，F(xiàn)MDV)，屬于小 RNA 病毒科，病毒基因組為單股正鏈RNA，約由8500個(gè)核苷酸組成，具有7個(gè)血清型（A、0、C、 SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1)和多種亞型。我國主要流行的是0型、C型和亞1型。各血清 型的免疫無交叉保護(hù)，疫苗的配制往往隨流行而變化。
[0003]目前使用的口蹄疫疫苗是經(jīng)BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、經(jīng)雙乙烯亞胺滅活、乳化制備 而成，有許多缺點(diǎn)，如需要生物安全水平3級以上的生產(chǎn)設(shè)施、病毒滅活不徹底、病毒逃逸 的風(fēng)險(xiǎn)、難以區(qū)別動(dòng)物感染和免疫、許多疫苗主種子批在細(xì)胞培養(yǎng)過程的適應(yīng)性問題。為克 服以上問題，研發(fā)新的口蹄疫疫苗成為必然。
[0004] 病毒樣顆粒疫苗保持了口蹄疫病毒滅活疫苗良好的免疫原性、高度安全性，可區(qū) 別動(dòng)物是否感染和免疫（DIVA)，其生產(chǎn)過程中避免使用活的口蹄疫病毒，可以無血清懸浮 培養(yǎng)。
[0005] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在真核和昆蟲細(xì)胞表達(dá)P12A，其P12A上有3個(gè)突變，形成75S病毒樣 顆粒，而不需3C的酶解。大多口蹄疫病毒樣顆粒是用P12A3C在宿主細(xì)胞表達(dá)組裝，由于3C 對宿主細(xì)胞的毒性，使病毒樣顆粒的產(chǎn)量低且病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)不完整，因而造成病毒樣顆 粒產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高。本發(fā)明克服了篩選高水平穩(wěn)定表達(dá)口蹄疫病毒樣顆粒的細(xì)胞系較 難的問題，解決了口蹄疫病毒顆粒在表達(dá)細(xì)胞系組裝中消化宿主細(xì)胞蛋白而使工程細(xì)胞死 亡的問題，從而增加了 口蹄疫病毒的表達(dá)量，進(jìn)而采用昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選了高表達(dá)條件，特別 是馴化了高PH條件下無血清培養(yǎng)高表達(dá)生產(chǎn)病毒樣顆粒的昆蟲細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 疫苗免疫原性主要取決于其空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，對于口蹄疫病毒樣顆粒疫苗則取決 于生產(chǎn)抗原的工程細(xì)胞穩(wěn)定、高效表達(dá)重組蛋白且能夠組裝。本發(fā)明首先通過表達(dá)P12A(3 個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，建立了類似自然標(biāo)準(zhǔn)75SFMDV病毒樣 顆粒和無血清懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)類似自然的75S FMDV病毒樣顆粒的方法，此方法提 高了 口蹄疫病毒樣顆粒的表達(dá)量，因而也提高了組裝成熟病毒樣顆粒的量。在上述基礎(chǔ)上， 本發(fā)明進(jìn)一步提供了無血清懸浮培養(yǎng)馴化昆蟲細(xì)胞SfHpH穩(wěn)定高效生產(chǎn)口蹄疫病毒顆粒 的方法，同時(shí)提供了生產(chǎn)重組口蹄疫病毒顆粒疫苗的檢驗(yàn)和評估方法。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0008] -種口蹄疫病毒樣顆粒疫苗，其特征在于，通過以下方法制備得到：將口蹄疫病毒 衣殼前體蛋白P12A cDNA序列克隆到真核表達(dá)載體中，所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 使其表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白并組裝成口蹄疫病毒樣顆粒，純化、乳化，即得；
[0009] 其中，所述的衣殼前體蛋白P12A的結(jié)構(gòu)蛋白VPl在原始口蹄疫病毒VPl蛋白基因 的基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下位點(diǎn)的突變：Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A連接處Lys210 - Glu。
[0010] -種口蹄疫病毒樣顆粒疫苗，其特征在于，通過以下方法制備得到：將口蹄疫病毒 衣殼前體蛋白P12A cDNA序列克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中，所得的重組桿狀轉(zhuǎn) 移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組桿狀質(zhì)粒，重組桿狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf21昆 蟲細(xì)胞產(chǎn)生感染性重組桿狀病毒，重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染SfHpH細(xì)胞，使其表達(dá)口蹄疫病毒衣 殼蛋白并組裝成口蹄疫病毒樣顆粒，純化，乳化，即得；
[0011] 其中，所述的衣殼前體蛋白P12A的結(jié)構(gòu)蛋白VPl在原始口蹄疫病毒VPl蛋白基因 的基礎(chǔ)上進(jìn)行了以下位點(diǎn)的突變：Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A連接處Lys210 - Glu ; 所述的SfHpH細(xì)胞為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)pH7. 0-7. 4適應(yīng)的昆蟲細(xì)胞Sf21。
[0012] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的真核表達(dá)載體為pTT5或pVIJNS ;所述的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞為BHK-21細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的SfHpH細(xì)胞采用以下方法馴化得到：Sf21細(xì)胞首先用 pH 6. 0的無血清培養(yǎng)基完全換液，之后每隔2-5天用調(diào)節(jié)好pH的無血清培養(yǎng)基換液，經(jīng)過 2月連續(xù)從pH6. 0到7. 4,每次提高0. 2pH單位，不斷提升Sf21細(xì)胞的pH壓力選擇，獲得了 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)PH7. 0-7. 4適應(yīng)的穩(wěn)定的昆蟲細(xì)胞Sf21，即為SfHpH細(xì)胞。
[0014] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的無血清培養(yǎng)基為Sf-90011-BES-MISS培養(yǎng)基， Sf-90011-BES-MISS培養(yǎng)基含50mM N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙磺酸、124mM蔗糖、5mM 葡萄糖、50mM氯化鈉、20mM氯化鉀、3mM氯化HlOmM硫酸鎂、0. 1% w/v嵌段式聚醚F-68。
[0015] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的口蹄疫病毒來源于豬、牛、羊以及駱駝的0型口蹄疫 病毒。
[0016] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種制備所述的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的方法，其特征 在于，包括以下步驟：
[0017] (1)合成口蹄疫病毒病毒全長傳染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf [-]質(zhì)粒，制成重組質(zhì)粒 pGEM-FLOSFS ;
[0018] (2)以重組質(zhì)粒pGEM-FLOSFS為模板，合成口蹄疫病毒衣殼前體蛋白P12A cDNA序 列，插入質(zhì)粒PGEM-3Z，制成重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ;
[0019] (3)以重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-Pl-2A為模板，采用PCR方法進(jìn)行口蹄疫病毒衣殼前體 蛋白P12A的結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A連接處Lys210 - Glu的突 變，突變后產(chǎn)物連接到PGEM-3Z克隆質(zhì)粒上，制成重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、 VP1E83K、VP1C134S)，重組質(zhì)粒在在大腸桿菌DH5 α擴(kuò)增，純化，測序確認(rèn)；
[0020] (4)重組質(zhì)粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切產(chǎn)物亞克隆至真核表達(dá)載體pTT5或pVIJNS中，制成重組質(zhì)粒pTT5-mP12A 或pVlJNS-FMDV0mP12A，重組質(zhì)粒在在大腸桿菌DH5 α擴(kuò)增，純化，測序確認(rèn)；
[0021] (5)重組質(zhì)粒pTT5-mP12A或pVlJNS-FMDV0mP12A轉(zhuǎn)染ΒΗΚ-21細(xì)胞，經(jīng)無血清懸浮 培養(yǎng)后離心收集上清，經(jīng)純化制得口蹄疫病毒樣顆粒，乳化，即得。
[0022] 本發(fā)明還提供了另一種制備所述的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的方法，其特征在于， 包括以下步驟：
[0023] (1)合成口蹄疫病毒病毒全長傳染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf[-]質(zhì)粒，制成重組質(zhì)粒 pGEM-FLOSFS ;
[0024] (2)以重組質(zhì)粒pGEM-FLOSFS為模板，合成口蹄疫病毒衣殼前體蛋白P12A cDNA序 列，插入質(zhì)粒PGEM-3Z，制成重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ;
[0025] (3)以重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-Pl-2A為模板，采用PCR方法進(jìn)行口蹄疫病毒衣殼前體 蛋白P12A的結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A連接處Lys210 - Glu的突 變，突變后產(chǎn)物連接到PGEM-3Z克隆質(zhì)粒上，制成重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、 VP1E83K、VP1C134S)，重組質(zhì)粒在在大腸桿菌DH5 α擴(kuò)增，純化，測序確認(rèn)；
[0026] (4)重組質(zhì)粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切產(chǎn)物亞克隆至克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中，制成重組質(zhì)粒 pFast-Bac-FMDV0mP12A，重組桿狀病毒DNA制備是使用Bac-to-Bac系統(tǒng)Tn7,在大腸桿菌 DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)位獲得重組桿狀質(zhì)粒；重組桿狀質(zhì)粒使用Cellfectin-II轉(zhuǎn)染Sf21 細(xì)胞產(chǎn)生感染性重組桿狀病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A ;
[0027] (5)重組桿狀病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A轉(zhuǎn)染SfHpH細(xì)胞，經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)后離 心收集上清，經(jīng)純化制得口蹄疫病毒樣顆粒，乳化，即得。
[0028] (5)重組桿狀病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A轉(zhuǎn)染SfHpH細(xì)胞，經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)后離 心收集上清，經(jīng)純化制得口蹄疫病毒樣顆粒，乳化，即得。
[0029] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)所述的改造的pGEMR_7Zf [-]質(zhì)粒為采用快速定點(diǎn) 試劑盒在質(zhì)粒pGEMR-7Zf(_)多克隆位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變形成NdeI、NheI、NotI、SpeI限制酶 切位點(diǎn)；步驟（2)所述的合成口蹄疫病毒衣殼前體蛋白P12A cDNA序列的引物序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2/所示，或者為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3所示；步驟（3)所述 的PCR方法中的引物序列為SEQ ID N0:1-SEQ ID NO:9所示。
[0030] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了所述的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗在制備預(yù)防或防治口蹄 疫藥物中的應(yīng)用。
[0031] 一、BHK-21細(xì)胞制備重組口蹄疫病毒樣顆粒
[0032] BHK-P12A細(xì)胞培養(yǎng)后不僅生產(chǎn)75S病毒樣顆粒、也產(chǎn)生5S的原體顆粒、12S的五 聚體，這些蛋白和滅活口蹄疫疫苗一樣，以相同劑量在小鼠模型上誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。P12A前體 蛋白免疫小鼠無特異性的抗體檢出，但形成病毒樣顆粒后免疫小鼠則產(chǎn)生抗體反應(yīng)，表明 口蹄疫病毒樣顆粒作為疫苗抗原使用的效果。P12A形成的病毒樣顆粒誘導(dǎo)抗體在加強(qiáng)免疫 后顯著提高，且保護(hù)率為100 %，不僅有抗體的作用，也有細(xì)胞免疫的作用。
[0033] BHK-P12A表達(dá)的病毒結(jié)構(gòu)能被口蹄疫疫苗免疫牛血清識(shí)別，進(jìn)一步揭示重組的病 毒樣顆粒模擬了口蹄疫"真病毒"。本發(fā)明的口蹄疫病毒樣顆粒疫苗是口蹄疫亞單位疫苗， 容易制備、容易純化，具有常規(guī)滅活全病毒疫苗的安全和效果。
[0034] BHK-P12A細(xì)胞穩(wěn)定高效表達(dá)生產(chǎn)口蹄疫病毒樣顆粒是通過除去口蹄疫病毒蛋白 酶3C的毒性，引入了自主組裝標(biāo)簽（VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，從而使宿主細(xì)胞穩(wěn)定 并不受到破壞。P12A產(chǎn)物高效表達(dá)且自我組裝成75S病毒樣顆粒。
[0035] 因?yàn)闆]有蛋白酶3C的表達(dá)而沒有對宿主細(xì)胞蛋白損害?？谔阋卟《酒渌鞍讍?一表達(dá)，表達(dá)水平遠(yuǎn)低BHK-P12A表達(dá)。BHK-P12A中表達(dá)的VPO、VP3、VPl至少含一個(gè)口蹄 疫構(gòu)象表位，理論上應(yīng)能被單抗識(shí)別，但轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物不能被口蹄疫構(gòu)象表位單抗識(shí)別， 這種組裝的差異可能在P12A表達(dá)盒表達(dá)前體蛋白時(shí)，結(jié)構(gòu)蛋白濃度和組裝要求濃度適宜 是否正確方式組裝病毒顆粒有關(guān)。因此，P12A表達(dá)盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞使重組口蹄疫病毒 顆粒的質(zhì)量和數(shù)量有明顯提高。BHK-P12A無血清全懸浮培養(yǎng)是大量生產(chǎn)口蹄疫病毒樣顆粒 的關(guān)鍵因素，一是有活性的細(xì)胞密度增大，二是無血清培養(yǎng)基減少了后續(xù)步驟和純化。
[0036] 重組病毒樣顆粒口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝和滅活純化全病毒口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工 藝相似，滅活后乳化配制成疫苗，前期工藝步驟不需懸浮細(xì)胞培養(yǎng)具有傳染性的病毒工藝 步驟，排除了高水平生物安全等級設(shè)施需求。
[0037] 二、昆蟲細(xì)胞系和重組桿狀病毒制備重組口蹄疫病毒樣顆粒
[0038] 在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施例中，重組口蹄疫病毒樣顆粒通過以下方法制備得到：
[0039] (1)合成口蹄疫病毒病毒全長傳染性cDNA基因，基因合成后，克隆到改造的 pGEMR-7Zf [-]質(zhì)粒，制成重組質(zhì)粒 pGEM-FLOSFS ;
[0040] (2)以重組質(zhì)粒pGEM-FLOSFS為模板，合成口蹄疫病毒衣殼前體蛋白P12A cDNA序 列，插入質(zhì)粒PGEM-3Z，制成重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-Pl-2A ;
[0041 ] ((3)以重組質(zhì)粒pGEM-3Z-0-Pl-2A為模板，采用PCR方法進(jìn)行口蹄疫病 毒衣殼前體蛋白P12A的結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因 Glu83 - Lys，Serl34 - Cys，P12A連 接處Lys210 - Glu的突變，突變后產(chǎn)物連接到pGEM-3Z克隆質(zhì)粒上，制成重組質(zhì)粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A (VP1K210E、VP1E83K、VP1C134S)，重組質(zhì)粒在在大腸桿菌 DH5 α 擴(kuò)增，純 化，測序確認(rèn)；
[0042] (4)重組質(zhì)粒 pGEM-3Z-0-mPl-2A(VPlK210E、VP1E83K、VP1C134S)用 Nhe I 和 Not I酶切，酶切產(chǎn)物亞克隆至克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中，制成重組質(zhì)粒 pFast-Bac-FMDV0mP12A，重組桿狀病毒DNA制備是使用Bac-to-Bac系統(tǒng)Tn7,在大腸桿菌 DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)位獲得重組桿狀質(zhì)粒；重組桿狀質(zhì)粒使用Cellfectin-II轉(zhuǎn)染Sf21 細(xì)胞產(chǎn)生感染性重組桿狀病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A ;
[0043] (5) Sf21細(xì)胞對高pH培養(yǎng)的適應(yīng)和馴化
[0044] Sf21細(xì)胞慢速輕微離心后用pH 6. 0Sf-900II-BES-MISS培養(yǎng)基完全換液，每隔 2-5天用已經(jīng)調(diào)好Sf-90011-BES-MISS培養(yǎng)基換液，經(jīng)過2月連續(xù)從pH6. 0到7. 4,每次提 高0. 2pH單位，不斷提升Sf21細(xì)胞的pH壓力選擇，獲得了無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)pH7. 0-7. 4適 應(yīng)的穩(wěn)定的昆蟲細(xì)胞Sf21，命名為SfHpH，冷凍保存；
[0045] 其中，所述的Sf-90011-BES-MISS培養(yǎng)基含50mM N，N-雙（2-羥乙基）-2-氨基乙 磺酸（BES)、124mM鹿糖、5mM葡萄糖、50mM氯化鈉、20mM氯化鉀、3mM氯化|丐、IOmM硫酸鎂、 0· 1% w/v 嵌段式聚釀 F-68 (Pluronic F-68);
[0046] (6)高pH條件下制備口蹄疫病毒樣顆粒
[0047] 采用Sf-900II無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)SfHpH細(xì)胞，使其密度達(dá)到3.6X106細(xì)胞/ ml時(shí)，按MOI = 0.1 pfu/細(xì)胞接種重組桿狀病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A，27°C培養(yǎng)24h后， SfHpH細(xì)胞200Xg離心除去Sf-900II無血清培養(yǎng)基，用Sf-900II-BES-MISS培養(yǎng)基徹底 換液，重懸于pH7. 4Sf-900II-BES-MISS培養(yǎng)液中制備口蹄疫病毒樣顆粒，培養(yǎng)72~96h ; Sf-900II-BES-MISS培養(yǎng)液的pH通過加入無菌的IN NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，使培養(yǎng)液的pH始 終維持在7. 0-7. 4 ;
[0048] (7) 口蹄疫病毒樣顆粒的純化
[0049] 離心感染感染重組桿狀病毒AcMNPV-FMDV 0mP12A的SfHpH細(xì)胞，收獲上清液，上 清中加入終止蛋白酶抑