專利名稱：一種小牛血清去蛋白注射劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種注射劑，尤其涉及一種小牛血清去蛋白注射劑及其制備方法，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小牛血去蛋白提取物(血活素)自1955年由瑞士素高藥廠開發(fā)研制成功以來，五十年來已在世界各國推廣應(yīng)用。其注射液每毫升含有40～50毫克小牛血去蛋白提取物，其中30％為氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸及相對分子量為2500～3000的寡肽類物質(zhì)，70％是無機成分。小牛血去蛋白提取物可顯著提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)活力，提高酶活性，加速細(xì)胞的氧化磷酸化反應(yīng)和ATP的合成，激活細(xì)胞呼吸，促進(jìn)新陳代謝，加快組織再生。臨床上主要用于治療老年癡呆癥、急慢性腦血管等疾病，特別對中風(fēng)、顱腦外傷等器質(zhì)性精神障礙，對脊髓的一些病癥和外周血管閉塞性疾病等具有良好療效，無毒且耐受性好。
目前，小牛血去蛋白提取物主要通過將小牛血濃縮、超濾或透析后制備而成，在關(guān)鍵的去蛋白工序中常由于步驟多，時間長，使有效成份丟損較多。例如CN1569030A和CN1579420均公開了一種小牛血去蛋白提取物的制備工藝，其中需要在較強的酸性(例如pH3)和較強的堿性(例如pH10)條件下制備，這樣會使其中的活性成分血多肽損失嚴(yán)重，而且不僅不利于雜質(zhì)的有效去除，還有可能引入新的雜質(zhì)，如此制備的產(chǎn)品難以在臨床上使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備工藝簡捷、有效成分含量高、生物活性高的小牛血清去蛋白注射劑。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種小牛血清去蛋白注射劑，每毫升該注射劑含有以下各成分總固形物0.035～0.055g，游離氨基酸0.6～1.5mg，多肽0.4～3.0mg，細(xì)菌內(nèi)毒素含量低于1EU；pH值為6.0～8.0。其中，總固形物含量優(yōu)選為0.038～0.050g，更優(yōu)選為0.04g；多肽含量優(yōu)選為0.45～2.0mg，更優(yōu)選為0.5～1.5mg；該注射劑的pH值優(yōu)選為6.3～7.8，更優(yōu)選為6.5～7.5。
所述的游離氨基酸為下述游離氨基酸的任一種或其混合物的任一種天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸。
所述的固形物由無機物和有機活性物質(zhì)組成。其中無機物選自K+，Na+，Cl-和Ca2+中的任一種或其混合物的任一種；有機活性物質(zhì)選自氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸，血多肽中的任一種或其混合物的任一種。
本發(fā)明注射劑可以為小針注射液，例如可以為5ml/支裝，10ml/支裝或20ml/支裝，也可以為靜脈輸液，也可以根據(jù)需要制備成相應(yīng)的凍干粉針劑形式，其中優(yōu)選為小針注射液形式。
本發(fā)明注射劑有效成分含量高，純度高，不含雜質(zhì)，臨床療效高，使用時不發(fā)生過敏反應(yīng)。
本發(fā)明注射液為淡黃色澄明液體，茚三酮反應(yīng)呈陽性。該注射液的相對密度為1.021～1.025，高分子量物質(zhì)含量不超過2.0％。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種制備上述小牛血去蛋白提取物注射劑的方法。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種制備小牛血清去蛋白注射劑的方法，步驟如下1)將小牛血或血清在低溫下離心分離；取上清液(血清)，向其中加入枸椽酸鈉攪勻后于0～4℃冷藏保存1～30小時(優(yōu)選12h以上)，撇去表層油膜后，血清備用；2)將步驟1)中所得到的血清通過珠狀殼聚糖層析柱，收集過柱后的血清備用；3)向上述過柱后的血漿中加入乙醇，不斷攪拌，靜置20分鐘～2小時后離心除去蛋白沉淀；上清液減壓濃縮除去乙醇，加入蛋白酶，酶解10～38h；
4)向酶解液中加入0.4～0.6倍(V/V)蒸餾水，攪拌，用事先活化好的殼聚糖改性活性炭柱過濾，濾液備用；5)將上述濾液濃縮后加壓下用微孔濾膜過濾，濾液用微孔超濾器截留分子量小于6000道爾頓以下的組分，灌裝熔封，熱壓滅菌，即得，或者根據(jù)需要，按照常規(guī)方法制備成凍干粉針劑。
上述制備方法中，其中步驟1)將小牛血或血清在3℃～10℃低溫下離心分離10～30分鐘，離心條件為3000～6000rpm；取上清液血清，向其中加入3％重量的枸椽酸鈉；步驟2)中將血清在1～3ml/min.cm2流速范圍內(nèi)通過珠狀殼聚糖層析柱；步驟3)中向過柱后的血漿中加入濃度為80～98％的乙醇，加入量為血清體積的1.0～3.0倍；上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在37℃左右減壓濃縮到與過柱前的血清相同的體積后再加入蛋白酶，所加入蛋白酶的重量為上清液重量的1～3％，在30～50℃下酶解；步驟4)中向酶解液中加入0.5倍(V/V)蒸餾水；步驟5)中將濾液濃縮至2/3體積后，加壓下過0.2～0.9um微孔濾膜。
本發(fā)明提取方法，由于采用吸附工藝，并有加入蛋白酶進(jìn)行酶解這一有效降解蛋白等步驟，可迅速有效的去除小牛血中所含的多種蛋白，通過微孔超濾器過濾，除去高分子量物質(zhì)，所以本發(fā)明注射劑中其有效成份的含量也相應(yīng)有所提高，生物活性相對較高，同時雜質(zhì)含量降低，有利于臨床使用。
以下通過實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
有關(guān)本發(fā)明注射劑的幾種檢測方法1)茚三酮反應(yīng)檢測方法取本發(fā)明注射液2ml，加入茚三酮試液1滴，搖勻，加熱煮沸1分鐘，放冷后溶液呈藍(lán)紫色。
2)蛋白質(zhì)含量的檢測方法取本發(fā)明注射液適量，加等體積的20％磺基水楊酸溶液，不產(chǎn)生混濁即可判定為不含蛋白質(zhì)。
3)總固體含量的檢測方法稱取灼燒過的海砂約1.5g，置于稱量瓶的底部，置五氧化二磷干燥器中，于53±2℃下減壓干燥至恒重，稱其重量，作為皮重。精密量取本發(fā)明注射液2ml，置上述稱量瓶中，在相同溫度下減壓干燥至恒重，精密稱定，按下式計算得到 4)游離氨基酸含量的檢測方法取本發(fā)明注射液及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸適量，用氨基酸分析儀或HPLC進(jìn)行氨基酸分析得到。
5)高分子量物質(zhì)含量檢測按照高效液相色譜法(中國藥典2000版)測定，具體如下用凝膠色譜柱(如TSK-G2000swxl柱)，以乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)為流動相，流速為每分鐘0.8ml，檢測波長為214nm。理論塔板數(shù)按胰島素峰計算不低于800。稱取胰島素(MW＝5800)適量，用流動相制成每1ml中含1mg胰島素的溶液，作為對照品溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，另取本發(fā)明注射液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，將先于胰島素峰保留時間的峰視為高分子量物質(zhì)，按面積歸一化法計算。
6)相對密度的測定方法通過分光光度法測定(中國藥典2000版二部附錄IVA)。
7)高效液相色譜法檢測取本品作為供試品溶液，照高效液相色譜法(中國藥典2000版)，用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以磷酸二氫鉀溶液(0.68％)(用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0)∶甲醇(820∶180)為流動相，流速為每分鐘0.75ml，檢測波長為293nm，理論塔板數(shù)以第一主峰計均不低于4000。取供試品溶液10μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，記錄保留時間至第二主峰保留時間的2倍。按面積歸一化法以峰面積計算，兩主峰面積之和為總面積的75％以上。(注高效液相色譜法檢測主要用于本發(fā)明注射液的總固形物含量，游離氨基酸含量，多肽含量等成分的檢測)[實施例1]采集6個月小牛的靜脈血共10升，將小牛靜脈血在4℃下以4000rpm的條件離心分離20分鐘，在上清液中加入30克枸櫞酸鈉，攪勻，于4℃冷藏過夜，撇去表層油膜后，裝入離心管以3000rpm離心15min，分出血球，用雙層紗布濾出上層血漿約得9.5升；將血漿通過珠狀殼聚糖層析柱(血量∶殼聚糖量為10∶1)，流速控制在3ml/min.cm2，用500ml蒸餾水洗柱至流出液無色，得10升層析液；攪拌下向?qū)游龊蟮难獫{中加入10升95％的乙醇，攪拌15min，裝入離心管，以5000rpm速度離心15min，除去蛋白沉淀；上清液在用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓于37℃回收乙醇10升，將蒸餾液轉(zhuǎn)移至水解罐中，加入25克木瓜蛋白酶，攪勻，保溫水解24h；向水解液中加入5升蒸餾水稀釋，用事先于120℃活化4h的殼聚糖改性活性炭粉柱過濾(液∶炭比為10∶1)，濾液濃縮至10升，用藥液泵將濾液壓過0.2um微孔濾膜，濾液用Milipore超濾器截留分子量小于6000道爾頓以下的組分(超濾速度為10～1500ml/分，蠕動泵壓為≤0.1～0.6mPa。灌裝，20ml/支，熔封，熱壓滅菌并于4℃冰箱中保存。
采集6月齡小牛靜脈血15升，將小牛血或血清在5℃下以3000rpm離心分離30分鐘，在上清液中加入45克枸櫞酸鈉，攪勻，于4℃冷藏過夜，撇去表層油膜后，裝入離心管以3000rpm離心15min，分出血球，用雙層紗布濾出上層血漿約得14.2升；將血漿通過珠狀殼聚糖層析柱(血量∶殼聚糖量為10∶1)，流速控制在2ml/min.cm2，用800ml蒸餾水從上方洗柱至流出液無色，得15升層析液；攪拌下向?qū)游龊蟮难獫{中加入30升96％的乙醇，攪拌15min，裝入離心管，以5000rpm速度離心15min，除去蛋白沉淀；上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓于37℃回收乙醇30升，將蒸餾液轉(zhuǎn)移至水解罐中，加入胰蛋白酶45克，攪勻，保溫水解24h；向水解液中加入5升蒸餾水稀釋，用事先于120℃活化4h的殼聚糖改性活性炭粉柱過濾(液∶炭比為10∶1)，濾液濃縮至15升，用藥液泵將濾液壓過0.4um微孔濾膜，濾液用Milipore超濾器截留分子量小于6000道爾頓以下的組分(超濾速度為10～1500ml/分，蠕動泵壓為≤0.1～0.6mPa)。灌裝，10ml/支，熔封，熱壓滅菌并于4℃冰箱中保存。
采集6月齡小牛靜脈血20升，將小牛靜脈血在5℃下以5000rpm離心分離30分鐘，在上清液中加入60克枸櫞酸鈉，攪勻，于4℃冷藏過夜，撇去表層油膜后，裝入離心管以4000rpm離心10min，分出血球，用雙層紗布濾出上層血漿約得19升；將血漿通過珠狀殼聚糖層析柱(血量∶殼聚糖量為10∶1)，流速控制在1.2ml/min.cm2，用1000ml蒸餾水從上方洗柱至流出液無色，得20升層析液；攪拌下向?qū)游龊蟮难獫{中加入30升80％的乙醇，攪拌15min，裝入離心管，以5000rpm速度離心15min，除去蛋白沉淀；上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓于37℃回收乙醇30升，將蒸餾液轉(zhuǎn)移至水解罐中，加入復(fù)合蛋白酶60克，攪勻，保溫水解24h；向水解液中加入10升蒸餾水稀釋，用事先于120℃活化4h的殼聚糖改性活性炭粉柱過濾(液∶炭比為10∶1)，濾液濃縮至20升，用藥液泵將濾液壓過0.45um微孔濾膜，濾液用Milipore超濾器截留分子量小于6000道爾頓以下的組分。灌裝于西林瓶中，5ml/瓶，凍干，封蓋，即得本發(fā)明凍干粉針劑。
本發(fā)明實施例所制備的小牛血清去蛋白注射液各有效成分含量的檢測結(jié)果見表1。
表1 本發(fā)明小牛血清去蛋白注射液各有效成分含量的檢測結(jié)果
本發(fā)明小牛血清去蛋白注射液有效成分含量檢測一、試驗材料1、供試樣品本發(fā)明實施例2所制備的小牛血清去蛋白注射劑。
2、對照樣品市售的小牛血去蛋白提取物注射液(生產(chǎn)廠家黑龍江珍寶島制藥有限公司)。
二、檢測方法1、檢測儀器萬分之一天平，氨基酸分析儀，稱重砰，真空泵，電烘箱，坩鍋，酒精燈。
2、檢測方法總固體含量如前所述。
游離氯基酸取本品及標(biāo)準(zhǔn)氯基酸適量，用氯基酸分析儀進(jìn)行分析。
無機鹽干燥總固體物用熾灼殘渣法，灰化以后稱重。
小分子有機物總固體物的量減去無機鹽量，得到小分子有機物。
三、檢測結(jié)果樣品的各有效成分含量檢測結(jié)果見表2。
表2本發(fā)明注射液有效成分含量與對照樣品比較結(jié)果

檢測結(jié)果說明，本發(fā)明所制備的注射液含有較高的有效成分，與對照樣品相比，其有效成分的含量明顯要高于對照樣品。
試驗例2本發(fā)明小牛血清去蛋白注射劑生物活性試驗本發(fā)明小牛血清去蛋白注射劑為細(xì)胞呼吸激活劑，能促進(jìn)細(xì)胞對氧的攝取和利用。通過WARBURG微量呼吸檢壓儀測定其在豚鼠肝細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞呼吸的活力，由耗氧增加量計算其生物活性。測定小牛血去蛋白注射液樣品的生物活性，與市售小牛血清去蛋白注射劑樣品(生產(chǎn)廠家黑龍江珍寶島制藥有限公司)比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的QO2(μl·O2/mg·h)均高于6.40，對照品的相應(yīng)的數(shù)值均低于5.50。
試驗例3本發(fā)明小牛血清去蛋白注射劑過敏反應(yīng)試驗取體重250～350g健康豚鼠(購自北京維通利華生物工程公司)6只，連續(xù)3次隔日腹腔注射本發(fā)明注射液0.5ml，然后分成兩組，每組3只，分別在第一次注射后第14天及第21天自靜脈注射本發(fā)明注射液1.0ml，注射15分鐘內(nèi)，不出現(xiàn)過敏反應(yīng)(過敏反應(yīng)陰性)。不出現(xiàn)豎毛、呼吸困難、噴嚏，干嘔或連續(xù)咳嗽3聲等任何現(xiàn)象，更無出現(xiàn)抽搐、虛脫或死亡等現(xiàn)象。
試驗結(jié)果說明，本發(fā)明小牛血清去蛋白注射劑使用安全，無過敏反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種小牛血清去蛋白注射劑，其特征在于，每毫升該注射劑的總固形物含量為0.035g～0.055g，游離氨基酸含量為0.6～1.5mg，多肽含量為0.4～3.0mg；該注射劑的pH值為6.0～8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的小牛血清去蛋白注射劑，其特征在于，所述的總固形物由無機物和有機活性物質(zhì)組成；其中無機物選自K+，Na+，Cl-和Ca2+中的任一種或其混合物的任一種，有機活性物質(zhì)選自氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸，血多肽中的任一種或其混合物的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的小牛血清去蛋白注射劑，其特征在于，每毫升該注射劑的總固形物含量為0.038～0.050g，游離氨基酸含量為0.8～1.2mg，多肽含量為0.45～2.0mg；該注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素含量低于1EU，pH值為6.3～7.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的小牛血清去蛋白注射劑，其特征在于，所述的總固形物含量為0.04g，pH值為6.5～7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的小牛血清去蛋白注射劑，其特征在于，所述的游離氨基酸選自天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸中的任一種或它們混合物的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任意一項的小牛血清去蛋白注射劑，其特征在于，所述的注射劑為凍干粉針劑形式。
7.一種制備權(quán)利要求1～5中任意一項的小牛血清去蛋白注射劑的方法，包括以下步驟1)將小牛血或血清在低溫下離心分離；取上清液血清，向其中加入枸椽酸鈉攪勻后于0～4℃冷藏保存1～30小時，撇去表層油膜后，血清備用；2)將步驟1)中所得到的血清通過珠狀殼聚糖層析柱，收集過柱后的血清備用；3)向上述過柱后的血清中加入乙醇，不斷攪拌，靜置20分鐘～2小時后離心除去蛋白沉淀，將上清液減壓濃縮除去乙醇，加入蛋白酶，酶解10～38h；4)向酶解液中加入0.4～0.6倍體積的蒸餾水，攪拌，用事先活化好的殼聚糖改性活性炭柱過濾，濾液備用；5)將上述濾液濃縮后加壓下用微孔濾膜過濾，濾液用微孔超濾器截留分子量小于6000道爾頓以下的組分，灌裝熔封，熱壓滅菌，即得；或者根據(jù)需要將藥液冷凍干燥制備成凍干粉針劑。
8.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征是步驟1)將小牛血或血清在3℃～10℃低溫下離心分離，離心條件為轉(zhuǎn)速3000～6000rpm，離心時間10～30分鐘；取上清液血清，向其中加入3％重量的枸椽酸鈉后于0～4℃冷藏保存12～30小時。
9.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征是步驟2)中將血清按1～3ml/min.cm2流速范圍通過珠狀殼聚糖層析柱。
10.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征是步驟3)中向過柱后的血清中加入濃度為80～98％的乙醇，加入量為血清體積的1.0～3.0倍；將上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在37℃左右減壓濃縮至與過柱前的血清相同的體積后再加入蛋白酶，所加入蛋白酶的重量為上清液重量的1～3％，在30～50℃下酶解。
11.按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征是步驟5)中將濾液濃縮至2/3體積后，加壓下過0.2～0.9um微孔濾膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的小牛血清去蛋白注射劑及其制備方法。本發(fā)明小牛血清去蛋白注射劑每毫升的總固體含量為0.035g～0.055g，游離氨基酸含量為0.6～1.5mg，多肽含量為0.4～3.0mg；本發(fā)明注射劑的細(xì)菌內(nèi)毒素含量低于1EU，且pH為6.0～8.0。本發(fā)明注射液有效成分含量高，生物活性和純度高，雜質(zhì)含量低。經(jīng)試驗證實，本發(fā)明注射液臨床療效高，無任何毒副作用，使用時不發(fā)生過敏反應(yīng)。
文檔編號A61P25/28GK1899307SQ20051008424
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者郭東宇 申請人:郭東宇