專利名稱：：檢測三甲氧芐胺嘧啶藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測三甲氧芐胺嘧啶藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適于蜂蜜中三甲氧芐胺嘧啶藥物殘留的檢測。
背景技術(shù)：
：三甲氧節(jié)胺嘧啶(trimethoprim,TMP)是一種抗菌劑，結(jié)構(gòu)式見圖l，抗菌范圍與磺胺藥相似，與磺胺藥物聯(lián)合使用時(shí)，可增強(qiáng)療效幾倍到幾十倍。因此是種常用的磺胺增效劑，其對多種革蘭陽性和陰性細(xì)菌有效。但在動(dòng)物性食品中為限用藥物。三甲氧芐胺嘧啶殘留量的常規(guī)檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過程以及對檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種用于三甲氧芐胺嘧啶檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作簡單適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選。本發(fā)明試劑盒，它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記半抗原、酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體)；(3)三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有)；(4)三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液;(7)濃縮洗滌液；(8)復(fù)溶液。本發(fā)明所提供的檢測三甲氧芐胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體工作液及預(yù)包被包被原的酶標(biāo)板和酶標(biāo)記物工作液；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記的抗抗體，酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶半抗原或酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。所述三甲氧芐胺嘧啶半抗原是三甲氧芐胺嘧啶通過琥珀酸酐法得到的。所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣根過氧化物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶半抗原是采用混合酸酐或碳化二亞胺法將標(biāo)記酶與三甲氧芐胺嘧啶半抗原偶聯(lián)得到的；酶標(biāo)記特異性抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與特異性抗體偶聯(lián)得到的，辣根過氧化物酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過長期的勞動(dòng)創(chuàng)造將過碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使其省時(shí)、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。所述三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體可為三甲氧芐胺嘧啶單克隆抗體或三甲氧芐胺嘧啶多克隆抗體；它們均是用三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白采用混合酸酐法或碳化二亞胺法得到的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述三甲氧芐胺嘧啶多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述三甲氧芐胺嘧啶單克隆抗體優(yōu)選為三甲氧芐胺嘧啶鼠單克隆抗體，所述三甲氧芐胺嘧啶多克隆抗體優(yōu)選為三甲氧芐胺嘧啶兔多克隆抗體。所述三甲氧芐胺嘧啶單克隆抗體優(yōu)選為三甲氧芐胺嘧啶的單克隆雜交瘤細(xì)胞株D-1-3CGMCCNo.3358分泌的單克隆抗體。所述三甲氧芐胺嘧啶單克隆雜交瘤細(xì)胞株D-1-3CGMCCNo.3358(分類命名對三甲氧芐胺嘧啶藥物的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株)已于2009年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)。以上抗體均可以用三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白和纖維蛋白原等常用載體蛋白；所述三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將三甲氧芐胺嘧啶半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到。為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、復(fù)溶液。所述濃縮洗滌液優(yōu)選為0.8-1.2%吐溫-20和0.05-0.01%。疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為12mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮復(fù)溶液液優(yōu)選為含有5_10%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH值為7.0，0.lmol/L磷酸鹽緩沖液，所用封閉液為PH值為7.2，含有0.03-0.05%。硫柳汞防腐劑，8-12%卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.150.25iig/ml，每孔加入100ii1，37t:溫育2h或fC過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150200iU封閉液，37t:溫育12h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明中抗原的合成過程為1.半抗原的合成將三甲氧芐胺嘧啶采用琥珀酸酐法得到，技術(shù)路線如圖2。2.三甲氧芐胺嘧啶抗體的制備將三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。免疫原的具體制備方法三甲氧芐胺嘧啶是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此將三甲氧芐胺嘧啶通過琥珀酸酐法合成三甲氧芐胺嘧啶半抗原，這樣突出了三甲氧芐胺嘧啶分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的三甲氧芐胺嘧啶抗體對三甲氧芐胺嘧啶的特異性很高。三甲氧芐胺嘧啶鼠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多抗血清后，取出脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。三甲氧芐胺嘧啶兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測定血清抗體效價(jià)得到多克隆抗體。本發(fā)明抗抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。本發(fā)明所述試劑盒中三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0i!g/L、2lig/L，6lig/L，18lig/L，54lig/L，162ug/L。本發(fā)明的檢測原理為當(dāng)在微孔條上預(yù)包被三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體溶液，樣本中殘留的三甲氧芐胺嘧啶藥物與酶標(biāo)板上包被的三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原競爭三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與三甲氧芐胺嘧啶藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三甲氧芐胺嘧啶的殘留量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中三甲氧芐胺嘧啶殘留量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶半抗原溶液，樣本中殘留的三甲氧芐胺嘧啶藥物與酶標(biāo)記抗原競爭包被在酶標(biāo)板上的三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與三甲氧芐胺嘧啶藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三甲氧芐胺嘧啶的殘留含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中三甲氧芐胺嘧啶殘留量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體溶液，樣本中殘留的三甲氧芐胺嘧啶藥物與酶標(biāo)板上包被的三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原競爭三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與三甲氧芐胺嘧啶藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三甲氧芐胺嘧啶的殘留含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中三甲氧芐胺嘧啶殘留量的濃度范圍。當(dāng)在微孔條上預(yù)包被抗抗體時(shí)，加入三甲氧芐胺嘧啶抗體孵育后，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原溶液，樣本中殘留的三甲氧芐胺嘧啶藥物與酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原競爭三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與三甲氧芐胺嘧啶藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中三甲氧芐胺嘧啶的殘留含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中三甲氧芐胺嘧啶殘留量的濃度范圍。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒監(jiān)測三甲氧芐胺嘧啶藥物的方法，它包括步驟(1)樣品前處理；[OO47](2)用試劑盒進(jìn)行檢測；[OO48](3)分析檢測結(jié)果。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得三甲氧芐胺嘧啶溶液，從而用于后續(xù)的檢測。下面是常見的幾種樣品的前處理方法稱取蜂蜜樣本3.0±0.05g至50ml聚苯乙烯離心管中，加入p朋.0磷酸鹽緩沖液3ml，渦動(dòng)5min至充分溶解，加入堿性氧化鋁2.0g，渦動(dòng)10s，加入三氯甲烷6ml，振蕩5min，3000g以上離心5min;取上清液3ml至另一聚苯乙烯離心管，加入pH10.6碳酸鹽緩沖溶液0.75ml，渦動(dòng)5s，加入乙酸乙酯4ml，正己烷4ml，振蕩5min，3000g以上離心5min;取上層有機(jī)相4ml至10ml干凈的玻璃試管中，于506(TC水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加?ml正己烷，渦動(dòng)30s溶解干燥殘留物，加入復(fù)溶工作液0.45ml，渦動(dòng)2min，3000g以上離心5min;除去上層正己烷相，取下層水相50用于分析。本發(fā)明中用試劑盒檢測時(shí)當(dāng)包被原為三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液再加入酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；當(dāng)包被原為抗抗體時(shí)，向酶標(biāo)板微孔中加入三甲氧芐胺嘧啶抗體，溫育后洗滌拍干，再加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液后加入酶標(biāo)三甲氧芐胺嘧啶半抗原，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。本發(fā)明中檢測結(jié)果分析過程為用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B。)再乘以100%，即百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(％)=(B/B。)X100%以三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(yg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中三甲氧芐胺嘧啶的殘留量。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液濃度。本發(fā)明中檢測結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測過程只需75分鐘可以完成。本發(fā)明檢測三甲氧芐胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定6性或定量檢測樣品中三甲氧芐胺嘧啶的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批量樣品；采用高特異性的三甲氧芐胺嘧啶單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明的試劑盒將在三甲氧芐胺嘧啶的檢測中發(fā)揮重要作用。圖1:三甲氧芐胺嘧啶化學(xué)結(jié)構(gòu)通式；圖2:三甲氧芐胺嘧啶半抗原合成技術(shù)路線；圖3:三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)物為包被原、酶標(biāo)抗抗體為酶標(biāo)記物的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.半抗原的合成將三甲氧芐胺嘧啶采用琥珀酸酐法得到具有羧基官能團(tuán)的半抗原。半抗原的具體步驟1)取0.5g的三甲氧芐胺嘧啶和0.24g的琥珀酸酐用15ml吡啶溶解，[OOes]2)磁力加熱攪拌器加熱攪拌，70°C反應(yīng)24h。3)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸液體，加丙酮15ml溶解后，旋蒸干，重復(fù)3次。4)過硅膠柱，展開劑為甲醇己酸己酯=1:l，收集極性比原料增大的點(diǎn)，旋蒸干即為半抗原。b.免疫原合成1)將10mg三甲氧芐胺嘧啶半抗原，10mgNHS，以及12.5mgEDC充分溶解于lmLDMF中，于室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A。2)稱取BSA50mg，使之充分溶解在3mLPBS(K17.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到該BSA溶液中，并于室溫下攪拌24h，3)用0.01mol/LPBS透析3d，每天換2次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。以12000rpm離心30min，，分裝，收集上清，得到免疫原，置于-2(TC保存?zhèn)溆?。c.包被原三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原的制備將三甲氧芐胺嘧啶半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原。包被原的制備過程1)將10mg三甲氧芐胺嘧啶半抗原用0.5mLDMF溶解，冷卻至l(TC，加入氯甲酸異丁酯5ul，l(TC攪拌反應(yīng)30min，即可得到反應(yīng)液A。2)稱取OVA36mg，使之充分溶解在2mL50mmol/L碳酸鈉溶液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到該溶液中。3)10。C反應(yīng)4h，然后4。C過夜。4)用0.Olmol/IPBS透析3d，每天換2次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。以12000rpm離心30min，收集上清，分裝，得包被原，于-2(TC保存?zhèn)溆谩慰寺】贵w的制備a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100yg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。b.細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按7:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)篩選得到三甲氧芐胺嘧啶的單克隆雜交瘤細(xì)胞株D-1-3CGMCCNo.3358。三甲氧芐胺嘧啶的單克隆雜交瘤細(xì)胞株可以無限量的產(chǎn)生三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體，且該抗體特異性是針對三甲氧芐胺嘧啶的，針對蜂蜜樣品中三甲氧芐胺檢測限可達(dá)到1Pg/L。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將三甲氧芐胺嘧啶的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1Xl(f個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37t:水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射三甲氧芐胺嘧啶的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X107個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸_飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-20。C保存。2.多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以三甲氧芐胺嘧啶與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。3.羊抗鼠抗抗體的制備過程以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。4.酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.20iig/ml，每孔加入100ii1，37t:溫育2h，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后再每孔中加入200iU封閉液，37t:溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。5.酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的置備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過8碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:1;由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體，為了解決這個(gè)問題，我們將傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，即1)省去了氨基的封閉過程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。2)降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:l，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶的活性的損失減少。實(shí)施例2檢測三甲氧芐胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測三甲氧芐胺嘧啶的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)三甲氧芐胺嘧啶單克隆抗體工作液；(4)三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0iig/L、2iig/L、6yg/L、18yg/L、54iig/l、162iig/1;(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L鹽酸；(7)濃縮洗滌液為O.8-1.2%吐溫-20和0.05-0.01%。疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。(8)濃縮復(fù)溶液為含有5-10%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。實(shí)施例3樣品中三甲氧芐胺嘧啶的檢測1.樣品前處理稱取蜂蜜樣本3.0±0.05g至50ml聚苯乙烯離心管中，加入p朋.0磷酸鹽緩沖液3ml，渦動(dòng)5min至充分溶解，加入堿性氧化鋁2.Og，渦動(dòng)10s，加入三氯甲烷6ml，振蕩5min，3000g以上離心5min;取上清液3ml至另一聚苯乙烯離心管，加入pH10.6碳酸鹽緩沖溶液0.75ml，渦動(dòng)5s，加入乙酸乙酯4ml，正己烷4ml，振蕩5min，3000g以上離心5min;取上層有機(jī)相4ml至10ml干凈的玻璃試管中，于506(TC水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；加入lml正己烷，渦動(dòng)30s溶解干燥殘留物，加入復(fù)溶工作液0.45ml，渦動(dòng)2min，3000g以上離心5min;除去上層正己烷相，取下層水相50iU用于分析。2.用試劑盒檢測向包被有三甲氧芐胺嘧啶偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50iU，再加入三甲氧芐胺嘧啶單克隆抗體工作液50iU，用蓋板模封板，25°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250y1洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100iil，25t:恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)洗板步驟，每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，25t:恒溫箱避光顯色15min，每孔加入2mol/L終止液鹽酸50y1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(BO)再乘以100%，得到百分吸光度值。以三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/L)的半對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖3。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出三甲氧芐胺嘧啶的殘留量。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)分別從三個(gè)不同的時(shí)間段制備的酶標(biāo)板中各抽出一批酶標(biāo)板，每批各抽取10個(gè)試劑盒，每板各抽出20個(gè)微孔，測定18g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，計(jì)算變異系數(shù)。表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(CV%)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通過上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出，每批試劑盒各IO次標(biāo)準(zhǔn)品變異系數(shù)在4.5%-13.2%之間，符合精密度小于或等于25%的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)例2樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)1.樣品精密度試驗(yàn)以5i!g/L濃度的三甲氧芐胺嘧啶對蜂蜜進(jìn)行添加測定，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各五個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2。表2蜂蜜樣本可重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.34.54.24.94.76.3結(jié)果表明蜂蜜樣本的變異系數(shù)均在4.2%-9.4%之間，符合了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)200517號附件2試劑盒備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)中第四點(diǎn)精密度標(biāo)準(zhǔn)。b.樣本準(zhǔn)確度試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別為10g/kg、20g/kg，分別對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。表5試劑盒的準(zhǔn)確度樣本蜂蜜添加濃度(ng/kg)1020準(zhǔn)確度％184.590.3292.487.1395.690.0484.094.8平均值％89.190.6結(jié)果表明蜂蜜樣本添加回收率在84.0%-95.6%之間。實(shí)驗(yàn)例3交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇與三甲氧芐胺嘧啶有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的藥物測定交叉反應(yīng)率，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率越大，那么此試劑盒對三甲氧芐胺嘧啶的檢測的特異性就越好。交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制三甲氧芐胺嘧啶的濃度/引起50%抑制的類似物濃度)X100%表6試劑盒的特異性藥物名稱交叉反應(yīng)率(％)三甲氧節(jié)胺嘧啶100%1,2-甲氧節(jié)胺嘧啶<1%實(shí)驗(yàn)例4試劑盒保存條件為28°C，經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、三甲氧芐胺嘧啶添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運(yùn)輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37t:保存條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2『C至少可以保存6個(gè)月以上。權(quán)利要求一種檢測三甲氧芐胺嘧啶藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)復(fù)溶液，所述包被原為三甲氧芐胺嘧啶抗原、抗體或抗抗體，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶抗原、酶標(biāo)記三甲氧芐胺嘧啶抗體或酶標(biāo)記抗抗體，當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)還含有三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體工作液。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述三甲氧芐胺嘧啶抗原是由三甲氧芐胺嘧啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述三甲氧芐胺嘧啶抗體是由所述偶聯(lián)抗原制備獲得，其中所述三甲氧芐胺嘧啶半抗原為三甲氧芐胺嘧啶_琥珀酸酐。3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述三甲氧芐胺嘧啶抗體為單克隆抗體。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述三甲氧芐胺嘧啶抗體由雜交瘤細(xì)胞株D-1-3CGMCCNo.3358分泌產(chǎn)生。5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。6.如權(quán)利要求書1或2所述的試劑盒，其特征在于所用包被緩沖液為pH值為7.0，0.lmol/L磷酸鹽緩沖液，所用封閉液為pH值為7.2，含有0.03-0.05%。硫柳汞防腐劑，8-12%卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。7.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為12mol/L氫氧化鈉。8.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液為0.8-1.2%吐溫-20和0.05-0.01%。疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有5-10%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0iig/L，2iig/L，6iig/L，18iig/L，54iig/L，162iig/L，所述百分比為重量體積百分比。9.權(quán)利要求18任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測三甲氧芐胺嘧啶藥物殘留中的應(yīng)用。10.—種檢測樣品三甲氧芐胺嘧啶藥物殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測；(3)分析檢測結(jié)果。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測三甲氧芐胺嘧啶藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有包被有包被抗原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物，三甲氧芐胺嘧啶特異性抗體工作液(當(dāng)酶標(biāo)板上包被抗原且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)板上包被抗抗體且酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗原時(shí)含有)，三甲氧芐胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，復(fù)溶液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測三甲氧芐胺嘧啶的方法，它包括首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測蜂蜜樣品中三甲氧芐胺嘧啶的殘留量，其操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。文檔編號G01N33/543GK101776685SQ20091023782公開日2010年7月14日申請日期2009年11月11日優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日發(fā)明者萬宇平,何方洋,馮才偉,馮才茂,馮靜,劉平,劉玉梅,崔海峰,楊昌松,段盈盈,汪善良,趙正苗,郝士元,陳偉玲申請人:北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司;北京望爾生物技術(shù)有限公司