一種丙型肝炎病毒的dna疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制備方法，屬于分子生物學(xué)和感染免疫領(lǐng)域。本發(fā)明的DNA疫苗是HCV-E2的第2個N-糖基化位點產(chǎn)生突變，即N423RT突變?yōu)镈423RT。該突變體的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在E2基因兩端引入CpG序列，并將突變的片段構(gòu)建到真核表達載體上即得到能產(chǎn)生E2突變體的DNA疫苗。本發(fā)明方法簡便，成本低，制備的DNA疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生比野生型HCVE2更強的特異性細胞免疫和中和性抗體，特異性的殺傷性CD8+T活性增強，并能夠引起較強的IFN-γ、IL4釋放，有效地中和病毒進一步感染，克服了糖基化蛋白質(zhì)在表達上的困難。
【專利說明】一種丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和感染免疫領(lǐng)域，具體涉及一種丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒(h印atitis C Virus, HCV)感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，嚴(yán)重影響人類健康，我國是HCV高感染率國家之一，目前的治療手段有限，尚無有效的治療和預(yù)防性HCV疫苗。
[0003]HCV為單鏈正義RNA病毒，其基因表達產(chǎn)物為含3011個氨基酸的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶剪切后形成多種蛋白(核衣殼蛋白Core、包膜蛋白El和E2 ;離子通道蛋白P7 ;非結(jié)構(gòu)蛋白 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)(Pwalotsky JM, Gastroenterology, 2002，122(6):1554-1568)。E2蛋白對應(yīng)于多 聚蛋白鏈中的氨基酸序列是384?746氨基酸。HCV包膜糖蛋白為病毒外殼的主要成分，在感染中發(fā)揮著重要的作用:參與病毒蛋白粒子的裝配、與肝細胞表面受體結(jié)合相互作用介導(dǎo)病毒進入，并且，E2是誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原區(qū)，故HCV E2區(qū)及其編碼的抗原是HCV疫苗研究的重點(Fournillier, et al.J.Virol, 2001; 75:12088),此外，E1、E2含有T、B細胞表位，可以誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)，是保護性抗原。
[0004]E2是高度糖基化的蛋白，糖基化是蛋白翻譯后的重要修飾加工環(huán)節(jié)，可以誘導(dǎo)蛋白空間構(gòu)象正確折疊，增加蛋白的酶親水性，穩(wěn)定性，并且可以調(diào)節(jié)蛋白的抗原性。E2上含有11個N-糖基化位點，并且盡管不同基因型HCV中包膜蛋白E2的氨基酸序列具有可變性，這些糖基化位點卻是高度保守的(Goffard, A et al..J.Virol, 2005，79:8400-8409; Slater-Handshy et al, Virology, 2004, 319 (I): 36-48),這意味著這些糖基化修飾是HCV生活周期中起重要作用。對這些聚糖的功能分析表明:糖基化修飾在蛋白質(zhì)折疊、HCV進入中起關(guān)鍵作用，同時寡糖鏈可以保護病毒的包膜蛋白被宿主細胞的蛋白酶降解，還可以遮蔽病毒抗原，使機體不能有效識別病毒，保護病毒抵抗抗體中和作用，例如:E2上423和448(E2N2和E2N4)位糖基化位點突變明顯減少HCVpp (HCV假病毒)的感染性，417，532和645位的糖基化修飾(E2N1，E2N6和E2N11)能夠保護HCVpp以及HCVcc (HCV cell culture，細胞培養(yǎng)病毒)抵抗抗體的中和作用(Reviewed by Helle, viruses, 2011)。另一方面,通過除去病毒包膜蛋白的糖苷還可以改變蛋白的免疫原性，研究表明，El的209位糖基化位點突變后，可以誘導(dǎo)更強的細胞免疫反應(yīng)，305位突變可增強體液免疫，E2的576位突變可顯著增強特異性細胞免疫反應(yīng)。但是E2上與中和性抗體表位惜惜相關(guān)的糖基化修飾位點N1/N2/N4/N6/N11去除后能否在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HCV中和抗體(neu_IgG)仍不清楚，并且這些位點中N-聚糖刪除能否在體內(nèi)介導(dǎo)產(chǎn)生強的細胞免疫反應(yīng)國內(nèi)外均未見報道。
[0005]E2對HCV整個生命周期至關(guān)重要，然而至今仍無針對HCV E2的小分子藥物或者有效的廣泛性中和抗體，對HCV的治療手段非常有限。利用經(jīng)典的蛋白免疫獲得抗體的方法在實際應(yīng)用中困難重重，一方面要獲得真核表達的含完整糖基化修飾的E2蛋白(?70KD)產(chǎn)量極低且純化困難，而采用原核表達系統(tǒng)獲得的E2蛋白僅有?35KD，缺乏糖基化修飾，不能保持原有的構(gòu)型，以此作為抗原缺乏一些關(guān)鍵的抗原表位，另一方面，HCV E2蛋白的免疫保護性較低，需要進一步改造。利用DNA疫苗可以在基因水平方便的對抗原進行某些改造，并且制備方法簡單。DNA疫苗已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于乙型肝炎病毒，狂犬病毒和人類獲得免疫缺陷病毒的預(yù)防和治療中。它的基本原理是將編碼抗原的基因片段直接通過肌肉注射或基因槍等方法直接導(dǎo)入宿主體內(nèi)，DNA轉(zhuǎn)入體內(nèi)后即可表達相應(yīng)的蛋白抗原，其中，內(nèi)生(源)性蛋白抗原經(jīng)MHC I類途徑呈遞，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞毒性淋巴反應(yīng)(CTL)效應(yīng)性⑶8+T細胞，而可溶性抗原蛋白釋放到細胞外后，被專職抗原遞呈細胞(APC)攝取，然后經(jīng)MHC II類途徑呈遞，活化CD4+T細胞，及其隨后產(chǎn)生抗體的B細胞活化，因此DNA免疫可全面誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)。在制備DNA疫苗時還可引入菌源性的非甲基化CpG DNA作為佐劑，它是指以CpG為核心的寡核苷酸序列，主要是通過與TLR9識別發(fā)揮免疫促進作用，具有增強巨噬細胞，DC細胞以及B細胞的功能，激活小鼠免疫細胞的最佳CpG序列為GACGTT，激活人免疫細胞的最佳 CpG 序列為 GTCGTT (reviewed by M.Krieg)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種具有更強免疫保護性的HCV包膜糖蛋白E2突變體以及編碼該突變體的基因。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供產(chǎn)生上述突變體的DNA疫苗。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供上述DNA疫苗的制備方法。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]一種HCV包膜糖蛋白E2突變體，其第2個N-糖基化位點發(fā)生突變，即N423RT突變?yōu)镈423RT，使N糖基化修飾不能進行，所述的突變?yōu)閷⑻於０吠蛔優(yōu)樘於彼幔凰龅腍CV包膜糖蛋白E2突變體的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011 ] 編碼上述HCV包膜糖蛋白E2突變體的基因，E2基因序列的N-糖基化位點的核苷酸發(fā)生了突變，突變?yōu)槟芫幋a天冬氨酸的核苷酸。
[0012]優(yōu)選的，編碼如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的HCV包膜糖蛋白E2突變體的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]上述基因的N端還引入了菌源性非甲基化CpG序列，較佳的CpG序列為GACGTT。
[0014]一種產(chǎn)生上述突變體的DNA疫苗，包含真核表達載體和上述基因；所述的真核表達載體優(yōu)選為P⑶NA3.1。
[0015]上述DNA疫苗的制備方法，包括如下步驟:在HCV E2基因兩端引入CpG序列以及酶切位點，將該片段構(gòu)建到載體上，再用定點突變PCR方法將E2上相應(yīng)的N-糖基化位點突變，將突變的片段構(gòu)建到真核表達載體上即得到所述DNA疫苗。
[0016]優(yōu)選的，使用引物CpG-sE2-F和sE2_R擴增E2基因，在E2基因兩端引入CpG序列及酶切位點BamH 1、Hind III ;使用引物CpG_sE2-f、E2N2_Ur擴增含點突變序列的上游片段，用引物E2N2-Df、sE2-R擴增含點突變序列的下游片段，再使用CpG-sE2_F和sE2_R以上游片段和下游片段為模板擴增得到E2第2個N-糖基化位點突變?yōu)樘於彼岬钠危瑢⒃撈螛?gòu)建到P⑶NA3.1上，得到產(chǎn)生如SEQ ID N0.1所示序列的E2突變體的DNA疫苗；其中，所述引物序列如下:
[0017]CpG-sE2-f: CGGGATCCGACGTTATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG,[0018]sE2-r:GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC,
[0019]E2N2-Df: TTGGCACATCgATCGCACGGCCTTGAAC,
[0020]E2N2-Ur:GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA。
[0021]本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果:本發(fā)明的HCV包膜糖蛋白E2突變體可誘導(dǎo)產(chǎn)生比野生型HCV E2更強的特異性細胞免疫(CTL)和中和性抗體(neutralizing antibody, NAb),特異性的殺傷性CD8+T活性增強，并能夠引起較強的IFN- Y、IL4釋放，因而可以有效地清除病毒，在體外能有效地中和病毒感染。本發(fā)明方法簡便，成本低，制備的DNA疫苗以真核表達質(zhì)粒DNA為免疫原，直接偶聯(lián)CpG佐劑聯(lián)合免疫，克服了糖基化蛋白質(zhì)在原核和真核表達上的困難，有效地中和病毒進一步感染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是免疫后小鼠血清中E2特異性抗體的滴度結(jié)果圖。
[0023]圖2是免疫印跡檢測免疫后小鼠血清中和抑制HCV的NS3的表達結(jié)果圖。
[0024]圖3是乳酸脫氫酶釋放實驗檢測小鼠細胞毒性T細胞特異性殺傷活性的結(jié)果圖，橫坐標(biāo)表示效靶細胞的比例。
[0025]圖4是酶聯(lián)免疫斑點法檢測免疫后小鼠脾臟中淋巴細胞免疫水平結(jié)果圖；其中，A:淋巴細胞釋放IFN- Y的水平，B:淋巴細胞釋放IL4的水平。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0027]實施例1
[0028]構(gòu)建分泌型糖基化單點缺失突變的E2突變體的真核重組質(zhì)粒
[0029]利用PCR從Ia型HCV基因組序列(基因序列號為GenBank Acc.N0.AY958062)中擴增出可表達分泌型E2蛋白(Secreted E2, sE2)的E2的基因序列，同時在該序列N端起始密碼子(ATG)上游引入菌源性非甲基化CpG序列(GACGTT)，進一步將該片段構(gòu)建到真核表達載體pcDNA3.1㈠(Invitrogen)上。再通過PCR定點突變方法將sE2上第2個N-糖基化位點(N423RT)的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?D423RT)，獲得重組質(zhì)粒分別命名為平N2。
[0030]本實施例中所用到的引物如下表所示:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種HCV包膜糖蛋白E2突變體，其特征在于:包膜糖蛋白E2的第2個N-糖基化位點發(fā)生突變，即N423RT突變?yōu)镈423RT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HCV包膜糖蛋白E2突變體，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述的HCV包膜糖蛋白E2突變體的基因，其特征在于:E2基因序列的N-糖基化位點的核苷酸發(fā)生了突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述基因的N端引入了菌源性非甲基化CpG序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于:所述的CpG序列為GACGTT。
7.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1或2所述的的DNA疫苗,其特征在于:包含真核表達載體和權(quán)利要求3-6任一項所述的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于:所述的真核表達載體為PCDNA3.1。
9.權(quán)利要求7或8所述的DNA疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟:在HCVE2基因兩端引入CpG序列以及酶切位點，將該片段構(gòu)建到載體上，再用定點突變PCR方法將E2上相應(yīng)的N-糖基化位點的突變，將突變的片段構(gòu)建到真核表達載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于:使用引物CpG-SE2-F和sE2_R擴增E2基因；使用引物CpG-sE2-f、E2N2-Ur擴增含點突變序列的上游片段，用引物E2N2_Df、sE2-R擴增含點突變 序列的下游片段；再使用CpG-sE2-F和sE2_R以上游片段和下游片段為模板擴增得到E2第2個N-糖基化位點突變的片段，將該片段構(gòu)建到PCDNA3.1上，得到產(chǎn)生如SEQ ID N0.1所示序列的E2突變體的DNA疫苗；其中，所述引物序列如下:
CpG-sE2-f:CGGGATCCGACGTTATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG,
sE2-r:GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC,
E2N2-Df:TTGGCACATCgATCGCACGGCCTTGAAC,
E2N2-Ur:GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA。
【文檔編號】C12N15/51GK103435690SQ201310417993
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】章曉聯(lián), 閔遠琴 申請人:武漢大學(xué)