專利名稱：：亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法；具體涉及一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
：口蹄疫(footandmouthdisease,簡稱FMD)是一種發(fā)生于偶蹄動物的急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，在世界范圍內(nèi)分布很廣，屬于國際間相互傳播的全球性流行性傳染病?？谔阋呤怯煽谔阋卟《疽鸬?，該病毒屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，呈球形，直徑為30nm,無嚢膜?？谔阋卟《窘Y(jié)構(gòu)簡單，由單鏈核4唐核酸和蛋白質(zhì)組成，其在病畜水皰皮內(nèi)以及淋巴液中含量最多，致病力強(qiáng)。口蹄疫病毒共有7種血清型(0、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaI),每種血清型又分成多個亞型，不同亞型之間沒有交叉免疫性。近年來，亞洲一型口^帝疫病毒(FMDV)在東南亞和印度半島呈地方性流行，并且以這兩個地區(qū)為中心向中東及東南亞周邊地區(qū)擴(kuò)散。目前對于該疾病的預(yù)防，大多數(shù)發(fā)展中國家釆用病毒滅活疫苗進(jìn)行免疫。在國際上，絕大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)口蹄疫疫苗時采取細(xì)胞懸浮或細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶的培養(yǎng)方式，并通過二乙烯亞胺(BEI)將病毒滅活，采用氫氧化鋁膠作為吸附劑、礦物油作為乳化佐劑來配制疫苗。雖然口蹄疫滅活疫苗具有較強(qiáng)的免疫效力，但由于其生物安全性差、產(chǎn)品的穩(wěn)定性欠佳、容易產(chǎn)生過敏副反應(yīng)等諸多不利因素，并且國際獸醫(yī)局(OIE)特別規(guī)定無口蹄疫的國家或地區(qū)禁用滅活疫苗，所以開發(fā)新型口蹄疫疫苗的研究就被提上了日程。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對口蹄疫病毒本身以及病毒與動物的免疫應(yīng)答機(jī)制的研究越來越深入，為研制基因工程疫苗、化學(xué)合成肽疫苗等分子水平疫苗提供了技術(shù)保障。研究發(fā)現(xiàn)FMDV是由一條RNA核酸鏈和衣殼蛋白組成的，基因組RNA全長約8.5kb,可以直接作為信使認(rèn)A。FMDV基因組RNA由5'UTR、3'UTR和OFR組成。5'UTR長約1300nt，含有VPg、二級結(jié)構(gòu)、P10基因、Poly(c)區(qū)段和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點等(IRES)。3'UTR由Poly(A)尾和大ORF3'末端與Poly(A)區(qū)段5，末端之間92個nt殘基組成，長172nt。大ORF由L基因(P20a)、Pl結(jié)構(gòu)蛋白基因、P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，并以L、Pl、P2和P3的順序依次排列，長約6.5Kb，其中基因組的3D區(qū)段是編碼FMDV的RNA聚合酶的，是病毒復(fù)制中不可缺少的成分，被稱為病毒感染相關(guān)抗原，它與非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B、3C等常用來檢測動物是否接觸、感染過活的FMDV(龍永進(jìn)等，2003)。Pl結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4(LoganD,Abu-GhazalehR,BlakemoreW等，1993),它們各60個組成了FMDV的外殼蛋白；VP1~VP3組成衣殼蛋白亞單位，1個蛋白亞單位構(gòu)成病毒粒子20面體的一個面，VP4位于病毒顆粒的內(nèi)部。衣殼蛋白VP1~VP4基因均參與抗原位點的形成。Bachrach等于1975年從口蹄疫病毒中分離出衣殼蛋白VP1，配以弗氏不完全佐劑制成一種蛋白亞單位疫苗，具有一定的免疫效果，為研制基因工程疫苗提供了依據(jù)。自此，許多科研工作者也將研究目標(biāo)集中到對VP1蛋白的研究上。20世紀(jì)80年代后，國外許多學(xué)者將DNA重組技術(shù)和FMDV分子生物學(xué)的研究成果相結(jié)合，用埃希氏大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、痘病毒、哺乳動物細(xì)胞甚至植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)口蹄疫病毒的部分結(jié)構(gòu)蛋白或全部結(jié)構(gòu)蛋白，研制基因工程疫苗。我國也對口蹄疫基因工程疫苗進(jìn)行了深入的研究，并取得了階段性的成果。2000年，楊志軍等用大腸桿菌制備了表達(dá)含T細(xì)胞和B細(xì)胞表位抗O型FMDV的VP1的基因工程疫苗。試驗表明，該疫苗能誘導(dǎo)豚鼠和豬產(chǎn)生中和抗體，具有一定的免疫效果。但是由于基因表達(dá)產(chǎn)物的量很有限，并且無法獲得抗原的立體結(jié)構(gòu)，因此難以提高免疫效力。2003年，鄭兆鑫等將VP1和VP4上的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的基因串連起來研制出了針對Asia1型口蹄疫的基因工程疫苗，但是試驗結(jié)果表明在強(qiáng)毒攻擊下并不能達(dá)到100%的保護(hù)，同時作為疫苗，基因工程疫苗后期處理過于復(fù)雜，成本高，效價低。目前為止，國際上還沒有一種商業(yè)化生產(chǎn)的基因工程多肽疫苗?；瘜W(xué)合成多肽疫苗(syntheticp印tidevaccine)就是采用化學(xué)合成抗原多肽疫苗。這種疫苗不含核酸，是最為理想的安全性疫苗，也是目前研制預(yù)防和控制感染性疾病的疫苗的主要方向之一。研制口蹄疫合成肽疫苗的關(guān)鍵之處是在病毒粒子的衣殼蛋白上找到最主要的抗原決定蔟，理想的合成肽的疫苗一^:應(yīng)包括抗原的B細(xì)胞位點和輔助T細(xì)胞位點。目前，抗豬O型口蹄疫病毒的合成肽疫苗已成功研制，但國際上尚無抗亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗，而亞洲一型口蹄疫病毒正是我國主要流行的口蹄疫病毒之一，因此研制一種效力好、安全性高、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、成本低的抗亞洲一型口蹄疫病毒的合成肽疫苗已成為一項緊迫而重要的任務(wù)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種具有優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的效力，且安全性好、生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、成本低的基于合成肽的抗亞洲一型口^帝疫病毒疫苗。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備上述抗亞洲一型口蹄疫病毒疫苗的方法。實現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案如下一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。上述氨基酸序列中一個或者多個纈氨酸可以被正纈氨酸替代；和/或一個或者多個亮氨酸可以被正亮氨酸替代。優(yōu)選地，上述氨基酸序列中全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。上述氨基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基可以經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵。上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間可以反應(yīng)形成共價連接。具體來說，上述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應(yīng)形成共價連才妄。本發(fā)明還提供一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗，其中包括一種或多種上述多肽或其多肽聚合物，例如具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的多肽或其多肽聚合物。該疫苗還可以包含佐劑，例如白油，優(yōu)選為白油50V。本發(fā)明還提供了上述多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護(hù)反應(yīng)在體積百分比為15%-30%的六氫吡啶的N-曱基p比咯烷酮溶液中在20-28。C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除氨基樹脂或肽樹脂上的9-芴曱氧羰基(Fmoc)保護(hù)基團(tuán)，氮氣吹干，N-曱基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴曱氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個氨基酸與l-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-l-羥基苯丙三唑酯；(3)合成反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動加至反應(yīng)器中，在20-28。C條件下反應(yīng)0.5-2.5小時，氮氣吹干，N-曱基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙?；磻?yīng)使用重量體積百分比為1.5%-4%的乙酰咪唑的N-曱基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28。C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮氣吹干，曱醇洗滌樹脂；(5)合成過程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1)~(4),反應(yīng)完成后，用N-曱基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時后置于0。C下反應(yīng)IO分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基曱醚及二乙醚加入多肽溶液中，攪拌洗滌，過濾得多肽溶液；(7)環(huán)化反應(yīng)將多肽溶液在室溫下放置42-47小時，每小時攪拌一次；(8)超濾純化多肽及無菌處理使用膜包在20-28。C條件下超濾多肽，使用0.2微米在線濾器除菌保存。在上述制備方法中，所述裂解試劑的組分體積比具體為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二碌b醇苯酚水=85:8:3:3:1。此外，本發(fā)明還提供一種上述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將上述多肽或其多肽聚合物稀釋至50嗎/ml;(2)在20-28。C條件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液佐劑=1:l的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，90-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘；(3)緩慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。在上述制備方法中，所述高速攪拌為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明還提供了上述多肽或其多肽聚合物、疫苗在制備治療和/或預(yù)防亞洲一型口3帝疫的藥物中的用途。本發(fā)明通過對國內(nèi)口蹄疫流行毒抹的序列測定，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況。針對主要變異的氨基酸位點，統(tǒng)計其變異的頻率，同時7結(jié)合計算才幾輔助方法進(jìn)^f于口^帝疫抗原位點的分析預(yù)測，對可能的抗原位點肽段進(jìn)行化學(xué)合成，即根據(jù)統(tǒng)計的變異頻率，在易變異位點上使用不同的氨基酸，得到涵蓋當(dāng)前所有可能變異位點的多種候選多肽抗原。進(jìn)而經(jīng)過大量的動物試驗對這些候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應(yīng)，而且免疫反應(yīng)水平高，可以很好地保護(hù)動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。本發(fā)明在此篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，對口^帝疫病毒抗原位點進(jìn)行了優(yōu)化組合，并有效組合了T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，制備了抗亞洲一型口3帝疫病毒合成肽疫苗。該疫苗可以有效應(yīng)對口^帝疫病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問題，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。具體實施方式實施例1:合成肽疫苗多肽抗原的固相合成本發(fā)明的多肽抗原可以通過ABI433A全自動多肽合成儀，利用Merrifield固相合成法制備，其中采用了Fmoc修飾的氨基酸，固相載體為RinkAmideMBHA樹脂。生產(chǎn)過程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。1、合成原料的準(zhǔn)備合成肽疫苗多肽抗原序列如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示。此外還包4舌如下的多肽具有將SEQIDNO:l序列中的亮氨酸和纈氨酸全部由正亮氨酸和正纈氨酸取代后的氨基酸序列的肽。具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的多肽的二聚體。依據(jù)上述多肽抗原序列以及l(fā)mmol的合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的Fmoc修飾的氨基酸，加入相應(yīng)的Cartridge(裝氨基酸的小瓶)中。同樣按要求稱量RinkAmideMBHA樹脂，放入反應(yīng)腔中，將上下蓋子檸緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成的肽的名稱，批號，反應(yīng)腔的皮重以及所稱取樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑包括N-曱基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌"定(PIP)、曱醇等并放置到對應(yīng)的試劑^f瓦中。2、合成儀狀態(tài)的4企測檢查433A多肽合成儀器是否正常運(yùn)行，開機(jī)后，運(yùn)行RunSelfTest程序，儀器自檢各項指標(biāo)是否正常。另外檢查N2是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進(jìn)行測定。433A合成儀發(fā)送FlowRatel-18到合成儀，選擇MainMenu—ModuleTest—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、Modulel、Modulel、ModuleA)—按Start—按more進(jìn)行測量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門壓力，直至達(dá)到要求。3、合成肽疫苗多肽抗原的制備(1)去保護(hù)反應(yīng)在體積百分比為20%的六氬吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中在22。C條件下反應(yīng)30分鐘，脫除氨基樹脂或肽樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)，氮氣吹千，NMP洗滌樹脂；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有Fmoc的各個氨基酸與l-羥基苯丙三唑(HOBT)反應(yīng)合成氨基酸-HOBT酯；(3)合成反應(yīng)啟動多肽合成儀自動合成程序，使用合成儀自動將上述氨基酸、樹脂和二異丙基碳二亞胺加至反應(yīng)器中，在22。C條件下反應(yīng)2小時，氮氣吹干，NMP洗滌樹脂；(4)乙?；磻?yīng)使用2.5%重量的乙酰咪唑與步驟(3)中獲得的樹脂在22。C條件下反應(yīng)30分鐘，氮氣吹干，曱醇洗滌樹脂；(5)合成過程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)(1)(4)步，反應(yīng)完成后，用NMP清洗，除去殘余的氨基酸，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離.'將干燥的多肽-樹脂放入玻璃容器內(nèi)，將配制好的裂解試劑(三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:l)加入容器內(nèi)，勻速攪拌3小時，將玻璃容器置于0。C下反應(yīng)10分鐘，取出恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸(TFA),將叔丁基曱醚及二乙醚加到多肽溶液中，攪拌洗滌，過濾分離出多肽溶液；(7)環(huán)化反應(yīng)將多肽溶液在室溫下放置45小時，每小時攪拌一次；(8)超濾純化多肽抗原后進(jìn)行無菌處理使用膜包在22。C條件下超濾多肽抗原，使用0.2微米在線濾器除菌保存。實施例2:合成肽疫苗的配制用注射用水將實施例1制備的五種多肽抗原溶液分別稀釋到50嗎/ml，作為水相；將SEPPICMONTANIDEISA50V油佐劑經(jīng)121°C,30分鐘滅菌，備用作為油相。在22。C條件下，按照抗原水相與滅菌的50V為1:1的體積比，先將油相加入乳化罐內(nèi)，100轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌2分鐘，緩慢加入水相，加完后攪拌30分鐘，再高速9000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌20分鐘，然后靜置5分鐘，分裝后即得抗亞洲一型口蹄疫病毒的合成肽疫苗，即SEQIDNO:l多肽疫苗，SEQIDNO:2多肽疫苗，SEQIDNO:3多肽疫苗，SEQIDNO:l取代多肽疫苗和SEQIDNO:l聚合多肽疫苗。實施例3:合成肽疫苗對豚鼠的免疫效果研究將300-500g健康豚鼠隨機(jī)分為七組，每組六只豚鼠，在后腿進(jìn)行肌肉注射，各組注射試劑及劑量見表1。第一次免疫后四周進(jìn)行第二次免疫，第二次免疫后第三周攻毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1、FMDV特異性抗體的檢測以間接ELISA法測定血清抗體的OD492值，在96孔酶標(biāo)板上以Asia1型FMDV江蘇毒為包被抗原(1:IO稀釋)，被檢豚鼠血清為一抗，過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豚鼠IgG為二抗，在波長492nm處測定每孔的ODi"直，以空白孔調(diào)零。每組隨機(jī)采血3只，以1:32稀釋豚鼠血清，取每組間接ELISA方法測定結(jié)果的平均值(見表2)。表2顯示，除G組外，各免疫組豚鼠的特異性抗體水平在第一次免疫后的第二周明顯提高，即抗亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗組的特異性抗體水平在第一次免疫豚鼠后的第二周明顯提高。同時，其特異性抗體水平高于滅活苗組。表2:間接ELISA檢測豚鼠血清FMDV特異性抗體結(jié)果(&SE)分組a組B組C組D組e組F組G組免疫前第一周第一第二周次免第三周疫第四周第第一周次第二周免疫第三周0.2215±0.0140.3353±0.0250.5127±0.0270.5542±0扁0.9982±0.0031.5021±0.1721.8139±0.1420.9715±0.1300.1795±0.0220.3257±0.0590.6171±0.0880.6749±0.1251.0123±0.0871.5984±0.0141.8267±0.0291.0918±0.1520.2012±0.0370.3525±0.0760.6285±0.0090.6914±0.1261.1127±0.0921.6072±0.0431.8963±0.0181.1021±0.0910.2256±0.0440.3427±0.0820.6438±0.1370.6844±0,214l細(xì)9±0.1491.6125±0.0031.9247±0.0261.1035±0.1470.2179±0.1050.3354±0.1410.6392±0.1290.6793±0.1831.1027±0.1681.6219±0.0721.9139±0,1011.0986±0.1590.2327±0.0090.3498±0.1040.6255±0.1730.6907±0.1181.1106±0.0871.6078±0.1841.9834±0.0031.1062±0.1060.2435±0.0560.2534±.0.1420.3379±.0.0010.2831±0.2130.2795±0.1610.3875±0.0740.2831±0.2510.2314±.0.1672、血清中和抗體的4全測分別選用免疫前(第0天)，第一次免疫后的四周(第28天)，第二次免疫后第三周(第49天)的豚鼠血清用于微量中和試驗，每組各測2只豚鼠。將生理鹽水稀釋的豚鼠血清滅活后，在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上用稀釋液作一系列倍比稀釋，每個稀釋度作4孔，每孔加入50pl病毒液(100TCID5q),37。C溫箱中和lh后每孔加入100^1細(xì)胞懸液，置于5%C02培養(yǎng)箱中37。C培養(yǎng)，自48h開始觀察，至144h終判。設(shè)置陽性和陰性血清對照、病毒回歸試驗、血清毒性試驗、正常細(xì)胞對照。按照Spearman-Karber方法，計算出能保護(hù)50%孔中的細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。結(jié)果如表3所示，除G組外，在第一次免疫后各試驗組均出現(xiàn)中和抗體，且B組、C組、D組、E組、F組的中和抗體滴度高于A組，即抗亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫后產(chǎn)生的中和抗體滴度高于滅活苗產(chǎn)生的中和抗體滴度。ii表3:免疫豚鼠的中和抗體水平豚鼠編號A組B組C組D組E組F組G組免疫前1<0.6<0.6<0.6<0,6<0.6<0.6<0.6(第o天)2<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6第一次免疫11.61.71.61.71.71.8<0.6(第28天)21.31.51.41.51.61.7<0.6第二次免疫12.02,22.22.12.22.3<0.6(第49天)21.71.91.81.91.82,0<0.63、豚鼠T淋巴細(xì)胞增殖試驗將無菌采集的"豕鼠"年臟細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成2x1(^個/ml置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入50jul細(xì)胞懸液和50filPHA溶液(濃度50pg/ml)，設(shè)置三個重復(fù)孔作為平行，另設(shè)對照孔。培養(yǎng)板置于37°C、50/oC02飽和濕度條件下培養(yǎng)45h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10^1,繼續(xù)培養(yǎng)3h并以10%SDS-0.01mol/lHC1溶液中止反應(yīng)，」降沉淀溶解后在波長570nm處測定每孔OD值，結(jié)果以三個孔的平均值表示。將第一次免疫后第四周(第28天)、第二次免疫后第三周(第49天)釆集的豚鼠脾臟淋巴細(xì)胞用于增殖試驗。結(jié)果顯示除G組外，各免疫組的脾臟T淋巴細(xì)胞均出現(xiàn)增殖反應(yīng)。4、合成肽疫苗力豕鼠攻毒試驗每組取4只豚鼠，連同陰性對照組(H組)豚鼠4只，在每只豚鼠左后腳掌皮下穿刺及皮內(nèi)接種0.2mlIOO倍半數(shù)感染量(ID50)的Asia1型FMDV江蘇毒，接種后1周內(nèi)觀察發(fā)病情況。病變的嚴(yán)重程度分別表示為"無，，，即兩只后腳掌均無病變(水泡)；"輕微"，即病變(水泡)僅發(fā)生于注射的單只后腳掌；"嚴(yán)重"，即兩只后腳掌均出現(xiàn)病變(水泡)。以病變出現(xiàn)的嚴(yán)重程度作為保護(hù)效果的判定完全保護(hù)為不出現(xiàn)任何病變(水泡)；部分保護(hù)為病變(水泡)僅發(fā)生于注射的單只腳。保護(hù)率(％)=完全保護(hù)的豚鼠數(shù)/每組豚鼠總數(shù)x100。表4:豚鼠抗病毒能力檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*一只豚鼠懷孕。結(jié)果顯示(表4),免疫組豚鼠的抗病毒攻擊能力遠(yuǎn)大于G組和H組，其中B組、C組、D組、E組、F組豚鼠在攻毒后均未發(fā)病，其保護(hù)率分別達(dá)到100%、75%、100%、100%和100%。這說明抗亞洲一型口^帝疫病毒合成肽疫苗對于豚鼠具有很好的保護(hù)效果。實施例4:合成肽疫苗的豚鼠和小鼠安全性試驗用體重350~450g的豚鼠60只，每批疫苗(按照上述實施例配制的抗亞洲一型口^帝疫病毒合成肽疫苗以及抗亞洲一型口^帝疫病毒滅活苗)注射IO只，每只皮下注射2ml;用體重18-22g的小鼠60只，每批疫苗(按照上述實施例配制的抗亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗以及抗亞洲一型口蹄疫病毒滅活苗)注射IO只，疫苗每只皮下注射0.5ml。連續(xù)觀察7曰，判定是否出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。觀察結(jié)果見表5。表5:疫苗對豚鼠與小鼠的安全性試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從本試驗結(jié)果可以看出，本發(fā)明的抗亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫豚鼠和小鼠后連續(xù)觀察7日，均沒有出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。在整個試驗過程中，豚鼠和小鼠均沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。這說明抗亞洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗對于豚鼠和小鼠是安全的。<110>中牧實業(yè)股份有限公司<120>亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗<130>DIC08110082<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>57<212>PRT<213>人工序列<楊>1LysLysSerlielieAsnAsnTyrTyrMetGinGinTyrGinAsnSer151015MetLysValTyrAsnGlyLysCysThrTyrGlyGluGluSerSerArg202530ArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgArgValSerAsnCysLeuPro354045ThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys5055<210>2<211>57<212>PRT<213>人工序列<400>2151015MetLysValTyrAsnGlyLysCysAlaTyrGlyGluValThrThrArg202530354045ThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys5055<210>3<211>57<212>PRT<213>人工序列<400>317LysLysSerlielieAsnAsnTyrTyrMetGinGin丁yrGinAsnSer151015MetLysValTyrAsnGlyLysCysAlaTyrGlyGluGluThrThrArg202530ArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgLysValSerAsnCysLeuPro354045ThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys505權(quán)利要求1.一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所示的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中一個或者多個纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或一個或者多個亮氨酸被正亮氨酸替代。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中全部纈氨酸被正纈氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基經(jīng)氧化連接在一起形成二硫鍵。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基之間反應(yīng)形成共價連接。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列的首尾氨基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與輕基之間反應(yīng)形成共價連接。7.—種亞洲一型口i帝疫合成肽疫苗，其中包括一種或多種權(quán)利要求1至6中任一項所述的多肽或其多肽聚合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述佐劑為白油，優(yōu)選為白油50V。10.—種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護(hù)反應(yīng)在體積百分比為15%-30%的六氫吡啶的N-曱基吡咯烷酮溶液中在20-28。C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除氨基樹脂上的9-芴曱氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮氣吹干，N-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴曱氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個氨基酸與l-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-l-羥基苯丙三唑酯；(3)合成反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹脂以及二異丙基碳二亞胺自動加至反應(yīng)器中，在20-28。C條件下反應(yīng)0.5-2.5小時，氮氣吹干，N-甲基吡咯烷酮洗滌樹脂；(4)乙酰化反應(yīng)z使用重量體積百分比為1.5%-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹脂在20-28。C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮氣吹干，曱醇洗滌樹脂；(5)合成過程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1)(4),反應(yīng)完成后，用N-曱基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹脂；(6)多肽與樹脂的分離向干燥的多肽樹脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時后置于0。C下反應(yīng)IO分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基曱醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過濾得多肽溶液；(7)環(huán)化反應(yīng)將多肽溶液在室溫下放置42-47小時，每小時攪拌一次；(8)超濾純化多肽及無菌處理使用膜包在20-28。C條件下超濾多肽，使用0.2微米在線濾器除菌保存。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3r1。12.—種根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項所述的疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將多肽或其多肽聚合物稀釋至50(ig/ml;(2)在20-28。C條件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液佐劑=1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，卯-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘；(3)緩慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述高速攪拌為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。14.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的多肽或其多肽聚合物、權(quán)利要求7至9中任一項所述的疫苗在制備治療和/或預(yù)防亞洲一型口蹄疫的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供一種亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗，具體涉及一種用于亞洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。上述多肽具有SEQIDNo1、SEQIDNo2或SEQIDNo3所示的氨基酸序列。本發(fā)明通過對國內(nèi)口蹄疫流行毒株的序列測定，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況，同時結(jié)合計算機(jī)輔助方法進(jìn)行口蹄疫抗原位點的分析預(yù)測，對可能的抗原位點肽段進(jìn)行化學(xué)合成，進(jìn)而經(jīng)過大量的動物試驗對候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到免疫反應(yīng)水平高，可以很好地保護(hù)動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。由其制成的疫苗可以有效應(yīng)對口蹄疫病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問題，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號C07K14/00GK101659696SQ200810118968公開日2010年3月3日申請日期2008年8月27日優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日發(fā)明者巴利民,李丙首,栗利芳,進(jìn)肖,郭麗清,鵬齊申請人:中牧實業(yè)股份有限公司