專(zhuān)利名稱(chēng)：口蹄疫疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物疫苗的制備方法，特別是口蹄疫疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫作為國(guó)際獸醫(yī)局規(guī)定的A類(lèi)動(dòng)物流行病，口蹄疫疫苗的研究一直受到國(guó)內(nèi)外的研究人員關(guān)注。國(guó)外目前采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞和病毒，其優(yōu)點(diǎn)在于自動(dòng)化程度高、質(zhì)量穩(wěn)定性較高。其缺點(diǎn)在于這種培養(yǎng)病毒的方式病毒含量低，必須經(jīng)過(guò)超濾濃縮才能用于疫苗生產(chǎn)，這極大地限制了疫苗的產(chǎn)量。這種生產(chǎn)僅適用于疫苗儲(chǔ)備和小量免疫需要，不適合我國(guó)對(duì)口蹄疫免疫的大量需要，并且生產(chǎn)設(shè)備和工藝成本很高，其產(chǎn)品價(jià)格使我國(guó)政府和用戶(hù)都難以接受。國(guó)內(nèi)某研究所在本領(lǐng)域探索了多年，并在前進(jìn)口了相應(yīng)的設(shè)備，至今不得不棄用，而仍使用目前的傳統(tǒng)方法生產(chǎn)口蹄疫疫苗。
國(guó)內(nèi)目前普遍采用傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)病毒，其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)須國(guó)外的超濾濃縮工藝，其培養(yǎng)的病毒含量就可以達(dá)到制備單價(jià)疫苗的要求，適合國(guó)內(nèi)的超大規(guī)模生產(chǎn)的要求。申請(qǐng)人發(fā)明的93114885.5發(fā)明專(zhuān)利“口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝”，通過(guò)濃縮培養(yǎng)病毒使單價(jià)疫苗的效力大幅提高，目前在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用(國(guó)家科技發(fā)明二等獎(jiǎng))。其缺點(diǎn)是其僅適合做單價(jià)疫苗，做多價(jià)疫苗則仍需進(jìn)一步濃縮病毒，否則只有提高使用劑量，這將加大疫苗的副反應(yīng)和增加使用難度。如進(jìn)一步濃縮培養(yǎng)來(lái)濃縮病毒則會(huì)遇到培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足和細(xì)胞新陳代謝造成酸度增加，從而使合成出來(lái)的病毒大量降解，這不但沒(méi)有達(dá)到濃縮的目的，反而使有效病毒含量越來(lái)越少。因此解決營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題和酸度問(wèn)題是超濃縮培養(yǎng)的關(guān)鍵。同時(shí)國(guó)內(nèi)目前使用的佐劑劑型是雙相油佐劑，它便于吸收，免疫應(yīng)答較快，但免疫效力并不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種免疫力高，成本低廉的口蹄疫疫苗制備方法。
本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明所提供的口蹄疫疫苗制備方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝，其中傳統(tǒng)技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)速10-12轉(zhuǎn)/小時(shí)，單層細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后接入病毒和病毒培養(yǎng)液。其中以體積計(jì)種毒按病毒培養(yǎng)液的1～5％加入，病毒培養(yǎng)液主要包括水解乳蛋白溶液85～90％，抗生素0.5～2％，氨基酸溶液5～10％，3％谷氨酰胺溶液1％，加HEPES0.5～0.8％，加堿溶液調(diào)pH至7.5±0.1；水解乳蛋白溶液用緩沖液配置，含有水解乳蛋白0.4～0.5％，病毒培養(yǎng)液還包括犢牛血清1～2％。加入NaOH和或加NaHCO3，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉(zhuǎn)瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為200-400ml/15立升瓶，提高轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速至16±1轉(zhuǎn)/小時(shí)，避免細(xì)胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)細(xì)胞致病作用(Cytopathogenic effect，CPE)后，收獲病毒液，置-20℃保存。測(cè)定病毒效價(jià)，乳鼠測(cè)定LD50＞107.5LD50/0.2ml，細(xì)胞測(cè)定TCID50＞108.5TCID50/0.2ml，采用振動(dòng)膜除細(xì)胞碎片機(jī)除去細(xì)胞碎片，BEI滅活病毒；將按上述方法培養(yǎng)的各型(O、A、AsiaI)合格病毒液(達(dá)到上述測(cè)定標(biāo)準(zhǔn))混合制備疫苗抗原。
其中各型病毒液混合制備疫苗時(shí)，二價(jià)苗的比例為1∶1～3，三價(jià)苗的比例為1∶1～3∶1～3。其中病毒液pH值為7.5±0.1。
其中疫苗配制雙相佐劑采用法國(guó)SEPPIC的ISA206佐劑，佐劑與混合抗原(O、AsiaI或O、A、AsiaI)比例為1∶1。疫苗配制單相佐劑采用礦物白油與司本80混合制成的單項(xiàng)佐劑或者法國(guó)SEPPIC的50V，與混合抗原的配比為1∶1。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所提供的口蹄疫疫苗制備方法不限制使用的病毒株，不同的毒株通過(guò)調(diào)整配比都可以達(dá)到預(yù)期效果。而目前的現(xiàn)有技術(shù)都嚴(yán)格限制使用的毒株。因?yàn)槎局甑拿庖咴圆煌?，?duì)免疫原性不好的毒株唯一可以改變其免疫效力的辦法就是增加抗原含量。由于本方法有效地增加了病毒濃度，因此可以通過(guò)調(diào)整配比解決有些毒株免疫原性不好的問(wèn)題；本發(fā)明所提供的口蹄疫制備方法中病毒及其培養(yǎng)液的接入量為200-400ml/瓶(15000ml容積細(xì)胞瓶)，比93114885.5發(fā)明專(zhuān)利接入量(500ml/瓶)更少。培養(yǎng)液成份中采用更強(qiáng)的緩沖劑HEPES。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)液很少的情況下普通培養(yǎng)液中的緩沖體系不能抵抗細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的酸性而使pH迅速下降，pH的下降將會(huì)迅速裂解口蹄疫病毒，而HEPES是很強(qiáng)的緩沖劑，可以解決這一問(wèn)題；現(xiàn)有技術(shù)不使用氨基酸溶液和犢牛血清，但在培養(yǎng)液很少的情況下?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足以供給病毒合成之用，因此必須補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)才能保證病毒合成的數(shù)量。通過(guò)以上改變，可使病毒合成數(shù)量較現(xiàn)有方法(93114885.5發(fā)明專(zhuān)利)明顯提高。發(fā)明人做口蹄疫病毒蛋白電泳分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明所提供的口蹄疫疫苗制備方法培養(yǎng)的病毒，其電泳帶較原方法有明顯增粗，這說(shuō)明了病毒數(shù)量有明顯增加。而傳統(tǒng)的生物學(xué)方法對(duì)病毒的測(cè)定是10倍梯度稀釋?zhuān)又锉旧淼拿舾胁町?，使得難以穩(wěn)定測(cè)定出病毒數(shù)量的增加。
本發(fā)明所提供的口蹄疫制備方法制備的單相佐劑較雙相佐劑有點(diǎn)粘稠，但免疫效力可成倍增加，在口蹄疫O型上的試驗(yàn)表明，雙相佐劑測(cè)定免疫劑量為1.32PD50/ml，單相佐劑測(cè)定免疫劑量為15.582PD50/ml，因此可見(jiàn)，單相佐劑的使用可有效減少免疫使用劑量。
同時(shí)，本發(fā)明所提供的口蹄疫制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，因?yàn)槌瑵饪s培養(yǎng)已達(dá)到了濃縮目的無(wú)須超濾濃縮，所以便于超大規(guī)模生產(chǎn)。適應(yīng)于制備二價(jià)至三價(jià)疫苗，可同時(shí)防二至三個(gè)型的口蹄疫。因?yàn)楦邼舛炔《镜拇嬖谑沟闷溆心芰炫涓嗟目乖挥绊懫涿庖咝Я?。不限制毒株的使用，不同毒株只須調(diào)整配比都可達(dá)到預(yù)期的免疫效力。因?yàn)楸痉椒ㄓ行У卦黾恿瞬《緷舛?，因此可以通過(guò)調(diào)整配比解決有些毒株免疫原性不好的問(wèn)題，即使在制備多價(jià)口蹄疫疫苗時(shí)需要有多型口蹄疫病毒抗原混合，但使用劑量仍然可以很小。1ml/頭劑即可達(dá)到國(guó)際普通免疫需要(＞3PD50/頭劑)，2ml/頭劑即可達(dá)到國(guó)際應(yīng)急免疫需要(＞6PD50/頭劑)。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)病毒濃縮有效縮小了有效免疫劑量，同時(shí)高強(qiáng)度的單相佐劑確保了免疫效力。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例并非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，所有基于本發(fā)明基本思想的修改和變動(dòng)都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
制備各型抗原1.培養(yǎng)O型抗原傳統(tǒng)技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)速10-12轉(zhuǎn)/小時(shí)，單層細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒按病毒培養(yǎng)液的1％加入，病毒培養(yǎng)液為水解乳蛋白溶液90％，抗生素2％，氨基酸溶液5％，犢牛血清1％，3％的谷氨酰胺溶液1％，加HEPES 0.5％，加NaOH 0.05％，加NaHCO30.45％，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉(zhuǎn)瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為200ml/15立升瓶，提高轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速至16±1轉(zhuǎn)/小時(shí)，避免細(xì)胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，置-20℃保存。測(cè)定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml或病毒TCID50＞108.5/0.2ml。融化后采用振動(dòng)膜除細(xì)胞碎片機(jī)除去細(xì)胞碎片，BEI滅活病毒。
2.培養(yǎng)A型抗原傳統(tǒng)技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)速10-12轉(zhuǎn)/小時(shí)，單層細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒按病毒培養(yǎng)液的3％加入，病毒培養(yǎng)液為水解乳蛋白溶液87％，抗生素0.5％，氨基酸溶液8.5％，犢牛血清2％，3％谷氨酰胺溶液1％，加HEPES 0.8％，加NaOH 0.03％，NaHCO30.17％，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉(zhuǎn)瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為300ml/15立升瓶，提高轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速至16±1轉(zhuǎn)/小時(shí)，避免細(xì)胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，置-20℃保存。測(cè)定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml或病毒TCID50＞108.5/0.2ml。融化后采用振動(dòng)膜除細(xì)胞碎片機(jī)除去細(xì)胞碎片，BEI滅活病毒。
3.培養(yǎng)AsiaI型抗原傳統(tǒng)技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)速10-12轉(zhuǎn)/小時(shí)，單層細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒按病毒培養(yǎng)液的5％加入，病毒培養(yǎng)液為水解乳蛋白溶液85％，抗生素1％，氨基酸溶液10％，犢牛血清2％，3％谷氨酰胺溶液1％，加HEPES 0.6％，加NaOH 0.04％，加NaHCO30.36％，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉(zhuǎn)瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為400ml/15立升瓶，提高轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速至16±1轉(zhuǎn)/小時(shí)，避免細(xì)胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，置-20℃保存。測(cè)定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml或病毒TCID50＞108.5/0.2ml。融化后采用振動(dòng)膜除細(xì)胞碎片機(jī)除去細(xì)胞碎片，BEI滅活病毒。
制備疫苗采用常規(guī)方法制備如下疫苗。
1.雙相佐劑型，佐劑為法國(guó)SEPPIC的ISA206，抗原為例1.3.制備的各型抗原按1∶1比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
2.雙相佐劑型，佐劑為法國(guó)SEPPIC的ISA206，抗原為例1.2.3制備的各型抗原按1∶1∶1比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
3.單相佐劑型，佐劑為法國(guó)SEPPIC的50V，抗原為例1.3制備的各型抗原按1∶3比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
4.單相佐劑型，佐劑為90％的礦物白油與10％的司本80混合制得佐劑，抗原為例1.2.3制備的各型抗原按1∶3∶3比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
5.單相佐劑型，佐劑為95％的礦物白油與5％的司本80混合制得佐劑，抗原為例1.2.3制備的各型抗原按1∶3∶3比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
傳統(tǒng)方法進(jìn)行成品檢驗(yàn)用至少6月齡的健康易感牛(各型中和抗體≤1∶4)，每一型的檢驗(yàn)用牛15頭，分為3組，每組5頭。將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個(gè)劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛，接種28日后，連同條件相同的對(duì)照牛2頭，每頭牛舌上表面皮兩側(cè)分兩點(diǎn)皮內(nèi)注射?？谔阋逴型或亞I型或A型病毒強(qiáng)毒，每點(diǎn)0.1ml(共0.2ml含10000ID50)。連續(xù)觀察14日，對(duì)照牛均應(yīng)至少1蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍，免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，而其它部位無(wú)病變時(shí)判為保護(hù)。除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型口蹄疫水泡或潰瘍判為不保護(hù)。根據(jù)免疫牛的保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算被檢疫苗的PD50。每頭份疫苗(按2ml計(jì))應(yīng)至少含6PD50。
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫疫苗制備方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝，其特征在于單層細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中以體積計(jì)種毒接入量為病毒培養(yǎng)液的1～5％；病毒培養(yǎng)液主要包括水解乳蛋白溶液85～90％，抗生素0.5～2％，氨基酸溶液5～10％，3％的谷氨酰胺溶液1％，加HEPES0.5～0.8％，加堿溶液調(diào)pH至7.5±0.1；轉(zhuǎn)瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為200-400ml/15立升瓶，出現(xiàn)細(xì)胞致病作用后，收獲病毒液，置-20℃保存。測(cè)定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml，病毒TCID50＞108.5TCID50/0.2ml，融化后采用振動(dòng)膜除細(xì)胞碎片機(jī)除去細(xì)胞碎片，BEI滅活病毒；將培養(yǎng)的各型合格病毒液混合制備疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中各型病毒液混合制備疫苗時(shí)，二價(jià)苗的比例為1∶1～3，三價(jià)苗的比例為1∶1～3∶1～3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中種毒接入量為1～5％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中病毒培養(yǎng)液還包括犢牛血清1～2％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中所述堿溶液為NaOH和/或NaHCO3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中接入病毒和病毒培養(yǎng)液后轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速為16±1轉(zhuǎn)/小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中疫苗配制采用單相佐劑型，佐劑與抗原配比為1∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中所述單項(xiàng)佐劑為法國(guó)SEPPIC的50V。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中疫苗配制采用雙相佐劑型，佐劑為法國(guó)SEPPIC的ISA206，佐劑與混合抗原比例為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種口蹄疫疫苗制備方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝。單層細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒使用量按病毒培養(yǎng)液的1～5％，病毒培養(yǎng)液主要包括水解乳蛋白溶液85～90％，抗生素0.5～2％，氨基酸溶液5～10％， 3％的谷氨酰胺溶液1％，加HEPES0.5～0.8％，加堿溶液調(diào)pH至7.5±0.1；滅活病毒后混合制備疫苗，其中二價(jià)苗抗原比例為1∶1～3，三價(jià)苗抗原比例為1∶1～3∶1～3；雙相佐劑型疫苗，佐劑為法國(guó)SEPPIC的ISA206，佐劑與混合抗原的比例為1∶1；單相佐劑型疫苗，佐劑為法國(guó)SEPPIC的50V，佐劑與混合抗原的配比為1∶1。本發(fā)明便于超大規(guī)模生產(chǎn)，適于制備多價(jià)疫苗，不限制毒株使用，縮小劑量，同時(shí)確保免疫效力。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1736480SQ20051008434
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者薛景山 申請(qǐng)人:薛景山