專利名稱：磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒、其制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物殘留檢測試劑盒，尤其涉及獸藥磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒、及其制備方法和檢測方法，屬生物化學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磺胺六甲嘧啶(SMM)具有很強的抗菌和原蟲感染的作用，被廣泛地用于畜禽疾病的治療和預防，并由于其對生長的促進作用又作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中被廣泛地應用。所以它是殘留問題最嚴重的獸藥之一，由其導致的過敏、耐藥菌株等問題己引起廣泛關(guān)注。因此，從2005年起，農(nóng)業(yè)部把畜產(chǎn)品中磺胺類藥物的殘留情況作為繼鹽酸克倫特羅之后的又一個重點予以監(jiān)控。當人們長期食入含有此類藥物的動物性食品時，低濃度的藥物殘留通過食物鏈向人類傳播，誘導人類致病菌對其耐藥性的增強，產(chǎn)生很多不良反應。包括 ①泌尿系統(tǒng)損害 ’②過敏反應；③造血系統(tǒng)損害(主要發(fā)生溶血)；④中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應；⑤ 此藥可通過母體胎盤進入胎兒體內(nèi)，造成新生兒黃疸。因此，磺胺類獸藥在動物性食品中的殘留問題已引起重視。我國以及美國、歐盟等國家規(guī)定了動物性食品中總磺胺以及單個磺胺的最高殘留限量為0. lmg/kg，而日本規(guī)定不得檢出。國內(nèi)外常用的對SMM檢測方法有HPLC法和ELISA試劑盒，HPLC法費用高，前處理過程繁瑣，不適應于大量樣品的快速檢測；ELISA試劑盒靈敏度相對不夠高，檢測限較低 (一般到10_9g/ml)，不能滿足某些低濃度物質(zhì)含量測定的要求。因此，亟需一種高靈敏度、快速，且能準確可靠地進行定量分析的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于設(shè)計一種高靈敏度、能快速且準確可靠地進行定量分析的新型磺胺六甲嘧啶檢測試劑盒；另一目的在于提供其制備方法；又一目的在于提供其檢測方法。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法檢測磺胺六甲嘧啶的殘留量，設(shè)計了磺胺六甲嘧啶增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。(一)該檢測試劑盒包括不透明微孔板和檢測試劑，其特征在于，檢測試劑由HRP-SMM酶標抗原、SMM標準品溶液梯度溶液、HRP-SMM樣品稀釋液、化學發(fā)光底液A、 化學發(fā)光底液B、洗滌液組成，分別獨立盛裝于試劑瓶中；所述微孔板各孔包被濃度為2
^gZml磺胺六甲氧嘧啶的包被抗體；所述HRP-SMM酶標抗原是辣根過氧化物酶和磺胺六
甲氧嘧啶偶聯(lián)物；所述SMM標準品溶液梯度溶液分別是0.6pg/ml、lpg/ml、6pg/ml、60pg/ mlU00pg/ml ；所述HRP-SMM樣品稀釋液為0. 05mol/L碳酸鹽(CB)緩沖液；化學發(fā)光底液A是2X Kr5 1 X l(T3mol/L魯米諾溶液、5X 1(Γ5 1 X IO"3 mol/L對羥基苯酚溶液和 pH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl的混合溶液；化學發(fā)光底液B是2X 10_5 1 X 10_3 mol/L 過氧化氫溶液；洗滌液是含有質(zhì)量百分比0. 05%吐溫-20的pH7. 2 0. Olmol/L磷酸鹽(PBS) 溶液。所述碳酸鹽緩沖液為碳酸鈉和碳酸氫鈉混合液；磷酸鹽溶液為磷酸氫二鈉溶液、磷酸二氫鈉溶液混合液。
(二)磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒的制備方法通過如下方法實現(xiàn) (1)配制HRP-SMM樣品稀釋液、洗滌液 HRP-SMM樣品稀釋液的配制 碳酸鈉1. 59g
碳酸氫鈉2. 93g
加純水至1000ml，過濾除菌，4°C保存。洗滌液的配制
吐溫-20500 μ
加 0. Olmol/LPBS (ρΗ7· 2)至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。0. Olmol/LPBS (ρΗ7· 2)配方
0. 2mol/L 磷酸氫二鈉溶液(取 Na2HPO4 .Iffl2O 71. 6g，加純水至 1000ml) 0. 2mol/L 磷酸二氫鈉溶液(取 NaH2PO4. 2H20 35. 6g，加純水至 1000ml) 取 0. 2moVLNa2HPO4 溶液 80ml, 0. 2mol/L NaH2PO4 溶液 20ml 和 17g NaCl，加純水至 2000ml，過濾除菌，4°C保存。(2)制備包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗體的微孔板
不透明微孔板中加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗體，用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋，每
孔加200 μ 于檢測板孔內(nèi)，使包被多克隆抗體的濃度為2 μ§/ηι1 ,置4°c過夜；棄去包
被液，用上述配制的洗滌液洗滌各孔，在吸水紙上拍干；隨之每孔加入封閉液，隨后棄去封閉液拍干，室溫下干燥；干燥后的酶標板，迅速真空封口包裝，將封裝好的板存于2-8°C ； (3)、標準品的制備
將磺胺六甲嘧啶用PH9. (Γ9. 5的磷酸鹽溶液稀釋成五個梯度濃度，分別是0. 6pg/ml、 lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、lOOpg/ml，分裝于瓶中；
(3)、化學發(fā)光底物的制備
將一定量的魯米諾溶液、對羥基苯酚溶液和PH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl混合制得化學發(fā)光底液A ；配制一定量過氧化氫溶液為化學發(fā)光底液B，分裝于瓶中；
(4)HRP-SMM酶標抗原的制備
取磺胺六甲氧嘧啶溶于二氧六環(huán)中，此溶液為I液；取辣根過氧化物溶于PH7. 2磷酸鹽緩沖溶液中，此溶液為Π液；置I液于磁力攪拌器上攪動，加入II液，然后加入戊二醛，避光攪拌反應，得偶聯(lián)物。最后把偶聯(lián)物裝入透析袋中，在4°C下用pH7. 2磷酸鹽緩沖溶液透析即可。(三)本發(fā)明所述磺胺六甲嘧啶增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的應用，其檢測程序為
(1)平衡取樣品及其檢測試劑盒內(nèi)的試劑，于If 25°C平衡30士5min。(2)加樣和酶標抗原取微孔板，預設(shè)一個空白對照孔，空白對照孔加入50 μ 樣
品稀釋液，其余每孔加入50 μ 待測樣品；然后微孔板上所有孔均加上100 μ1 HRP-SMM 酶標抗原，振蕩5分鐘，37°C孵育1小時。
(3)洗板甩去板孔中的液體，用洗滌液沖洗，在吸水紙上拍干。(4)加發(fā)光底物每孔中先后加入化學發(fā)光底液A、化學發(fā)光底液B各50 μ ，避光震蕩2min。(5)測定在化學發(fā)光儀上測出各孔相對發(fā)光值(RLU)。其檢測方法原理將待測樣品中的磺胺六甲氧嘧啶與一定量的標記有辣根過氧化物酶的磺胺六甲氧嘧啶(SMM)競爭性地與固相磺胺六甲氧嘧啶抗體進行結(jié)合，分離未結(jié)合的標記抗原，利用魯米諾體系作為化學發(fā)光底物，測定標記抗原與抗體復合物化學發(fā)光強度，經(jīng)相應的數(shù)學函數(shù)計算(參見文獻化學發(fā)光基礎(chǔ)理論與應用[M].化學工業(yè)出版社， 2004，7 :Γ5)得出待測抗原(SMM)的含量，從而快速地測定食品中的磺胺六甲氧嘧啶殘留量。本發(fā)明用于牛奶、雞蛋、肉及其制品中磺胺六甲氧嘧啶含量的檢測。本發(fā)明創(chuàng)新點在于將增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法應用到獸藥磺胺六甲氧嘧啶殘留檢測中，將抗原抗體特異性免疫反應、酶的高效催化和高靈敏的化學發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合，用特定的酶標記抗原或抗體，對待測物通過增強發(fā)光底液進行定性或定量測定。這種方法的最小檢出值可達10_18 10_15mol，較常規(guī)的酶免疫分析的靈敏度提高3 5個數(shù)量級，對實際樣品的測定前處理簡單，且其檢測快速，更加適用于低濃度大批量物質(zhì)的分析。將本試劑設(shè)計成檢測盒方法新穎，便于現(xiàn)場大批量快速檢驗，費用低，同時具有操作簡單、高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，靈敏性達0.0927pg/ml，，精密度小于15%，與多種抗生素交叉反應率均小于洲。對檢測獸藥磺胺六甲氧嘧啶的殘留具有較好的檢測效果，便于食品安全監(jiān)測，保證人們食用安全，具有很好的實際應用和推廣價值。


圖1 HRP、S匪及偶聯(lián)物HRP-SMM的紫外光譜圖； 圖2 HRP、SMM及偶聯(lián)物HRP-SMM的紅外光譜圖。
具體實施例方式為對本發(fā)明進行更好地說明，詳舉實例如下 實施例1磺胺六甲嘧啶增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
本發(fā)明磺胺六甲嘧啶檢測試劑盒包括抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗體包被96孔微孔板1 塊，HRP-SMM酶標抗原1瓶、SMM標準品溶液梯度溶液5瓶(濃度分別為0. 6pg/ml、lpg/ml、 6pg/ml、60pg/ml、100pg/ml)、HRP-SMM 樣品稀釋液(0. 05mol/L 碳酸鹽(CB)緩沖液)、化學發(fā)光底液A、化學發(fā)光底液B、洗滌液各一瓶(含0. 05%吐溫-20的pH7. 2 0. Olmol/L磷酸鹽 (PBS)溶液)及使用說明書一份?；瘜W發(fā)光底液A是2X10_5 1X10_3 mol/L魯米諾溶液、 5 X IO"5 1 X 10_3 mol/L對羥基苯酚溶液和pH8. 0的0. lmol/L Tris — HCl的混合溶液； 化學發(fā)光底液B是2X 10_5 1 X 10_3mol/L過氧化氫溶液。實施例2磺胺六甲嘧啶增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備 (1) HRP-SMM樣品稀釋液、洗滌液的配制
A、配制HRP-SMM樣品稀釋液 碳酸鈉1. 59g碳酸氫鈉加純水至1000ml，
2. 93g
過濾除菌，4°C保存。 B、配制洗滌液
吐溫-20
500 μ
加 0. 01mol/L PBS (ρΗ7· 2)至 1000ml，過濾除菌，4°C保存。0. 01mol/L PBS (ρΗ7· 2)配方
0. 2mol/L 磷酸氫二鈉溶液(取 Na2HPO4. 12H20 71. 6g，加純水至 1000ml) 0. 2mol/L 磷酸二氫鈉溶液(取 NaH2PO4. 2H20 35. 6g，加純水至 1000ml) 取 0. 2mol/L Na2HPO4 溶液 80ml,0. 2mol/L NaH2PO4 溶液 20ml 和 17g NaCl，加純水至 2000ml，過濾除菌，4°C保存。(2)制備包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗體的微孔板
微孔板選96孔乳白色不透明聚苯乙烯板，加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗體，用pH9. 6
的碳酸鹽緩沖液稀釋，每孔加200 μ 于檢測板孔內(nèi)，使包被多克隆抗體的最佳濃度為 2 Mg^ll，置4°C過夜(18小時)。棄去包被液，用洗滌液充分洗滌各孔，在吸水紙上拍干。
隨之每孔加入封閉液，每孔300 μ ，37°C封閉2小時，隨后棄去封閉液拍干，室溫下干燥4
小時。干燥后的酶標板，迅速真空封口包裝，將封裝好的板存于2-8°C。(3)、標準品的制備
將磺胺六甲嘧啶(sigma，純度99. 5%)用PBS (ρΗ9. (Γ9. 5)稀釋成五個梯度濃度，分別是0. 6pg/ml、lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、lOOpg/ml，分裝于瓶中。(4)化學發(fā)光底物的制備
化學發(fā)光底物由化學光底液A和化學光底液B組成化學發(fā)光底液A是2X 10_5 lX10_3mol/L魯米諾溶液(化學名稱為3-氨基鄰苯二甲酰胼)、5X10_5 1X10_3 mol/L對羥基苯酚溶液和PH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl的混合溶液；化學發(fā)光底液B是2 X 10_5 lX10_3mol/L過氧化氫溶液。(5)、HRP-SMM酶標抗原的制備
取磺胺六甲氧嘧啶IOmg溶于ImL 二氧六環(huán)中，此溶液為I液；取5mg辣根過氧化物溶
于500 μ 1ρΗ7. 2磷酸鹽緩沖溶液中，此溶液為II液；置I液于磁力攪拌器上緩慢攪動，
與此同時II液緩慢加入，然后向溶液中緩慢加入200 μ 25%的戊二醛，避光攪拌反應4h。
4h后把偶聯(lián)物裝入事先處理好的透析袋中，在4°C下用pH7. 2磷酸鹽緩沖透析三天即可使用。本發(fā)明中所述多克隆磺胺六甲氧嘧啶抗體購于廣州美津生物技術(shù)有限公司。實施例3本發(fā)明試劑盒的應用及測定操作程序
(1)平衡從冷藏環(huán)境中取出樣品及試劑盒，于If25°C平衡30士5min
(2)加樣和酶標抗原取96孔化學發(fā)光微孔板，預設(shè)一個空白對照孔，空白對照孔加入
50 μ HRP-SMM樣品稀釋液，其余每孔加入50 μ 待測樣品；然后微孔板上所有孔均加上100 μ丨HRP-SMM酶標抗原，振蕩5分鐘，37°C孵育1小時。(3)洗板甩去板孔中的液體，用洗滌液至少沖洗4次，在吸水紙上拍干。(4)加發(fā)光底物每孔中先后加入化學發(fā)光底液A、化學發(fā)光底液B各50 μ ，避光振蕩2分鐘。(5)測定在化學發(fā)光儀上測出各孔相對發(fā)光值(RLU)。實施例4本發(fā)明試劑盒的特異性、靈敏度、精密度檢測
(1)選取磺胺類藥物磺胺六甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶及幾種常用抗菌藥物慶大霉素、氯霉素、青霉素、四環(huán)素、阿莫西林、恩諾沙星、環(huán)丙沙星，分別使用樣品稀釋液配制系列濃度的各種藥物溶液，加入各藥物系列濃度按照建立化學發(fā)光酶免疫分析標準曲線的操作步驟得到相應的針對磺胺六甲氧嘧啶多抗抑制曲線，計算得到各藥物針對抗體的IC5tlt5而SMM的IC5tl與各藥物的IC5tl比值的百分數(shù)即為交叉反應率。交叉反應性實驗其實是考察增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法檢測磺胺六甲嘧啶的特異性，即此試劑盒的特異性。表1特異性實驗結(jié)果
藥物
磺胺六甲氧嘧啶橫胺二甲氧嘧啶磺胺對甲氧嘧啶阿莫西林慶大霉素環(huán)丙沙星恩諾沙星四環(huán)素氣霧素青霧素
IC50 (ng/mL)
80
80
>10.
>10'
>10·
>10'
>10'
>10'
.4
4
4
>10辟
CR (%) 100 2.0 2.0 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016
由上表格數(shù)據(jù)結(jié)果可知，抗體針對同種磺胺類藥物的的交叉反應率均小于等于洲，且與不同類藥物基本無交叉反應。說明此試劑盒特異性良好。
(2)精密性實驗 結(jié)果統(tǒng)計見表2
表2精密度實驗結(jié)果
8
權(quán)利要求
1.一種磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒，包括不透明微孔板、檢測試劑，其特征在于，檢測試劑由如下組份組成磺胺六甲氧嘧啶系列標準液、辣根過氧化物酶HRP-磺胺六甲氧嘧啶 SMM酶標抗原、HRP-SMM樣品稀釋液、化學發(fā)光底液A、化學發(fā)光底液B和洗滌液組成，分別獨立盛裝于試劑瓶中；化學發(fā)光底液A為2X 10_5 1 X 10_3mol/L魯米諾溶液、5X 10_5 IX 10_3mOl/L對羥基苯酚溶液和pH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl的混合溶液；化學發(fā)光底液B為2X 10_5 1 X 10_3mol/L過氧化氫溶液；所述不透明微孔板各孔包被有濃度為2Mg/rnl磺胺六甲氧嘧啶的包被抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒，其特征在于，所述磺胺六甲氧嘧啶系列標準液為0. 6pg/ml、lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、100pg/ml ；所述 HRP-SMM 樣品稀釋液為0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液；洗滌液為含有質(zhì)量百分比0. 05%吐溫-20的pH7. 2 0. Olmol/ L磷酸鹽溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒，其特征在于，所述碳酸鹽緩沖液為碳酸鈉和碳酸氫鈉混合液；磷酸鹽溶液為磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液混合液。
4.制備權(quán)利要求1-3任何一種所述的磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒的方法，其特征在于，通過如下方法實現(xiàn)(1)HRP-SMM樣品稀釋液、洗滌液的配制稱取碳酸鈉、碳酸氫鈉，將兩者混合，加純水溶解，制成0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液，過濾除菌，4°C保存作為HRP-SMM樣品稀釋液；稱取吐溫-20、取0. 2mol/L Na2HPO4溶液， 0. 2mol/L NaH2PO4溶液和NaCl，加純水溶解，制成含有質(zhì)量百分比0. 05%吐溫-20的pH7. 2 0. Olmol/L磷酸鹽溶液，過濾除菌，4°C保存作為洗滌液；(2)制備包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗體的微孔板不透明微孔板中加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗體，用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋，每孔加200 μ 于檢測板孔內(nèi)，使包被多克隆抗體的濃度為2 _LLg/ml，置4°C過夜；棄去包被液，用上述配制的洗滌液洗滌各孔，在吸水紙上拍干；隨之每孔加入封閉液，隨后棄去封閉液拍干，室溫下干燥；干燥后的酶標板，迅速真空封口包裝，將封裝好的板存于2-8°C ；(3)、標準品的制備將磺胺六甲嘧啶用PH9. 0-9. 5的磷酸鹽溶液稀釋成五個梯度濃度，分別是0. 6pg/ml、 lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、lOOpg/ml，分裝于瓶中；(4)、化學發(fā)光底物的制備將2 XUT5 lX10_、ol/L魯米諾溶液、5X10_5 1 X l(T3mol/L對羥基苯酚溶液和 ρΗ8· 0的0. lmol/L Tris — HCl混合制得化學發(fā)光底液A ；配制2X 10_5 1 X 10_3mol/L過氧化氫溶液為化學發(fā)光底液B ；(5)HRP-SMM酶標抗原的制備取磺胺六甲氧嘧啶溶于二氧六環(huán)中，此溶液為I液；取辣根過氧化物溶于PH7. 2磷酸鹽緩沖溶液中，此溶液為Π液；置I液于磁力攪拌器上攪動，加入II液，然后加入戊二醛，避光攪拌反應生成偶聯(lián)物，最后把偶聯(lián)物裝入透析袋中，在4°C下用pH7. 2磷酸鹽緩沖溶液透析即可。
5.如權(quán)利要求1-3任何一種所述的磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒的應用，其特征在于，通過如下步驟檢測(1)平衡從冷藏環(huán)境中取出樣品及試劑，于If25°C平衡30士5min ；(2)加樣和酶標抗原取微孔板，預設(shè)一個空白對照孔，空白對照孔加入50μ 樣品稀釋液，其余每孔加入50 μ1待測樣品；然后微孔板上所有孔均加上100 μ HRP-SMM酶標抗原，振蕩5分鐘，37°C孵育1小時；(3)洗板甩去板孔中的液體，用洗滌液沖洗，在吸水紙上拍干；(4)加發(fā)光底物每孔先后加入化學發(fā)光底液A、化學發(fā)光底液B各50μ ，避光振蕩 2分鐘；(5)測定在化學發(fā)光儀上測出各孔相對發(fā)光值。
全文摘要
本發(fā)明公開了磺胺六甲氧嘧啶檢測試劑盒、其制備方法及其應用，屬生物化學領(lǐng)域。該檢測試劑盒包括微孔板和檢測試劑，其中所述微孔板為不透明塑料板且其各孔包被有濃度為2μg/mL磺胺六甲氧嘧啶的包被抗體；所述檢測試劑由酶標抗原(辣根過氧化物-磺胺六甲氧嘧啶HRP-SMM)、磺胺六甲氧嘧啶標準品梯度溶液、酶標抗原樣品稀釋液、化學發(fā)光底液A、化學發(fā)光底液B、洗滌液組成。本發(fā)明用于牛奶、雞蛋、肉及其制品中磺胺六甲氧嘧啶含量的檢測，本試劑盒設(shè)計方法新穎，便于現(xiàn)場大批量快速檢驗、費用低，同時具有操作簡單、高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，作為檢測獸藥磺胺六甲氧嘧啶的殘留具有較好的的應用前景。
文檔編號G01N33/543GK102175856SQ20111002235
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者吳擁軍, 屈凌波, 石杰 申請人:鄭州大學