專利名稱：7－氧代吡啶并嘧啶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及7-氧代-吡啶并嘧啶。具體地，本發(fā)明提供了2，6-二取代的7-氧代-吡啶并[2，3-d]嘧啶，其制備方法，含有它們的藥物制劑，以及應用它們的方法。
背景技術：
促分裂原活化的蛋白激酶(MAP)屬于定向脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，它們通過雙磷酸化激活它們的底物。該激酶通過大量包括營養(yǎng)和滲透壓應力、UV光、生長因子、內毒素和炎性細胞因子在內的信號激活。MAP激酶中有一組是包括多種同工型的p38激酶組(例如，p38α，p39β，p38γ和p38δ)。該p38激酶負責磷酸化和激活轉錄因子以及其它激酶，其被物理和化學應力、促炎性細胞因子和細菌脂多糖激活。
更重要的是，已經表明p38磷酸化的產物介導包括TNF和IL-1的炎性細胞因子的產生，以及環(huán)加氧酶-2的產生。這些細胞因子的每一種都涉及多種病癥。例如，TNF-a是一種主要由激活的單細胞和巨嗜細胞產生的細胞因子。其過量或無控制的產生在類風濕性關節(jié)炎的病理學中發(fā)揮病因的作用。最近，已經表明TNF產生的抑制在治療炎癥、炎性腸病、多發(fā)性硬化和哮喘方面有廣泛應用。
TNF還涉及病毒感染，例如HIV，流感病毒，以及包括1型單純皰疹病毒(HSV-1)，2型單純皰疹病毒(HSV-2)，巨細胞病毒(CMV)，水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒，人皰疹病毒-6(HHV-6)，人皰疹病毒-7(HHV-7)，人皰疹病毒-8(HHV-8)在內的皰疹病毒，假狂犬病和鼻氣管炎，等。
同樣，IL-1也是由激活的單細胞和巨嗜細胞產生的，并且在許多包括類風濕性關節(jié)炎、發(fā)熱、和骨重吸收的減弱在內的病理生理反應中起作用。
另外，p38的介入可能與中風、阿爾茨海默氏病、骨關節(jié)炎、肺損傷、膿毒性休克、血管發(fā)生、皮炎、牛皮癬和特異性皮炎有關，參見，例如，J.Exp.Opin.Ther.Patents，(2000)10(1)。
WO 96/34867公開了某些作為蛋白酪氨酸激酶介導的細胞增殖的抑制劑的吡啶并[2，3-d]嘧啶。
通過抑制p38激酶而對這些細胞因子進行抑制有益于控制、減少和緩解許多這些疾病的病癥。

發(fā)明內容
一方面，本發(fā)明提供了下式代表的化合物 其前藥和藥用鹽，其中R1為氫或烷基；R2為-CR′R″-Ra(其中R′和R″為氫，羥基烷基或烷基，其中至少一個為烷基或羥基烷基，和Ra為羥基烷基)，-Ry-S(O)2-Rx(其中Rx為烷基和Ry為亞烷基)，烷氧基-取代的烷基，雜環(huán)基烷基或C4-C5環(huán)烷基，其中R2中存在的每個羥基可以獨立呈酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，或磺酸酯衍生物的形式；或R1和R2一起與它們連接的氮原子形成雜環(huán)基；R3為氫，烷基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，鹵代烷基，雜烷基，氰基烷基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基，亞烷基-C(O)-R(其中R為氫，烷基，羥基，烷氧基，氨基，單烷基氨基或二烷基氨基)或?；?；和Ar1為芳基。
式I的化合物和其上述鹽是蛋白激酶的抑制劑，表現有效的體內抗p38活性。因此，這類化合物可以用于治療促炎性細胞因子例如TNF和IL-1介導的疾病。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了用于治療p38介導的疾病或病癥的方法，其中對需要該治療的患者給藥治療有效量的式I化合物。
本發(fā)明的另一個方面提供了制備上述化合物的方法。
本發(fā)明的另一個方面提供了制備用于治療p38介導的疾病或病癥的藥物的方法。
除非另有說明，用于說明書和權利要求的下列術語含義如下″酰基″是指基團-C(O)R，其中R為氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，苯基或苯基烷基，其中烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，和苯基烷基如本文中所定義。代表性的例子包括但不限于甲酰基，乙?；?，環(huán)己基羰基，環(huán)己基甲基羰基，苯甲?；?，芐基羰基等等。
″?；被迨侵富鶊F-NR′C(O)R，其中R′為氫或烷基，和R為氫，烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，苯基或苯基烷基，其中烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，和苯基烷基如本文中所定義。代表性的例子包括但不限于甲?；被?，乙酰基氨基，環(huán)己基羰基氨基，環(huán)己基甲基-羰基氨基，苯甲?；被?，芐基羰基氨基等等。
″烷氧基″是指基團-OR其中R為如本文中定義的烷基，例如甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基等等。
″烷基″是指1-6個碳原子的直鏈飽和一價烴基或3-6個碳原子的支鏈飽和一價烴基，例如甲基，乙基，丙基，2-丙基，n-丁基，異-丁基，叔-丁基，戊基等等。
″亞烷基″是指1-6個碳原子的直鏈飽和二價烴基或3-6個碳原子的支鏈飽和二價烴基，例如亞甲基，亞乙基，2，2-二甲基亞乙基，亞丙基，2-甲基亞丙基，亞丁基，亞戊基等等。
″烷硫基″是指基團-SR，其中R為為如上定義的烷基，例如甲硫基，乙硫基，丙硫基，丁硫基等等。
″芳基″是指一價單環(huán)或雙環(huán)芳香烴基，其任選地獨立地被一個或多個取代基，優(yōu)選一個、兩個或三個取代基取代，取代基優(yōu)選地選自烷基，羥基，烷氧基，鹵代烷基，鹵代烷氧基，雜烷基，鹵素，硝基，氰基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基，亞甲基二氧基，亞乙基二氧基和?；８唧w地，術語芳基包括但不限于苯基，氯苯基，甲氧基苯基，1-萘基，2-萘基及其衍生物，或氟苯基，更具體為氯苯基或氟苯基。
″環(huán)烷基″是指3-7個、優(yōu)選3-5個環(huán)碳原子的飽和一價環(huán)烴基，例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)己基，4-甲基環(huán)己基等等，優(yōu)選環(huán)丙基，環(huán)丁基或環(huán)己基。
″二烷基氨基″是指基團-NRR′，其中R和R′獨立地表示如本文中定義的烷基，羥基烷基，環(huán)烷基，或環(huán)烷基烷基基團。有代表性的例子包括但不限于二甲基氨基，甲基乙基氨基，二(1-甲基乙基)氨基，(環(huán)己基)(甲基)氨基，(環(huán)己基)(乙基)氨基，(環(huán)己基)(丙基)氨基，(環(huán)己基甲基)(甲基)氨基，(環(huán)己基甲基)(乙基)氨基等等。
術語″R2中存在的每個羥基可以獨立呈酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，或磺酸酯衍生物的形式″是指R2中存在的羥基基團(-OH)可以獨立地分別衍生成Ra-C(＝O)-O-，RaRbN-C(＝O)-O-，Ra-O-C(＝O)-O-或Ra-SO2-O-，其中Ra和Rb獨立為如本文中定義的氫，烷基，芳基或芳烷基。
″鹵素″是指氟，氯，溴，或碘，優(yōu)選氟和氯。
″鹵代烷基″是指被一個或多個相同或不同的鹵素原子取代的烷基，例如-CH2Cl，-CF3，-CH2CF3，-CH2CCl3等等。
″雜烷基″是指如本文中定義的烷基，其中一個、兩個或三個氫原子被獨立地選自-ORa，-NRbRc，和-S(O)nRd的取代基所取代(其中n為0-2的整數)，可以理解雜烷基基團的連接點是通過碳原子，其中Ra為氫，?；榛?，環(huán)烷基，或環(huán)烷基烷基；Rb和Rc相互獨立地為氫，?；榛?，環(huán)烷基，或環(huán)烷基烷基，或Rb和Rc一起形成環(huán)烷基或芳基環(huán)烷基；和當n為0，Rb為氫，烷基，環(huán)烷基，或環(huán)烷基烷基，和當n為1或2，Rd為烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，氨基，?；被?，單烷基氨基，或二烷基氨基。有代表性的例子包括但不限于2-羥基乙基，3-羥基丙基，2-羥基-1-羥基甲基乙基，2，3-二羥基丙基，1-羥基甲基乙基，3-羥基丁基，2，3-二羥基丁基，2-羥基-1-甲基丙基，2-氨基乙基，3-氨基丙基，2-甲基磺?；一?，氨基磺?；谆被酋；一被酋；?，甲基氨基磺?；谆谆被酋；一谆被酋；鹊?。
″雜環(huán)基″是指3-8個環(huán)原子的飽和或不飽和的非芳香環(huán)基，其中一或兩個環(huán)原子為選自N、O或S(O)n(其中n為0-2的整數)的雜原子，其余的環(huán)原子為碳。更具體地，″雜環(huán)基″是指5-6個、優(yōu)選6個環(huán)原子的飽和的非芳香環(huán)基，其中一或兩個環(huán)原子、優(yōu)選一個環(huán)原子為N-，其余的環(huán)原子為碳原子。該雜環(huán)基環(huán)可以任選地被一個、兩個或三個選自下組的取代基獨立取代烷基，鹵代烷基，雜烷基，鹵素，硝基，氰基，氰基烷基，羥基，烷氧基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基，芳烷基，-(X)n-C(O)R(其中X為O或NR′，n為0或1，R為氫，烷基，鹵代烷基，羥基(當n為0)，烷氧基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基或任選取代的苯基，和R′為H或烷基)，-亞烷基-C(O)R(其中R為OR或NR′R″和R為氫，烷基或鹵代烷基，和R′和R″獨立地為氫或烷基)，-亞烷基-S(O)n-Ra(其中n為0，1或2，優(yōu)選為0，Ra為烷基)或-S(O)nR(其中n為0-2的整數)，這樣當n為0時，R為氫，烷基，環(huán)烷基，或環(huán)烷基烷基，和當n為1或2時，R為烷基，環(huán)烷基，環(huán)烷基烷基，氨基，?；被瑔瓮榛被蚨榛被?。更具體地，術語雜環(huán)基包括但不限于四氫吡喃基，哌啶子基，N-甲基哌啶-3-基，哌嗪子基，N-甲基吡咯烷-3-基，3-吡咯烷子基，嗎啉代，硫代嗎啉代，硫代嗎啉代-1-氧化物，硫代嗎啉代-1，1-二氧化物，吡咯啉基，咪唑啉基，N-甲磺?；?哌啶-4-基，及其衍生物。優(yōu)選哌啶基。優(yōu)選地，″雜環(huán)基″在雜原子處被選自下組的一個取代基取代烷基、優(yōu)選取代的烷基，其中該取代基為氨基，羰基，例如單-或優(yōu)選二烷基氨基羰基，例如二甲基氨基羰基，羧基或烷氧基羰基，例如甲氧基羰基。
″雜環(huán)基烷基″是指基團-RaRb，其中Ra為亞烷基基團，Rb為上述定義的雜環(huán)基基團，可以理解Rb通過雜環(huán)基環(huán)的碳原子連接到Ra上，例如四氫吡喃-2-基甲基，2-或3-哌啶基甲基等等。
″羥基烷基″是指如本文定義的烷基基團，被一個或多個、優(yōu)選一個、兩個或三個、更優(yōu)選一個或兩個羥基基團取代，條件是同一個碳原子不帶有多于一個的羥基基團，優(yōu)選地，R2的取代基如實施例7-18和表1化合物7，12，13，24和25中所定義。有代表性的例子包括但不限于羥基甲基，2-羥基乙基，2-羥基丙基，3-羥基丙基，1-(羥基甲基)-2-甲基丙基，2-羥基丁基，3-羥基丁基，4-羥基丁基，2，3-二羥基丙基，2-羥基-1-羥基甲基乙基，2，3-二羥基丁基，3，4-二羥基丁基和2-(羥基甲基)-3-羥基丙基，優(yōu)選2-羥基乙基，2，3-二羥基丙基和1-(羥基甲基)-2-羥基乙基。因此，在本文中使用的術語″羥基烷基″用于限定雜烷基基團的子集。
″離去基團″具有合成有機化學中常規(guī)的定義，即能夠被親核體置換的原子或基團，包括鹵素(如氯，溴，和碘)，鏈烷烴磺酰氧基，芳烴磺酰氧基，烷基羰基氧(例如乙酰氧基)，芳基羰基氧，甲磺酰氧基，甲苯磺酰氧基，三氟甲烷磺酰氧基，芳氧基(例如2，4-二硝基苯氧基)，甲氧基，N，O-二甲基羥基氨基等等。
″單烷基氨基″是指基團-NHR，其中R為如上定義的烷基，羥基烷基，環(huán)烷基，或環(huán)烷基烷基基團，例如甲基氨基，(1-甲基乙基)氨基，羥基甲基氨基，環(huán)己基氨基，環(huán)己基甲基氨基，環(huán)己基乙基氨基等等。
″任選取代的苯基″是指任選被一個或多個、優(yōu)選一個或兩個選自下組的取代基獨立地取代的苯環(huán)烷基，羥基，烷氧基，鹵代烷基，鹵代烷氧基，雜烷基，鹵素，硝基，氰基，氨基，亞甲基二氧基，亞乙基二氧基，和?；?，優(yōu)選被一個優(yōu)選鹵素，例如氟或氯的取代基取代的苯環(huán)。
″藥用賦形劑″是指用于制備藥學組合物的通常是安全、無毒并且既無生物學上的也無其它方面的不良作用的賦形劑，而且包括獸醫(yī)以及人類藥用可接受的賦形劑。說明書和權利要求書中使用的″藥用賦形劑″包括一種或一種以上的賦形劑。
化合物的″藥用鹽″是指藥學可接受并具有母體化合物的預期藥理學活性的化合物。此類鹽包括(1)酸加成鹽，與無機酸形成的酸加成鹽，所述的無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或與有機酸形成的酸加成鹽，有機酸例如是乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊烷丙酸、羥基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲?；?苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯代苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環(huán)[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等；或(2)當母體化合物中存在的酸性質子或被金屬離子代替時生成的鹽，所述的金屬離子例如是堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子；或與有機堿配位時生成的鹽，所述的有機堿例如是乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。
本文中使用的″前藥″和″前-藥″可以互換使用，并且是指任何當將此類前藥施用給哺乳動物對象時在體內可以釋放出式(I)的活性母體藥物的任何化合物。式(I)的化合物的前藥是通過修飾式(I)的化合物中存在的一個或多個官能團來制得，制備所采用的方式應使該修飾可以體內裂解釋放出母體化合物。前藥包括式(I)的化合物，其中式(I)的化合物中羥基、氨基、巰基、羧基或羰基分別與任何可以在體內裂解再生出游離羥基、氨基或巰基的基團結合。前藥的實例包括但不限于式(I)的化合物中的羥基官能團的酯(例如醋酸酯，二烷基氨基乙酸酯，甲酸酯，磷酸酯，硫酸酯，和苯甲酸酯衍生物)、磺酸酯和氨基甲酸酯(例如N，N-二甲基氨基羰基)，羧基官能團基團的酯基(例如乙基酯，嗎啉代乙醇酯)，氨基官能團的N-?；苌?例如N-乙?；?N-曼尼希堿類，席夫堿類和烯胺(enaminones)，酮和醛官能團的肟、縮醛、縮酮、烯醇酯，等等，參見Bundegaard，H.″前藥的設計(Design of Prodrugs)″p 1-92，Elesevier，NewYork-Oxford(1985)。
″保護基團″是指當連接到分子中的反應性基團上時掩蔽、減少或防止該反應性的一組原子。保護基團的例子可以參見T.W.Green和P.G.Futs，有機化學的保護基團(Wiley，2nd ed.1991)，和Harrison和Harrison等，有機合成方法概要(Compendium of Synthetic Organic Methods)，1-8卷(JohnWiley和Sons，1971-1996)。有代表性的氨基保護基團包括甲?；?，乙酰基，三氟乙?；S基，芐氧基羰基(CBZ)，叔-丁氧基羰基(Boe)，三甲基甲硅烷基(TMS)，2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺?；?SES)，三苯甲基和取代的三苯甲基基團，烯丙氧基羰基，9-芴基甲基氧基羰基(FMOC)，硝基-藜蘆基氧基羰基(NVOC)等等。有代表性的羥基保護基團包括羥基或被?；虮煌榛幕鶊F，如芐基和三苯甲基醚以及烷基醚，四氫吡喃基醚，三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。
疾病的″治療″或″療法″包括(1)預防疾病，也就是使疾病的臨床癥狀不會在哺乳動物中發(fā)展，所述的哺乳動物可能與該疾病接觸或易患有該疾病但不曾經歷或顯現出疾病的該癥狀，(2)抑制疾病，也就是阻止或減輕該疾病或其臨床癥狀的發(fā)展，或(3)緩解疾病，也就是引起疾病或其臨床癥狀的減退。
″治療有效量″是指當施用給哺乳動物治療疾病時，足以實現對該疾病的治療的化合物的量?！逯委熡行Я俊鍛鶕衔?、疾病及其嚴重性、被治療哺乳動物的體重等來改變。
術語“處理”、“接觸”或“反應”當指化學反應時是指在適當條件下加入或混合兩種或多種試劑，以產生指示的和/或所需的產物的方法。應該理解，產生指示的和/或所需的產物的反應不是必須從最初加入的兩種試劑化合直接得到，即可以存在在混合物中產生的一種或多種中間體，其最終導致形成指示的和/或所需的產物。
如果在本說明書中的結構式的圖中，″N″只顯示一個或兩個鍵連接到其余結構上，或者″O″顯示一個鍵連接到其余結構上，本領域普通技術人員將會理解在式中，如果是″N″，分別存在兩個或一個″H″原子，如果是″O″，存在一個″H″原子，但是沒有被用于繪制結構式的計算機程序顯示，例如ISIS圖。因此，″-N″表示″-NH2″，″-N-″表示″-NH-″，和″-O″表示″-OH″。
按照本發(fā)明的一個方面提供了下式代表的化合物
其中R1為氫或烷基；R2為-CR′R″-Ra(其中R′和R″為氫，羥基烷基或烷基，其中至少一個為烷基或羥基烷基，和Ra為羥基烷基)，-Ry-S(O)2-Rx(其中Rx為烷基和Ry為亞烷基)，烷氧基-取代的烷基，雜環(huán)基烷基或C4-C5環(huán)烷基，其中R2中存在的每個羥基可以獨立呈酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，或磺酸酯衍生物的形式；或R1和R2一起與它們連接的氮原子形成雜環(huán)基；R3為氫，烷基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，鹵代烷基，雜烷基，氰基烷基，亞烷基-C(O)-R(其中R為氫，烷基，羥基，烷氧基，氨基，單烷基氨基或二烷基氨基)或酰基；和Ar1為芳基。
特別地，式I的優(yōu)選化合物為式II表示的化合物 其中n為1或2，優(yōu)選1，X為氫，烷基，鹵素，硝基，氰基或甲氧基，優(yōu)選鹵素。
式I的更優(yōu)選化合物為式III表示的化合物
關于式I、II或III化合物優(yōu)選R1為氫或甲基。更優(yōu)選R1為氫。
優(yōu)選式I化合物中的R2為-CR′R″-Ra(其中R′和R″為氫，羥基烷基或烷基，其中至少一個為烷基或羥基烷基，和Ra為羥基烷基)，烷氧基-取代的烷基，-Ry-S(O)2-Rx(其中Rx為烷基和RY為亞烷基)，C4-C5環(huán)烷基，或(N-取代的哌啶-4-基)甲基，更優(yōu)選-CR′R″-Ra(如前定義)，或(N-取代的哌啶-4-基)甲基，具體是(N-取代的哌啶-4-基)甲基，此處的取代優(yōu)選如前面定義中所指示，其中R2中存在的每個羥基可以獨立呈酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，或磺酸酯衍生物的形式。更加優(yōu)選的R2為(1，1-二甲基-2-羥基)乙基，(1，2-二甲基-2-羥基)丙基，(N-甲基-哌啶-4-基)甲基，[1-二甲基乙酰氨基-哌啶-4-基]甲基，[1-羧基甲基-哌啶-4-基]甲基，(1，1-二甲基-2-羥基)乙基，(1-甲基-3-羥基)丙基，(1-甲基-1-羥基甲基-2-羥基)乙基，[1，1-二(羥基甲基)丙基，(1-羥基甲基-2-甲基)丙基，(1-羥基甲基)丙基，(1-羥基甲基-2，2-二甲基)丙基，(1-羥基甲基-3-甲基)丁基，(2-羥基)丙基，(1-甲基-2-羥基)乙基，(1-羥基甲基-2-甲基)丁基，2-羥基乙基，2-羥基-2-甲基丙基，5-羥基戊基，2-羥基丁基，1-(羥基甲基)-2-羥基乙基，2，3-二羥基丙基，1-羰甲氧基甲基-哌啶-4-基]甲基，或[1-羧基甲基哌啶-4-基]甲基，或{1-甲基，2-甲基，2-[甲基-二砜]}乙基，其中R2中存在的每個羥基可以獨立呈酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，或磺酸酯衍生物的形式。
在另一個實施方案中，優(yōu)選R1和R2與它們連接的氮原子一起形成亞烷基-S(O)n-Ra-取代的雜環(huán)基(其中n為0、1或2，優(yōu)選O，和Ra為烷基)。更優(yōu)選地，R1和R2與它們連接的氮原子一起形成-亞烷基-S(O)n-Ra-取代的吖丙啶基，其中n優(yōu)選為0。
優(yōu)選地，R3為氫，烷基，氨基，單烷基氨基，二烷基氨基，鹵代烷基，環(huán)烷基，氰基甲基，雜烷基，芳基，芳烷基或亞烷基-C(O)-R(其中R為氫，烷基，羥基，烷氧基，氨基，單烷基氨基或二烷基氨基)。更優(yōu)選R3為氫，烷基，氨基，環(huán)烷基或芳基，尤其是氫，烷基或芳基。R3還可以優(yōu)選是氫，氨基，甲基，2，2，2-三氟乙基，環(huán)丙基，氰基甲基，2-羥基乙基，4-氟苯基，芐基，羧基甲基或甲氧基羰基甲基。更加優(yōu)選R3為氫，甲基，4-氟苯基，氨基或環(huán)丙基，尤其是氫，甲基或4-氟苯基。
在本發(fā)明的另一個方面提供了下式表示的化合物 其中R1為氫或烷基；R2為-CR′R″-Ra(其中R′和R″為氫或烷基，其中至少一個為烷基，和Ra為羥基烷基)，或雜環(huán)基烷基；R3為氫，烷基，環(huán)烷基，芳基，芳烷基，鹵代烷基，雜烷基，氰基烷基，亞烷基-C(O)-R(其中R為氫，烷基，羥基，烷氧基，氨基，單烷基氨基或二烷基氨基)或酰基；和Ar1為芳基。
按照本發(fā)明的此方面，特別優(yōu)選的化合物是式II表示的化合物 其中n為1或2，優(yōu)選1，和X為氫，烷基，鹵素，硝基，氰基或甲氧基，優(yōu)選鹵素。
按照本發(fā)明的此方面，更加優(yōu)選的化合物是式III表示的化合物 按照本發(fā)明的此方面，在式I化合物中優(yōu)選地，R1為氫或甲基，更優(yōu)選地，R1為氫。
優(yōu)選地，R2為-CR′R″-Ra(其中R′和R″為氫或烷基，其中至少一個為烷基，和Ra為羥基烷基；或(N-取代的哌啶-4-基)甲基，更優(yōu)選地，R2為(1，1-二甲基-2-羥基)乙基，(1，2-二甲基-2-羥基)丙基，(N-甲基哌啶-4-基)甲基，[1-二甲基乙酰氨基-哌啶-4-基]甲基，[1-羧基甲基-哌啶-4-基]甲基，或[1-羧基甲氧基甲基-哌啶-4-基]甲基。
優(yōu)選地，R3為氫烷基，鹵代烷基，環(huán)烷基，氰基甲基，雜烷基，芳基，芳烷基或亞烷基-C(O)-R(其中R為氫，烷基，羥基，烷氧基，氨基，單烷基氨基或二烷基氨基)。最優(yōu)選R3為氫，甲基，2，2，2-三氟乙基，環(huán)丙基，氰基甲基，2-羥基乙基，4-氟苯基，芐基，羧基甲基或甲氧基羰基甲基。更優(yōu)選地，R3為氫或甲基。
在本發(fā)明的另一個方面，提供如前定義的式I，II或III的化合物，其中R2為雜環(huán)基烷基和/或R3為氨基，其具有上述給出的雜環(huán)基烷基和氨基，R1和Ar1的定義和優(yōu)選定義。
應該理解，當R3為氫時，該化合物可以存在下列的互變異構型。
因此，除了上述化合物，本發(fā)明還包括所有的互變異構體。并且，本發(fā)明還包括所有的這些化合物的藥用鹽，以及該化合物的前體藥物形式和所有的立體異構體，無論是純的手性形式，還是外消旋混合物或其它形式的混合物。
另外，上如優(yōu)選基團的組合可以形成其它優(yōu)選的實施方案；因此，例如，式I的優(yōu)選取代基R1、R2和R3也可以是式II和III化合物的優(yōu)選取代基。
一些有代表性的式I化合物如下表1所示。
表1，式I的有代表性的化合物









在體外p38檢測中，式I的IC50小于10μM，優(yōu)選小于5μM，更優(yōu)選小于2μM，最優(yōu)選小于1μM。具體地，在表I中式I化合物在體外p38檢測中的IC50在大約0.712μM至0.001μM。
本發(fā)明的化合物可以以未溶劑化型以及溶劑化型(包括水合形式)形式存在。通常，溶劑化形式，包括水合形式等同于未溶劑化形式并且包括在本發(fā)明的范圍內。此外，如上所述，本發(fā)明還包括所有的這些化合物的藥用鹽，以及該化合物的前體藥物形式和所有的立體異構體，無論是純的手性形式，還是外消旋混合物或其它形式的混合物。
本發(fā)明的化合物能夠進一步形成藥用酸加成鹽。所有這些形式包括在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明化合物的藥用酸加成鹽包括從無機酸衍生的鹽，如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等；以及從有機酸衍生的鹽，如脂肪族單或二羧酸，苯基取代的鏈烷酸，羥基鏈烷酸，鏈烷二羧酸，芳香酸，脂肪族和芳香族磺酸等，這些鹽包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽，偏磷酸鹽，焦磷酸鹽，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，乙酸鹽，丙酸鹽，辛酸鹽，異丁酸鹽，草酸鹽，丙二酸鹽，琥珀酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，富馬酸鹽，馬來酸鹽，扁桃酸鹽，苯甲酸鹽，氯代苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基苯甲酸鹽，鄰苯二甲酸鹽，苯磺酸鹽，甲苯磺酸鹽，苯基乙酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，馬來酸鹽，酒石酸鹽，甲烷磺酸鹽，等等。還包括氨基酸的鹽如精氨酸鹽等，葡糖酸鹽，半乳糖醛酸(例如參見Berge等“藥物鹽”，藥物科學雜志(J.of Pharmaceutical Science)，1977，66，1-19)。
堿性化合物的酸加成鹽的制備可以通過以常規(guī)方式將游離堿與足夠量的所需的酸接觸，制備鹽。通過以常規(guī)方式將該鹽形式與堿接觸，分離游離堿，可以再生出游離堿的形式。該游離堿形式在某些物理性質如在極性溶劑中的溶解度有些不同于其各自的鹽，但對于本發(fā)明的目的，這些鹽在其它方面等同于其各自的游離堿。
堿性藥用加成鹽可以與金屬離子或胺形成，如堿金屬和堿土金屬離子或有機胺。用作陽離子的金屬離子的例子包括鈉、鉀、鎂、鈣等等。適合的胺的例子有N，N′-二芐基亞乙基二胺，氯普魯卡因，膽堿，二乙醇胺，亞乙基二胺，N-甲基葡糖胺，和普魯卡因(例如參見Berge等“藥物鹽”，藥物科學雜志(J.of Pharmaceutical Science)，1977，66，1-19)。
酸性化合物的堿加成鹽的制備可以通過以常規(guī)方式將游離酸與足夠量的所需的堿接觸，制備鹽。通過以常規(guī)方式將該鹽形式與酸接觸，分離游離酸，可以再生出游離酸的形式。該游離酸形式在某些物理性質如在極性溶劑中的溶解度有些不同于其各自的鹽，但對于本發(fā)明的目的，這些鹽在其它方面等同于其各自的游離酸。
應用本領普通技術人員的公知技術，可以通過多種方法制備本發(fā)明的化合物。在本發(fā)明的一個方面，用于制備式I化合物的方法如下述反應路線1所示反應路線1
用伯胺(R3-NH2)處理式Ia化合物(可以容易地按照本領域公知方法制備或可以按照本領普通技術人員公知的來源購買)，得到式Ib化合物。該反應通常于在反應條件下惰性的溶劑中進行，優(yōu)選鹵代脂肪族烴，尤其是二氯甲烷，任選鹵代的芳香族烴，開鏈或環(huán)狀醚(例如四氫呋喃)，甲酰胺或低級烷醇。該反應適宜在大約-20℃至大約120℃下進行。
還原式Ib化合物，得到式Ic的醇。按照本領域普通技術人員已知的方法，通常用氫化鋁鋰進行該還原(例如在在還原條件下是惰性的溶劑中，優(yōu)選開鏈或環(huán)狀醚，尤其是四氫呋喃，在大約-20℃至大約70℃，優(yōu)選大約0℃至大約室溫)。
在下步中，氧化式Ic的醇得到式Id的甲醛(carboxaldehyde)。該氧化通常使用二氧化錳進行，盡管也可以使用多種其它方法(例如參見“高級有機化學”(Advanced Organic Chemistry)，第4版，March，John Wiley & Sons，New York(1992))。根據使用的氧化劑，該反應通常在在特定的氧化條件下是惰性的溶劑中進行，優(yōu)選鹵代的脂肪族烴，尤其是二氯甲烷，或任選鹵代的芳香族烴。該反應適宜在大約0℃至大約60℃下進行。
式Id的甲醛(carboxaldehyde)與芳基取代的乙酸酯Ar1-CH2-CO2R(其中R為烷基基團)在堿存在下反應得到式Ie的化合物?？梢允褂萌魏蜗鄬Ψ怯H核性堿，包括碳酸鹽，如碳酸鉀、碳酸鋰、碳酸鈉；碳酸氫鹽，如碳酸氫鉀、碳酸氫鋰、碳酸氫鈉；胺，如仲胺和叔胺；和樹脂結合的胺，如1，3，4，6，7，8-六氫-2H嘧啶并[1，2-a]嘧啶。為了增加產物的產率和/或反應速率，可以通過共沸除去反應中形成的水。方便地，該反應在相對極性、但在反應條件下是惰性的溶劑中進行，優(yōu)選酰胺，如二甲基甲酰胺，N-取代的吡咯烷酮，尤其是1-甲基-2-吡咯烷酮，反應溫度在在大約70℃至大約150℃，特別是在或接近溶劑回流溫度下進行，以利于進行共沸除去水。
應用氧化劑如3-氯過苯甲酸(即MCPBA)和過硫酸氫鉀制劑(Oxone)氧化Ie，可以提供砜(If)，其可以轉化成多種目標化合物。Ie的氧化通常在氧化條件下是惰性的溶劑中進行。例如，當使用MCPBA作為氧化劑，溶劑優(yōu)選鹵代的脂肪族烴，尤其是氯仿。當使用過硫酸氫鉀制劑(Oxone)作為氧化劑，溶劑可以是水或有機溶劑(如乙腈)和水的混合物。反應溫度根據使用的溶劑而確定。對于有機溶劑，反應溫度通常在大約-20℃至大約50℃，優(yōu)選大約0℃至大約室溫。當水用作溶劑，反應溫度通常在大約0℃至大約50℃，優(yōu)選大約0℃至大約室溫?；蛘?，氧化可以在應用基于錸/過氧化物試劑在催化條件下進行。例如參見“通過甲基三氧錸(VII)催化的應用過氧化氫進行的亞砜的氧化”，Lahti，David W.；Espenson，James H，無機化學2000，39(10)pp.2164-2167；“在催化氧化中的錸氧復合物”，Catal.Today，2000，55(4)，pp317-363；和“用于制備吡啶N-氧化物的簡單和有效的方法”，Coperet，Christophe；Adolfsson，Hans；Khuong，Tinh-Alfredo V.；Yudin，Andrei K.；Sharpless，K.Barry，有機化學雜志(J.Org.Chem.)，1998，63(5)，pp1740-1741，這些文獻在本文引用作為參考。
If化合物與胺(R2-NH2)反應提供式I’化合物(即化合物I，其中R1為氫)。然后I’進一步烷基化提供式I化合物，其中R1不為氫。該反應可以在溶劑存在或不存在的條件下進行。便利地，反應在大約0℃至大約200℃，優(yōu)選大約室溫至大約150℃的溫度下進行?；蛘?，在某些條件下不使用砜If，硫化物Ie或相應的亞砜可以直接與胺(R1-NH2)反應，提供式I’化合物。另外，還可以用胺R1R2NH2烷基化If直接提供式I化合物，其中R1和R2如本發(fā)明發(fā)明概述部分所描述。
因此，本發(fā)明提供了制備式I化合物的方法，它是通過用胺(R1-NH2)處理通式式Ie或If的化合物，并任選將得到的產物與R1-L反應，其中R1如上所定義，但不包括氫，L為離去基團。
或者，式Ie的甲醛化合物可以如下述反應路線II所示制備，其不需要進行反應路線I的酯還原和醇氧化。
反應路線II
在堿存在下，用烷基甲酸酯(例如甲酸甲酯)處理式II-a化合物(其中每個Ra獨立為烷基)(可以容易地按照本領域公知方法制備或可以按照本領普通技術人員公知的來源購買)，得到式II-b化合物(其中M為金屬)。該反應通常在大約0℃至大約100℃的溫度范圍內進行。通常可以使用醚，如THF，和其它在反應條件下為惰性的溶劑。適當的堿包括醇鹽，如叔-丁醇金屬，和其它能夠使式II-a化合物脫質子化的相對非-親核性的堿。
在堿存在下，用硫脲環(huán)化式II-b化合物，得到式II-c的嘧啶。典型地，應用相應的醇鹽作為堿，在回流條件下、醇溶劑中進行該環(huán)化反應。
在堿存在下，用烷基化劑R-X1(其中R為烷基基團，X1為離去基團，如鹵化物)進行式II-c化合物的烷基化，得到式II-d化合物。適當的堿包括相對非親核性堿，包括碳酸鹽，如碳酸鉀、碳酸鋰、和碳酸鈉；碳酸氫鹽，如碳酸氫鉀、碳酸氫鋰、和碳酸氫鈉。方便地，該反應在在反應條件下惰性的相對極性的溶劑下進行，優(yōu)選丙酮，二甲基甲酰胺(DMF)或甲基吡咯烷酮(MP)。
在與上述反應路線I制備式Ie化合物所描述的類似條件下，式II-d化合物與芳基取代的乙酸酯Ar1-CH2-CO2R(其中R為烷基基團)反應，提供式II-e化合物。盡管式II-c化合物的烷基化通常在與芳基取代的乙酸酯反應前進行，但這兩個反應的順序并不重要，可以顛倒。因此，式II-c化合物可以與芳基取代的乙酸酯Ar1-CH2-CO2R反應，得到的產物可以應用烷基化劑R-X1進行烷基化，得到式II-e化合物。
然后應用烷基化劑R3-X2(其中R3如上所定義，X2為離去基團，如鹵化物)烷基化式II-e化合物的胺基，提供化合物Ie，其可以如反應路線I所描述進一步轉化為式I’化合物。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了制備式II-c的嘧啶化合物的方法，它是通過式IIa的縮醛與甲酸烷基酯反應，然后得到的產物與硫脲反應。
本發(fā)明的另一個方面提供了制備式II-e化合物的方法，它是通過式II-c化合物與烷基化劑或芳基取代的乙酸酯反應，然后得到的產物分別與芳基取代的乙酸酯或烷基化劑反應。
本領域普通技術人員可以理解對上述反應路線可以做出某些改變，但也在本發(fā)明的范圍內。例如，某些步驟涉及與特定反應條件不相容的官能團的保護基團的使用。
本發(fā)明的化合物可以用作藥物，例如以藥物制劑的形式。該藥物制劑可以通過腸內給藥，例如以片劑，包衣的片劑，糖錠劑，硬或者軟明膠膠囊，溶液劑，乳劑或者混懸劑的形式口服給藥，例如以鼻腔噴霧劑的形式鼻腔內給藥，例如以栓劑的形式直腸內給藥。但是它們也可以胃腸外給藥，例如以注射溶液的形式。
式I化合物及其上述藥用鹽可以與用于制備藥物制劑的藥物惰性的有機或無機載體一起加工。例如，乳糖，玉米淀粉或其衍生物，滑石，或者硬脂酸或其鹽等可以用作片劑，包衣的片劑，糖錠劑，硬或者軟明膠膠囊的載體。軟明膠膠囊的合適的載體包括例如植物油，蠟，脂肪，半固體或者液體多元醇等；但是，根據該活性成分的性質，可能有軟明膠膠囊根本不需要任何賦形劑的情況。制備溶液劑和糖漿劑的合適的載體包括例如水，多元醇，糖類，轉化糖和葡萄糖等。栓劑的合適的載體包括例如天然或者硬化油，蠟，脂肪，半固體或者液體多元醇等。
該藥物組合物還可以含有防腐劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑，乳化劑，甜味劑，著色劑，調味劑，改變滲透壓的鹽，緩沖劑，掩蔽劑或者抗氧化劑。除了式I化合物及其藥用鹽，它們也可以含有其它的治療上有價值的活性劑。
含有本發(fā)明化合物以及相容的藥用載體材料的藥物也是本發(fā)明的一個目的，以及同樣地，還有制備該藥物的方法，其包括將一種或多種這些化合物或其鹽以及，必要時，一種或者多種其它的治療上有價值的物質，與相容的藥用載體制成蓋侖(galenical)給藥劑型。
如前所述，按照本發(fā)明，本發(fā)明化合物可以作為治療活性劑，尤其是作為抗炎劑或移植手術后防止移植排斥的藥物應用。劑量在很寬的范圍內變化，當然會適合于每個具體病例的個體需要。通常，如果對成年人給藥.方便的每日劑量應該在約0.1mg/kg至約100mg/kg，優(yōu)選約0.5mg/kg至約5mg/kg。每日劑量可以單劑量或分幾次劑量給藥，當發(fā)現征兆時，可以超過上述的劑量上限。
最后，本發(fā)明的另一個目的在于本發(fā)明的化合物用于生產藥物的用途，所述藥物尤其用于治療或預防炎癥、免疫性疾病、腫瘤性疾病、支氣管肺病、皮膚病和心血管病，用于治療哮喘、中樞神經系統(tǒng)疾病或糖尿病并發(fā)癥，或用于預防移植手術之后的移植排斥。
本發(fā)明的化合物將用于，但不限于，治療人或其它哺乳動物由于該哺乳動物過量或不受控制地產生TNF或p38激酶而加劇或導致的任何疾病或病癥。因此，本發(fā)明提供一種治療細胞因子介導的疾病的方法，其包括施用有效干擾細胞因子量的本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明的化合物將用于，但不限于，治療受治者中的炎癥，和用作治療發(fā)熱的退熱劑。本發(fā)明的化合物將用于治療關節(jié)炎，包括但不限于，類風濕性關節(jié)炎、脊椎關節(jié)病、痛風性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和青少年關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、痛風性關節(jié)炎、以及其它關節(jié)炎病癥。該化合物將用于治療肺病或肺炎癥，包括成人呼吸窘迫綜合癥、肺肉瘤病、哮喘、矽肺病、和慢性肺炎性疾病。該化合物還用于治療病毒和細菌感染，包括膿毒病、膿毒性休克、革蘭氏陰性膿毒病、瘧疾、腦膜炎、惡病質繼發(fā)感染或惡性腫瘤、惡病質繼發(fā)獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)、AIDS、ARC(AIDS相關性復癥)、肺炎、和皰疹病毒。
所述化合物還用于治療骨吸收疾病，例如骨質疏松癥、內毒素性休克、中毒性休克綜合癥、再灌注損傷、自身免疫性疾病，包括移植物對宿主的反應和同種異體移植排斥、心血管病，包括動脈粥樣硬化癥、血栓形成、充血性心力衰竭、和心臟再灌注損傷、腎再灌注損傷、肝病和腎炎，以及感染引起的肌痛。
該化合物還用于治療阿爾茨海默氏病，流感、多發(fā)性硬化、癌癥、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚相關性疾病例如牛皮癬、濕疹、燒傷、皮炎、瘢痕形成、和疤痕組織形成。本發(fā)明的化合物還將用于治療胃腸道疾病例如炎性腸病、局限性回腸炎、胃炎、過敏性腸綜合癥、潰瘍性結腸炎。該化合物還將用于治療眼病，例如視網膜炎、視網膜病、葡萄膜炎、恐光癥、和對眼組織的急性損傷。本發(fā)明的化合物還將用于治療血管生成，包括瘤形成、轉移、眼科疾病例如角膜移植排斥、眼新血管形成、視網膜新血管形成，包括損傷或感染后的新血管形成、糖尿病性視網膜病、晶狀體后纖維增生和新生血管性青光眼；潰瘍性疾病，例如胃潰瘍；病理性，但非惡性病癥，例如血管瘤，包括新生兒血管瘤、鼻咽血管纖維瘤和骨無血管形成性壞死；糖尿病性腎病和心肌?。灰约皨D女生殖系統(tǒng)疾病例如子宮內膜異位。本發(fā)明的化合物還可以用于預防環(huán)加氧酶-2的產生。
除了可用于人類的治療，這些化合物還用于包括哺乳動物、囁齒動物等的寵物動物(companion animals)、外來動物和家畜的獸醫(yī)治療。更優(yōu)選的動物包括馬、狗、和貓。
本發(fā)明的化合物還用于共同治療，部分或完全代替其它常規(guī)抗炎藥，例如與甾類、環(huán)加氧酶-2抑制劑、NSAIDs、DMARDS、免疫抑制劑、5-脂氧合酶抑制劑、LTB4拮抗劑和LTA4水解酶抑制劑共同給藥。
本文中使用的術語“TNF介導的疾病”指TNF通過TNF本身的控制，或者通過TNF導致另一種單核因子(例如但不限于IL-1，IL-6或IL-8)被釋放而發(fā)揮作用的任何和所有疾病和病癥。例如，這樣一種病癥，其中IL-1是一種主要成分，其產生或作用響應于TNF而加劇或分泌，因此這種疾病被認為是TNF介導的疾病。
本文中使用的術語“p38介導的疾病”指通過p38本身的控制，或者通過p38導致另一種因子(例如但不限于IL-1，IL-6或IL-8)被釋放，而發(fā)揮作用的任何和所有疾病和病癥。例如，這樣一種病癥，其中IL-1是一種主要成分，其產生或作用響應于p38而加劇或分泌，因此這種疾病被認為是p38介導的疾病。
因為TNF-β與TNF-α(也稱為惡液質素)存在密切的結構同源性，并且因為它們均誘導類似的生物反應，并結合同樣的細胞受體，所以，TNF-α和TNF-β的合成都被本發(fā)明的化合物所抑制，因此被本發(fā)明總體稱為“TNF”，除非另有具體說明。
實施例實施例1
砜1 該實施例舉例說明了從4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯制備砜1。
步驟1.1制備4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯 將20g(86mmol)4-氯-2甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA)在250mL二氯甲烷中的溶液冷卻至0℃，用35mL(281mmol)33％甲基胺在乙醇中的溶液緩慢處理。攪拌30分鐘后，加入150mL水，并進行相分離。通過硫酸鎂干燥有機相并過濾。在減壓下蒸發(fā)濾液，得到19g(97％)4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯，其為白色固體。
步驟1.2制備4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醇 將氫化鋁鋰(9g，237mmol)在300mL無水四氫呋喃中攪拌，逐滴用34g(143mmol)4-甲基氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-羧酸乙酯在300mL無水四氫呋喃中的溶液處理，放置15分鐘。將混合物在冰中冷卻，逐滴用18mL水小心處理。逐滴加入氫氧化鈉溶液(36mL，2M)，然后加入48mL水。將得到的混懸液在室溫下攪拌17小時，然后過濾。濾渣用100mL乙酸乙酯洗滌兩次。合并濾液和洗滌液，減壓下蒸發(fā)。將殘留物混懸于200mL二氯甲烷/己烷(2∶1)中，過濾固體，干燥得到23.5g(86％)4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醇，其為黃色固體。
步驟1.3制備4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛 將4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醇(20g，108mmol)和1L二氯甲烷合并攪拌，用87g(1mol)二氧化錳處理。將得到的混懸液攪拌24小時，然后通過助濾劑過濾。濾渣用100mL二氯甲烷洗滌。在減壓下蒸發(fā)合并的濾液和洗滌液，得到15.8g(80％)4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛，其為白色固體。
步驟1.4 向3.3g(18.1mmol)4-甲基氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛、4.0g(20.1mmol)乙基-2-氯苯基乙酸酯在30mL NMP中的混合液中加入1.5g樹脂，結合1，3，4，6，7，8-六氫-2H-嘧啶并[1，2-a]嘧啶的聚合物。將反應混合物加熱至120℃。48小時后，將反應混合物冷卻到室溫，并過濾。用NMP和乙酸乙酯洗滌樹脂。用水稀釋濾液，并過濾。通過過濾分離產物，并用乙酸乙酯萃取濾液。將用5％HCl水溶液和水洗滌，干燥得到4.0g硫化物(質譜MH+＝318.Mpt.193.0-193.4)。
步驟1.5
將13.5g(42.5mmol)硫化物在氯仿中的溶液在冰浴中冷卻，用20.5g(91mmol)3-氯過苯甲酸處理。將混合物在室溫下攪拌16小時，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，并進行相分離。通過硫酸鎂干燥有機相，并過濾，減壓下濃縮。將產物在乙醚中攪拌，過濾，干燥得到13.1g砜1(質譜MH+＝350.MPt＝232.6-232.8)。
實施例2砜2 該實施例舉例說明了從4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯制備6-(2-氯苯基)-2-甲磺?；?吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-醇。
步驟2.1制備4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯 用50mL三乙胺和40mL氫氧化銨水溶液處理4-氯-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯(25.4g，106mmol，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA)在300mL四氫呋喃中的溶液。攪拌4小時后，加入300mL水并進行相分離。用300mL鹽水洗滌有機層，真空濃縮，溶解于二氯甲烷中，通過硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，得到16.5g(95％)4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸乙酯，其為白色固體。
步驟2.2制備4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醇 在1.5小時內，向氫化鋁鋰(175mL，175mmol)在二乙醚的0℃溶液中，逐滴加入4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-羧酸酯(34.7g，163mmol)在500mL無水四氫呋喃中的溶液。將反應混合液緩慢回溫到環(huán)境溫度，然后在用7mL水、7mL 2M氫氧化鈉溶液、隨后14mL水淬滅反應之前，冷卻到0℃。過濾得到的混懸液，濾渣用2×300mL乙酸乙酯洗滌。合并濾液，濃縮得到23.0g(83％)4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醇，其為白色固體。
步驟2.3制備4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛 用活化的氧化錳粉末(63.0g，725mmol)處理4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醇(21.8g，128mmol)在800mL二氯甲烷中的混懸液。將反應混合液攪拌18小時，然后通過硅藻土墊過濾。固體殘渣用熱二氯甲烷和甲醇溶液反復洗滌。合并濾液，濃縮得到17.5g(81％)4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛，其為白色固體。
步驟2.4制備6-(2-氯苯基)-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-醇 向4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛(21.7g，128mmol)和乙基-2-氯苯基乙酸酯(31.3g，158mmol)在250mL無水1-甲基-2-吡咯烷酮中的溶液中加入碳酸鉀(63.0g，491mmol)。將反應混合液在95℃攪拌16小時，通過TLC(20∶80，乙酸乙酯/己烷)監(jiān)測反應。再加入12.0g(60mmol)乙基-2-氯苯基乙酸酯，將反應混合物在95℃下再攪拌16小時。冷卻反應混合液，并過濾。用乙酸乙酯洗滌過濾得到的固體。合并濾液，用400mL水和300mL乙酸乙酯稀釋。進行相分離，用鹽水洗滌有機相，通過硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，直到形成黃色沉淀。用乙酸乙酯洗滌得到的固體，干燥產生少量產物。大多數產物保留在水層中，靜置后緩慢沉淀出來。過濾形成的混懸液，用水和乙酸乙酯洗滌。該過程重復6次，共產生31.9g(82％)6-(2-氯苯基)-2-甲磺?；?吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-醇。質譜M+＝303，mp＝234.5-235.3℃。
步驟2.5制備6-(2-氯苯基)-2-甲磺?；?吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-醇 向6-(2-氯苯基)-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-醇(25.2g，82.9mmol)的溶液中加入過硫酸氫鉀制劑TM(105g，171mmol)在200mL水中的稀漿。將反應混合物攪拌5小時，過濾，在真空下濃縮。過濾得到的稀漿，連續(xù)用水洗滌收集的固體4次，干燥得到23.2g(83％)6-(2-氯苯基)-2甲磺?；?吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-醇，其為淡黃色固體。質譜MH+＝336，mp＝215.1-221.1℃。
實施例3該實施例舉例說明了6-(2-氯苯基)-2-[(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-氨基]-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮的制備
將砜2(0.5g，1.49mmol)與1-甲基-4氨基甲基哌啶(0.57g，4.47mmol)合并。將該混合物加熱至110℃，攪拌2小時。將反應冷卻至室溫，殘渣溶解于甲醇/二氯甲烷中，通過10％甲醇/二氯甲烷作為洗脫劑的硅膠柱色譜純化。合并含有產物的級分，并濃縮。將得到的殘渣溶解于15mL 10％甲醇/二氯甲烷中，用1當量1M HCl(在乙醚中)處理。將該溶液濃縮成殘渣，在乙醚中研制。過濾固體，干燥得到0.25g 6-(2-氯苯基)-2-[(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-氨基]-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮鹽酸鹽。質譜MH+＝383，熔點＝213-220℃。
實施例4 步驟4.1制備4B 向化合物4A(4.704g，18.94mmol)在DMF(30mL)中的溶液加入碳酸鈉(2.2g，1.1eq)，隨后加入2-氯-N，N-二甲基乙酰胺(2.14mL，1.1eq)。在室溫下劇烈攪拌得到的混合物18小時。TLC顯示仍殘留有超過50％的起始原料，因此將反應另外加熱至80℃24小時。再一次TLC分析顯示仍殘留有一定量的起始原料，因此將混合物冷卻至室溫，然后再加入另外的2-氯-N，N-二甲基乙酰胺(0.58mL，0.3eq)。將反應再加熱至80℃4.5小時，由此進行TLC分析顯示只殘留有非常少量的起始原料。加入乙酸乙酯(150mL)和水(50mL)，分配混合物，進行相分離。水層進一步用乙酸乙酯(1×50mL)萃取，并用鹽水(3×35mL)洗滌合并的有機層。合并有機層，通過硫酸鎂干燥，過濾并濃縮，真空下干燥得到9.9g粗產物。通過硅膠快速色譜和梯度洗脫(純的二氯甲烷至10％甲醇(在二氯甲烷中))純化，得到化合物4B(3.91g)，其為粘稠漿狀物。MH+334。
步驟4.2制備4C將化合物4B置于乙醇(120mL)中，緩緩向溶液中鼓入氮氣5分鐘。然后加入10％鈀/活性炭(1.5g)，將混合物置于1大氣壓氫氣下，在室溫下攪拌18小時。通過TLC分析顯示完全反應，因此通過2.5cm硅藻土墊過濾混合物。濃縮濾液，并真空下干燥，得到化合物4C，4-氨基甲基-1-二甲基氨基羰基甲基-哌啶(2.15g)，其為油狀物。(M+H)+＝200。
步驟4.3制備4 將砜2(200mg，0.614mmol)、化合物4C(367mg，3eq)和N-甲基吡咯烷酮(0.3mL)在10mL燒瓶中混合，在攪拌下加熱至110℃。5分鐘后，該流體混合物變?yōu)楣腆w，TLC分析顯示反應完全。冷卻該反應混合物，加入甲醇(20mL)。粉碎沉淀，然后過濾得到白色粉末(235mg)。M.p.＝263.1-263.5℃，(M+H)+＝455。將該游離的胺(230mg)溶解于二氯甲烷(50mL)和甲醇(50mL)中，向該溶液中鼓入HCl氣體15分鐘。將容器的蓋擰緊，攪拌2小時。然后在減壓、50℃下除去溶劑，用二氯甲烷共蒸發(fā)兩次。在56℃、真空下干燥得到的鹽酸鹽，得到化合物4(276mg)，其為灰白色固體。M.p.＝211.8-212.8℃，(M+H)+＝455(游離堿)。
實施例5 步驟5.1制備5A 將化合物4A(4.632g，18.65mmol)溶解于二甲基甲酰胺(30mL)中。向該溶液中加入碳酸鈉(2.17g，1.1eq)和溴乙酸叔-丁基酯(3mL，1.1eq)。在室溫下劇烈攪拌得到的混合物18小時。TLC顯示只存在有非常少量的起始原料。向該溶液中加入乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)，分配混合物，進行相分離。水層進一步用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并有機層，用水(1×75mL)和鹽水(1×75mL)洗滌，通過硫酸鎂干燥，過濾，濃縮并真空下干燥得到6.5g粗產物。通過應用3％甲醇/二氯甲烷作為洗脫劑的硅膠快速柱色譜純化，得到5A(3.95g)，其為粘稠漿狀物。(M+H)+＝363。
步驟5.2制備5B將化合物5A(3.95g，10.9mmol)溶解于乙醇(125mL)中，緩緩向溶液中鼓入氮氣5分鐘。然后加入10％鈀/活性炭(1.5g)。將得到的混合物置于1大氣壓氫氣下，攪拌18小時。通過TLC分析顯示完全反應，通過2.5cm硅藻土墊過濾反應物。濃縮濾液，并真空下干燥，得到化合物5B，4-氮基甲基-1-叔-丁氧基羰基甲基-哌啶，其為無色油狀物(2.26g)。(M+H)+＝229。
步驟5.3制備化合物5 將砜2(200mg，0.614mmol)、化合物5B(420mg，3eq)和N-甲基吡咯烷酮在10mL燒瓶中混合，在攪拌下加熱至110℃。大約10分鐘后，該流體混合物變?yōu)榘牍腆w。將該混合物再攪拌20分鐘，TLC分析顯示反應完全。然后向反應混合物中加入15mL乙酸乙酯和100mL己烷。粉碎沉淀的產物，過濾得到白色粉末。將該粉末用60mL己烷洗滌，真空下干燥得到270mg游離胺叔-丁基酯，其為白色粉末。M.p.＝217.6-220.0℃，(M+H)+＝484。將該游離的胺溶解于二噁烷(100mL)中。向該溶液中鼓入HCl氣體15分鐘，得到均一的溶液。將容器的蓋擰緊，在室溫下攪拌18小時。過濾得到的沉淀，在56℃下干燥8小時，得到鹽酸鹽11(200mg)。M.p.＝235.3-237.9℃，(M+H)+＝428(游離胺羧酸)。
實施例6 步驟6.1制備6A
將化合物4A(4.889g，19.69mmol)溶解于二甲基甲酰胺(30mL)中，加入碳酸鈉(2.3g，1.1eq)，隨后加入2-溴乙酰胺(2.99g，1.1eq)。將得到的混合物在室溫下劇烈攪拌18小時。TLC分析顯示接近完全反應。加入乙酸乙酯(150mL)和水(50mL)，分配混合物，進行相分離。有機層用水(2×50mL)和鹽水(1×75mL)洗滌，通過硫酸鎂干燥，過濾，濃縮并真空下干燥得到固體。向殘渣中加入己烷(300mL)，粉碎固體，均勻混合。然后筆析上清液。用300mL己烷重復該過程。將殘渣在真空下干燥得到白色粉末6A(3.13g)。(M+H)+＝306。
步驟6.2制備6B 將化合物6A(3.1g，10.2mmol)溶解于乙醇(250mL)中，緩緩向溶液中鼓入氮氣5分鐘。然后加入10％鈀/活性炭(1.45g)混合物。將得到的混合物置于1大氣壓氫氣下，攪拌18小時。通過TLC分析顯示完全反應，通過2.5cm硅藻土墊過濾混合物。在40℃、減壓下濃縮濾液，真空下干燥得到化合物6B(1.77g)，其為粘稠白色固體。(M+H)+＝172。
步驟6.3制備化合物6
將砜2(400mg，1.23mmol)、化合物6B(630mg，3eq)和N-甲基吡咯烷酮(0.3mL)在25mL燒瓶中混合，在攪拌下加熱至110℃30分鐘。該流體混合物變?yōu)楣腆w，TLC分析顯示反應完全。將反應混合物用大約20mL甲醇稀釋，過濾白色固體，過濾白色固體，干燥得到410mg游離胺伯酰胺M.p.＝244.6-245.9℃，(M+H)+＝427。然后將該游離胺伯酰胺溶解于甲醇(100mL)中，向該溶液中鼓入HCl氣體10分鐘。將容器的蓋擰緊，在室溫下攪拌3天。在40℃、減壓下除去溶劑，然后向殘渣中加入10mL甲醇。向得到的溶液中加入四氫呋喃(100mL)，過濾形成的沉淀，收集得到化合物6，其為灰白色粉末(250mg)。M.p.＝220.0-221.1℃，(M+H)+＝442(游離胺，甲基酯)。
實施例7 在室溫下，向化合物9B(0.28g，2mmol)在乙腈(5mL)的溶液中加入TMSCN(0.8mL，3eq)。在攪拌下將得到的混合物加熱至80℃，直到混合物變?yōu)榫?。然后加入?(0.35g，1mmol)，將反應在80℃下攪拌40分鐘。用甲醇(10mL)淬滅反應，攪拌5分鐘。在50℃、減壓下濃縮后，向殘渣中加入乙酸乙酯(35mL)和水(25mL)。分離有機層，用水(2×25mL)和鹽水(1×25mL)洗滌，通過硫酸鎂干燥，過濾，濃縮并干燥得到408mg粗產物。通過制備性薄層色譜純化，得到胺，其為灰白色粉末(299mg)。(M+H)+＝373，M.P.＝91.4-93.2℃。將游離的胺溶解于乙酸乙酯(10mL)中，在室溫下攪拌，加入1M HCl在二乙醚中的溶液(1.2mL，1.5eq)。攪拌30分鐘后，在55℃、減壓下除去溶劑。在56℃、高真空下進一步濃縮6小時，得到化合物7，其為灰白色粉末(275mg)。(M+H)+＝373，M.P.＝178.0-181.5℃。
實施例8
該實施例舉例說明了制備6-(2-氯苯基)-2-[(1，1-二甲基-2-羥基乙基)氨基]-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮。
將0.350g(1.0mmol)砜1和0.445g(5.0mmol)的混合物在120℃下攪拌1小時，冷卻至室溫。通過柱色譜(5％甲醇/二氯甲烷)純化粗產物，得到所需的泡沫狀產物。將殘渣混懸于甲醇中，加入鹽酸(1.0M/Et2O，1當量)，攪拌20分鐘，并在減壓下濃縮。將殘渣在MeOH/Et2O的混合物中攪拌1小時，過濾產物得到白色固體。產量190mg。Mpt.228.6-228.9℃(鹽酸鹽)。
實施例9 在室溫下，向化合物9B(Chem.Pharm.Bull.45，1997，185-188)(0.28g，2mmol)在乙腈(4mL)的溶液中加入TMSCN(0.8mL，3eq)。將得到的混合物加熱至80℃，直到混合物變?yōu)榫?。然后向反應混合物中加?A(0.4g，1mmol)，在80℃下攪拌35分鐘。將反應混合物冷卻至室溫，加入15mL甲醇，攪拌5分鐘。將反應混合物在50℃、減壓下濃縮。殘渣用乙酸乙酯(35mL)和水(25mL)稀釋。分離有機相，用水(1×25mL)和鹽水(1×25mL)洗滌，通過硫酸鎂干燥，過濾并濃縮，得到445mg粗產物。通過應用50％乙酸乙酯/己烷作為洗脫劑的制備性薄層色譜純化，得到游離胺，其為灰白色粉末(242mg)。(M+H)+＝453，M.P.＝204.7-206.0℃。在室溫下，將游離的胺溶解于乙酸乙酯(15mL)中，加入1M HCl在二乙醚中的溶液(0.6mL，1.5eq)。將得到的混合物攪拌2小時。在50℃、減壓下除去溶劑，并在56℃、真空下干燥得到的固體，得到化合物9，其為灰白色粉末(219mg)。(M+H)+＝453，M.P.＝142.0-149.0℃。
實施例10 將砜1(250mg，0.71mmol)和2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(150mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到83mg所需產物10。質譜MH+＝374，mpt.200-210。
實施例11 將砜1(250mg，0.71mmol)和2-氨基-2-乙基-1，3-丙二醇(170mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到83mg所需產物11。質譜MH+＝388，mpt.98.1-102。
實施例12 將砜1(250mg，0.71mmol)和(S)-(+)-2-氨基-3-甲基-1-丁醇(147mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到90mg所需產物12。質譜MH+＝372，mpt.167.1-169.1℃。
實施例13 將砜1(250mg，0.71mmol)和(S)-(+)-2-氨基-1-丁醇(127mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到105mg所需產物13。質譜MH+＝358，mpt.170.5-172.1℃。
實施例14
將砜1(250mg，0.71mmol)和(S)-叔-亮氨醇(167mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到116mg所需產物14。質譜MH+＝386，mpt.171.2-174.0℃。
實施例15 將砜1(250mg，0.71mmol)和(R)-(-)-亮氨醇(leucinol)(167mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到178mg所需產物15。質譜MH+＝386，mpt.173.1-176.2℃。
實施例16 將砜1(250mg，0.71mmol)和(S)-(+)-2-氨基-1-丙醇(107mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到87mg所需產物16。質譜MH+＝344，mpt.131.1-132.2℃。
實施例17 將砜1(250mg，0.71mmol)和(S)-(+)-異亮氨醇(167mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到200mg所需產物17。質譜MH+＝386，mpt.140.1-143.6℃。
實施例18 將砜1(250mg，0.71mmol)和絲氨醇(130mg，1.4mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(0.25mL)中的混合物在80℃下攪拌12小時，然后冷卻至室溫。加入水(1mL)，將該混懸液攪拌30分鐘，過濾，用水洗滌沉淀，干燥，混懸于甲醇中。再次過濾混懸液，干燥得到179mg所需產物18。質譜MH+＝360，mpt.155.8-157.3℃。
實施例19該實施例舉例說明了制備6-(2-氯苯基)-8-甲基-2-甲硫基-8-氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(VI)的可供選擇的方法。
制備3，3-二乙氧基-2-甲?；驸淃}(II)在10℃下，向3，3-二乙氧基丙烷-腈(I，283.80g，1.98摩爾)和甲酸甲酯(148.80g，2.48摩爾)在無水THF(1.1L)的攪拌溶液中加入1.0M叔-丁醇鉀(在THF中)(2.2L，2.2摩爾)。在整個45分鐘的加入期間，將溫度維持在10-15℃。加入后，在環(huán)境溫度下攪拌得到的稀漿2小時。然后加入己烷(400mL)，再繼續(xù)攪拌20分鐘。過濾稀漿，用1/1己烷/THF洗滌濾餅，在60℃、真空烘箱中干燥過夜?；液稚勰┑漠a率為302.5g(73.0％)。
1H-NMR(CD3OD)顯示與所需結構II一致。
制備4-氨基-2-硫烷基嘧啶-5-甲醛(III)在回流下加熱硫脲(92.8g，1.22摩爾)在乙醇(90mL)中的稀漿，劇烈攪拌。在10分鐘內，分5次向該稀漿中加入3，3-二乙氧基-2-甲?；驸淃}II(222.20g，1.06摩爾)在25％甲醇鈉/甲醇(85.5mL，0.37mole)和乙醇(285mL)中的混懸液，同時維持回流條件(或者為了加入，可以將該稀漿加熱至50℃以得到均一溶液)。加入另一部分乙醇(150mL)以利于攪拌。加入后，粘稠的稀漿變?yōu)榱咙S色，在回流下保持另外1小時。然后冷卻混合物，在旋轉蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至接近干燥。將殘渣溶解于水(940mL)中。通過加入30％乙酸(280mL)從溶液中沉淀粗產物，然后通過應用燒結玻璃過濾漏斗進行過濾分離。用水(800mL)洗滌濾餅。通過在熱水(1L)中研制30分鐘進行純化，隨后冷卻并過濾，在真空爐中60℃下干燥過夜后，得到118.9g(72.3％)產物，其為亮黃色固體(后面的制備顯示該研制是非必須的)。HPLC得到純度為98.67％。1H-NMR(DMSO-d6)顯示與所需結構III一致。
制備4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛(IV)在20分鐘內、溫和冷卻下，向4-氨基-2-硫烷基-嘧啶-5-甲醛III(100.00g，644.4毫摩爾)和過325目篩的碳酸鉀(178.10g，1.29摩爾)在丙酮(1.5L)中的溶液中，逐滴加入碘甲烷(128.10g，902.2毫摩爾)。將該混合物在環(huán)境溫度下攪拌過周末。TLC顯示仍殘留有III，加入另一部分碘甲烷(8mL)，連續(xù)攪拌過夜。TLC仍顯示仍殘留有一些III，加入另一部分碘甲烷(8mL)，再連續(xù)攪拌24小時。HPLC顯示為95.9％S-烷基化產物和3.7％化合物III。將反應混合物通過旋轉蒸發(fā)儀氣提至接近干燥狀態(tài)。向殘渣中加入水(1L)，通過過濾器收集產物，用水(200mL)洗滌。將產物在真空爐中60℃下干燥過夜。產率為103.37g(94.8％)，HPLC顯示為95.8％IV和4.2％III。
制備6-(2-氯苯基)-2-甲硫基-8-氫吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(V)將IV(10.00g，59.1毫摩爾)、2-(2-氯苯基)乙酸乙酯(14.40g，71.8毫摩爾)、NMP(115mL)和過325目篩的碳酸鉀(29.00g，209.8毫摩爾)在90℃下加熱過夜。冷卻反應混合物，用水(800mL)稀釋。將得到的稀漿攪拌過夜，過濾分離產物(V)。用水洗滌濾餅，在真空爐中60℃下干燥過夜。分離產率為14.9g(83.0％)，其為暗棕色固體。HPLC分析顯示為98.3％純度。
制備6-(2-氯苯基)-8-甲基-2-甲硫基-8-氫吡啶并[2，3d]嘧啶-7-酮(VI)將V(0.25g，0.82mmole)、NMP(5mL)、碳酸鉀(0.11g，0.82mmole)和碘甲烷(0.14g，0.96mmole)的混合物在氮氣氛、環(huán)境溫度下攪拌過夜。加入水(15mL)，連續(xù)攪拌24小時。過濾稀漿，用水(10mL)洗滌濾餅。HPLC分析顯示為97.8％純度。
實施例20本實施例描述了測定體外抑制p-38(MAP)激酶的分析方案。
本發(fā)明的化合物在體外抑制p-38 MAP激酶的活性，通過測定p-38激酶將γ-33P-ATP中的γ-磷酸轉移給髓鞘堿性蛋白(MBP)而確定，使用對Ahn，N.G.；等J.Biol.Chem.Vol.266(7)，4220-4227，(1991)中介紹的方法進行微小改進的方法。
重組p38 MAP激酶的磷酸化型用SEK-1和MEKK在大腸桿菌中表達，然后用鎳柱通過親合色譜純化。
磷酸化的p38 MAP激酶在激酶緩沖液(20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸，pH 7.2，25mM β-磷酸甘油，5mM乙二醇-雙(β-氨基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸，1mM釩酸鈉，1mM二硫蘇糖醇，40mM氯化鎂)中稀釋。加入溶解于DMSO的實驗化合物或僅DMSO(對照)，樣品在30℃保溫10分鐘。通過加入含有MBP和γ-33P-ATP的底物混合物引發(fā)激酶反應。在30℃下繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘后，加入0.75％磷酸終止該反應。利用磷酸纖維素膜(Millipore，Bedford，MA)從殘余γ-33P-ATP分離出磷酸化MBP，并且利用閃爍計數器定量測定(Packard，Meriden，CT)。
本發(fā)明的化合物在本試驗中具有活性。一些本發(fā)明化合物的p-38抑制活性(表示為IC50，導致被檢測的p-38酶50％抑制時的濃度)為

實施例21本實施例描述了評價在THP1細胞中對LPS誘導的TNF-α的產生的抑制作用的體外分析實驗。
利用Blifeld，等Transplantation，51(2)，498-503(1991)所述方法的小改進方法，測定本發(fā)明的化合物抑制TNF-α釋放的能力。
(a)TNF生物合成的誘導使THP-1細胞混懸于培養(yǎng)基[RPMI(Gibco-BRL，Gailthersburg，MD)含有15％胎牛血清，0.02mM 2-巰基乙醇]，達到2.5×106細胞/ml的濃度，隨后鋪板在96孔平板中(各孔中含0.2ml等份試樣)。將試驗化合物溶于DMSO，此后用培養(yǎng)基稀釋，使DMSO的終濃度為5％。向各孔中加入25μl等份的試驗溶液或只含有DMSO(對照)的培養(yǎng)基。細胞在37℃下培養(yǎng)30分鐘。向孔中加入LPS(Sigma，St.Louis，MO)達到終濃度為0.5μg/ml，并且令細胞繼續(xù)培養(yǎng)2小時。培養(yǎng)期結束后，收集培養(yǎng)上清液，利用下面所述的ELISA試驗測定TNF-α存在的量。
(b)ELISA試驗通過Reimund，J.M.等GUT.Vol.39(5)，684-689(1996)所述的特異性捕捉ELISA試驗、利用兩種抗TNF-α抗體(2TNF-H12和2TNF-H34)測定人TNF-α存在的量。
聚苯乙烯96孔平板用50μl/孔的存在于PBS中的抗體2TNF-H12(10μg/ml)包被，并且在4℃的潮濕培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。平板用PBS洗滌，進而用存在于PBS中的5％脫脂奶粉室溫下封被1小時，后用存在于PBS中的0.1％BSA(牛血清白蛋白)洗滌。
TNF標準品是由人重組TNF-α(R & D Systems，Minneapolis，MN)的儲備溶液制備。標準品在該試驗中的濃度從10ng/ml開始，隨后進行6次半對數連續(xù)稀釋。
25μl等份的上述培養(yǎng)上清液或TNF標準品或僅僅是培養(yǎng)基(對照)與25μl等份的生物素化單克隆抗體2TNF-H34(2μg/ml，存在于含0.1％BSA的PBS中)混合，此后加入到各孔中。室溫下培養(yǎng)樣本2小時同時輕輕振搖，隨后用含0.1％BSA的PBS洗滌3次。向各孔中加入50μl的過氧化酶-鏈霉抗生物素(Zymed，S.San Francisco，CA)溶液，其中含有在PBS中的0.416μg/ml的過氧化物酶-鏈霉抗生物素和0.1％BSA。室溫下樣本繼續(xù)培養(yǎng)1小時，隨后用含0.1％BSA的PBS洗滌4次。向各孔中加入50μl的O-苯二胺溶液(1ug/ml O-苯二胺和0.03％過氧化氫，存在于0.2M檸檬酸鹽緩沖液pH 4.5中)，并且室溫下將樣本在黑暗條件下培養(yǎng)30分鐘。分別讀取樣品和參照物在450nm和650nm下的光密度。利用在450nm下的光密度對所用濃度的圖測定TNF-α的水平。
IC50值被定義為對應于在450nm的吸光度的半-最大值降低的試驗化合物的濃度。
實施例22該實施例描述了評價小鼠(或大鼠)中LPS-誘導的TNF-α產生的抑制作用的體內分析試驗。
利用Zanetti.等J.Immunol.，148，1890，(1992)和Sekut等J.Lab.Clin.Med.，124，813，(1994)所述方法的微小改進方法，測定本發(fā)明的化合物體內抑制TNF-α釋放的能力。
體重18-21g的雌性BALB/c小鼠(ChaRles River，Hollister，CA)適應環(huán)境1周。包括8只小鼠的各組口服施用混懸于或溶解于含有0.9％氯化鈉、0.5％羧甲基纖維素鈉、0.4％吐溫80、0.9％芐醇(CMC載體)的水性載體中的實驗化合物或者只施用載體(對照組)。30分鐘后，給小鼠腹膜內注射20μg LPS(Sigma，St.Louis，MO)。1.5小時后，通過吸入CO2處死小鼠，并通過心穿刺術采集血液。在15,600Xg下離心5分鐘使血液沉降，把血清轉移到干凈的試管中且在-20℃下冷凍，直至通過ELISA試驗按照制造商的方案測定TNF-αα(Biosource International，Camarillo，CA，USA)。
權利要求
1.一種用于制備下式的嘧啶的方法 包括(a)在足以制備縮合的產物的條件下，在縮合堿存在下將式NC-CH2-CH(ORa)2的縮醛與式HCO2R的烷基甲酸酯接觸；和(b)在足以制備式II-c的所述嘧啶的條件下，在環(huán)化堿存在下將所述縮合產物與硫脲接觸，其中每個R和Ra獨立地為烷基。
2.按照權利要求1的方法，其中所述縮合堿為叔-丁醇鹽。
3.按照權利要求1的方法，其中所述環(huán)化堿為醇鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了式(I)的化合物，其前藥或藥用鹽，其中R
文檔編號A61K31/519GK1721412SQ200510083529
公開日2006年1月18日 申請日期2001年8月22日 優(yōu)先權日2000年8月31日
發(fā)明者溫貝托·巴托洛梅·阿塞諾, 陳健·吉弗瑞, 詹姆斯·帕特里克·杜恩, 大衛(wèi)·邁克爾·戈爾茨坦, 朱莉·安妮·利姆 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司