一種快速、準確、重復(fù)性好的口蹄疫疫苗抗原146s測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對口蹄疫疫苗抗原146S進行定量分析，具體涉及用尺寸排阻高效液 相色譜柱和高效液相色譜系統(tǒng)及方法定量病毒液中口蹄疫抗原146S含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫病毒樣品中與刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞有關(guān)的主要是完整病毒 顆粒，其沉降系數(shù)為146S，被認為與口蹄疫疫苗的效率具有平行關(guān)系。因此146S的含量是 評價口蹄疫疫苗質(zhì)量的一個重要指標。146S穩(wěn)定性弱，例如在溫和加熱或pH低于6. 0的條 件下即會發(fā)生裂解，而裂解后的產(chǎn)物的免疫原性極低。因此對于口蹄疫疫苗的生產(chǎn)過程中 及疫苗成品的儲存過程中146S的定量都尤為重要，需要建立快速、準確的定量方法。
[0003] 目前已有報道的口蹄疫抗原定量技術(shù)主要有：（1)細胞半數(shù)感染量（TCID50)測 定；（2)補體結(jié)合試驗（CFT) ; (3)免疫擴散法；(4) ELISA定量法；（5)蔗糖密度梯度離心法； (6)凝膠過濾色譜法。方法（1)檢測的是病毒活力，而并不能準確反映免疫原性；方法（2) 由于容易受到前補體和抗補體因子的干擾，準確性和穩(wěn)定性差；方法（3)和（4)由于需要 針對不同的抗原獲取相應(yīng)抗體，成本高，周期長，且難以完全區(qū)分146S及146S的抗原降解 物；方法（5)是目前國際上經(jīng)典的檢測口蹄疫抗原的方法，但此方法儀器成本較高，檢測時 間長（每個樣品需要幾個小時），需要的樣品量較多（至少若干毫升），且離心前需要濃縮， 操作相對復(fù)雜，盡管該方法已經(jīng)進行了改進，可以自動配置蔗糖梯度和取樣分析檢測，但仍 難以滿足快速檢測的需要；方法（6)是2011年Spitteler等（Spitteler MA, Fernandez I,Schabes E, Krimer A, Regulier EG, Guinzburg M, et al. Vaccine. 2011 ；29:7182-7187) 首次建立的用凝膠過濾色譜法在口蹄疫疫苗純化過程中進行146S定量。
[0004] 凝膠過濾色譜法是根據(jù)樣品的尺寸大小進行分離，同時檢測吸收峰，根據(jù)吸收 峰的峰面積進行計算定量。該種方法相對于蔗糖密度梯度離心法更易標準化，可準確進 行146S的體外定量和批次間檢測，與蔗糖密度離心法具有良好的結(jié)果一致性。文獻中 Spitteler等采用的是S印hacryl S-400凝膠過濾色譜填料及AKTA色譜純化系統(tǒng)。這種 方法為了達到高的柱效以實現(xiàn)分離目的，需要較長的色譜柱，從而分析時間較長，填料的成 本較高，且所需樣品量依然較多。專利CN 102998378 B公開了一種利用液相色譜系統(tǒng)定量 口蹄疫抗原中146S含量的方法，但是該方法由于僅僅是利用了液相色譜系統(tǒng)的檢測系統(tǒng)， 因此只能對純化后的146S進行檢測，無法檢測含有雜質(zhì)的抗原。
[0005] 本發(fā)明的方法是利用高效液相色譜系統(tǒng)及尺寸排阻高效液相色譜柱定量分析口 蹄疫抗原146S。尺寸排阻高效液相色譜柱由于其填料的尺寸小，耐壓強，能在短的色譜柱高 度下達到高的理論塔板數(shù)，實現(xiàn)樣品的分離和檢測，從而相比Spitteler等的方法極大的 減短了檢測時間和樣品體積，與專利CN 102998378 B相比，可以對未經(jīng)純化的抗原進行檢 測。使用精度和準確性高的高效液相色譜系統(tǒng)，在微量進樣條件下仍能準確控制樣品體積， 從而保證了結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。本方法可用于監(jiān)測多種口蹄疫疫苗在生產(chǎn)和儲存過程 中的抗原含量，間接評價疫苗效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、準確、低樣品量的測定各種口蹄疫 抗原146S的方法。
[0007] 基于以上目的，本發(fā)明提供了一種用尺寸排阻高效液相色譜法定量口蹄疫146S 抗原的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將尺寸排阻高效液相色譜柱連接在高效液相色譜儀上，以PH大于7的緩沖溶 液作為流動相，打開高效液相色譜儀的泵送系統(tǒng)和紫外檢測系統(tǒng)，對尺寸排阻高效液相色 譜柱進行沖洗和恒溫，注意排出系統(tǒng)內(nèi)任何殘留的氣泡。
[0009] (2)標準曲線的繪制：將146S純品用緩沖溶液配置成不同濃度的標準溶液樣品， 其樣品數(shù)量應(yīng)該大于3個，濃度范圍為0. 2-60 μ g/ml。取標準溶液樣品進樣量100 μ 1，按 照高效液相色譜儀的操作對尺寸排阻高效液相色譜柱進樣分析，洗脫液采用0.1 M硫酸鈉 的磷酸緩沖液（ΡΗ7. 0-7. 5)，流速：0. 5-1.0ml/min ;色譜柱流出液在紫外波長下進行檢測。 對抗原的吸收峰進行積分得到峰面積，與標準品中146S的濃度建立線性回歸方程。
[0010] (3)待測樣品的測定：將待測樣品通過系統(tǒng)向尺寸排阻高效液相色譜柱進樣，采 用與（2)同樣的洗脫液和紫外波長檢測，對抗原的吸收峰進行積分得到峰面積，根據(jù)（2)中 建立的146S濃度與峰面積的線性回歸方程，算得待測樣品中146S的濃度。
[0011] 樣品測試時，對未經(jīng)純化的口蹄疫疫苗中間品樣品，步驟⑶中的樣品檢測前需 進行核酸酶處理：取100-200 μ 1，加入終濃度為10U/ml DNase和2. 5U/ml RNase，37°C反應(yīng) 0. 5-lh后再進行尺寸排阻高效液相色譜法檢測。對已加入佐劑的疫苗成品，需進行破乳預(yù) 處理，破乳條件為：按照疫苗原液體積1/9加入正丁醇，混勻后在4°C下靜置Ih后，5000rpm 離心2min，收集含抗原的底層溶液進行檢測。
[0012] 此項檢測技術(shù)具有以下優(yōu)勢：
[0013] 檢測速度快，傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心方法每個樣品需要3-5小時，加上濃縮抗 原的時間，最多需要2天。文獻報道的凝膠過濾色譜法每個樣品的檢測需要2h而本方法建 立標準曲線后，每個樣品的檢測時間可減少到30min。
[0014] 高靈敏度，低樣品體積。該方法可以檢測至24ng的146S，樣品體積僅需 10-100 μ 1，樣品不需要提前濃縮，而傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心及制備級凝膠過濾色譜法需 要的樣品在毫升級，且濃縮過程中可能導(dǎo)致抗原損失。
[0015] 重復(fù)性好，批次內(nèi)誤差小。由于高效液相色譜系統(tǒng)實現(xiàn)全自動分析，從上樣到檢測 都由儀器自動化控制，相對密度梯度離心的人工操作誤差小，檢測結(jié)果更準確。
[0016] 具有廣泛的實用性，可用于不同血清型或亞型的病毒抗原的檢測。
[0017] 因此，本發(fā)明解決了當(dāng)前口蹄疫病毒抗原檢測操作復(fù)雜，檢測時間長，重復(fù)性差的 問題。對于提升我國口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程中及疫苗成品的質(zhì)量控制具有重要意義。
【附圖說明】
[0018] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明。
[0019] 圖1為實施例（1)中蔗糖密度梯度離心法收集的146S抗原的SDS-PAGE檢測結(jié)果 (A)和 western blot 檢測（B) ο
[0020] 圖2為實施例（I)中蔗糖密度梯度離心法收集的146S抗原的透射電子顯微鏡檢 測圖片。
[0021] 圖3為實施例（2)中蔗糖密度梯度離心收集的純146S標準品的尺寸排阻高效液 相色譜法檢測圖譜。
[0022] 圖4為實施例（2)中不同稀釋濃度下的純146S抗原的吸收峰面積與濃度的線性 關(guān)系；
[0023] 如圖所示，該曲線的R2達到0. 9991，線性結(jié)果良好。
[0024] 圖5為實施例（3)尺寸排阻高效液相色譜法檢測不同血清型的口蹄疫146S抗原 的檢測圖譜。
[0025] 圖6為實施例（4)中用核酸酶處理不同時間后檢測未經(jīng)純化的疫苗中間品的檢測 圖譜。
[0026] 圖7為實施例（5)中56°C加熱不同時間后疫苗的尺寸排阻高效液相色譜圖。
[0027] 圖8為實施例（5)中不同溫度下口蹄疫疫苗中146S抗原含量隨加熱時間的變化。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例來進一步說明本發(fā)明。這些實施例僅是范例性的，并不對本 發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明 方案的細節(jié)和形式進行修改，在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下的所有其它實施例，都屬于本 發(fā)明保護的范圍。
[0029] 實施例1 口蹄疫抗原146S標準品的制備
[0030] 1.材料
[0031] (1)檢測樣品：0型口蹄疫滅活病毒液來自于蘭州獸醫(yī)研宄所
[0032] (2)儀器和試劑：超速離心機為Sorvall WX Ultra，轉(zhuǎn)子為Su