專利名稱：磺胺－5－甲氧嘧啶含量的酶聯(lián)免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品中獸藥殘留安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于篩選、定量檢測市場上奶、肉、蛋等動物類食品中殘留SMD定性和定量。
背景技術(shù)：
磺胺類藥物被廣泛用于獸醫(yī)臨床，用以治療和預(yù)防某些疾病，但由于不合理的使用，易引起在動物源性食品中的殘留。食用含有磺胺類藥物殘留的食品會引起一系列不良的后果，如過敏、誘發(fā)癌癥和損害腦神經(jīng)等。目前測定奶、肉、蛋等動物類食品中磺胺-5-甲氧嘧啶(即SMD)方法有以下幾種1、微生物檢測法SMD對特定微生物抵制作用，可定性或半定量檢測殘留SMD。
2、光譜法紫外分光光度法，紅外分光光度法，熒光光度法。
3、色譜法薄層層析法(TLC)，氣相色譜法(GC)，高效液相色譜法(HPLC)，質(zhì)譜法(MS)。
尤其是HPLC常作為法定檢測方法，但因樣品前處理繁瑣、耗時、昂貴，還需有高效液相色譜儀，不適用于基層，不能作樣品篩選用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種能高效、靈敏度高的、方便操作的磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法。
本發(fā)明方法是1)采用戊二醛法把磺胺-5-甲氧嘧啶連接到牛血清白蛋白或卵清白蛋白形成全抗原；2)采用細(xì)胞融合法制備篩選含有穩(wěn)定分泌磺胺-5-甲氧嘧啶抗體的雜交瘤細(xì)胞株；小鼠腹水誘生法制備含有磺胺-5-甲氧嘧啶抗體的小鼠腹水；3)提取待測樣品組織；
4)先將全抗原包被酶標(biāo)板，再向酶標(biāo)板加入上述小鼠腹水和待測樣品組織，最后加入底物顯色液，顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出所測樣品中磺胺-5-甲氧嘧啶含量。
本發(fā)明用免疫方法把半抗原SMD變?yōu)槿乖苽涮禺愋钥贵w，由于酶的催化效率高，可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)很高的敏感度，使該法特異性強(qiáng)，靈敏度高，適合大批樣品的篩選。其中的酶標(biāo)板包被SMD-BSA抗原后，用小牛血清封閉，封存后于4℃條件下可長期保存，該方法市場前景好，尤其是我國已實行食品安全法后，其應(yīng)用前景較好。
為了提高顯色的穩(wěn)定性，本發(fā)明底物顯色液為由3，3’，5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫尿素組成的混合液。
其中，底物顯色液由濃度為0.2～0.5mg/ml的5，5-四甲基聯(lián)苯胺和濃度為0.165～0.35mg/ml的過氧化氫尿素組成；3，3’，5，5-四甲基聯(lián)苯胺的最佳濃度為0.2～0.21mg/ml，過氧化氫尿素的最佳濃度為0.165～0.175mg/ml。
本發(fā)明所述待測樣品的提取方法是將待測動物源性食品，用乙腈水溶液提取組織，再用乙酸乙脂水溶液再提取，取有機(jī)層，吹干，再用堿性液溶解沉渣，并加入正己烷振蕩，離心，進(jìn)一步脫脂，用鹽酸調(diào)節(jié)pH7.2±0.2，稀釋。待測樣品的這種前處理方法適應(yīng)了快速、簡便的檢測需要。
用正己烷排除脂溶性物質(zhì)的干擾，所述稀釋倍數(shù)為5至20倍。
本發(fā)明所述含有穩(wěn)定分泌磺胺-5-甲氧嘧啶抗體的小鼠腹水的制備步驟是先制備雜交瘤細(xì)胞，并篩選出特異性強(qiáng)、分泌抗體穩(wěn)定的細(xì)胞株；然后將細(xì)胞株注入BALB/C小鼠腹腔，制備腹水。


圖1為合成抗原SMD-BSA的UV吸收光譜圖。
圖2為注入雜交瘤細(xì)胞的小鼠與正常小鼠的腹腔對照圖。
圖3為BSA-SMD偶聯(lián)物Western印跡圖。
圖4為間接競爭ELISA法制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖5為間接競爭ELISA法制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖6為空白樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式
一、全抗原的合成與鑒定
(1)抗原的合成稱取112mg的磺胺-5-甲氧嘧啶(SMD)與204mg的牛血清白蛋白(BSA)或者129mg的卵清蛋白(OVA)，溶于25.5ml、pH7.2的PB(磷酸鈉鹽緩沖液)和二氧六環(huán)的混和液中(比例為2∶1)，于磁力攪拌器上攪拌，滴加0.15ml，25％戊二醛，在室溫下，攪拌3h，裝入透析袋，于4℃下，用PB(PH7.0)透析6d，每天換二次液，分裝凍存。
(2)合成抗原的鑒定在200到400nm的波長下分別對SMD、載體蛋白以及二者的偶聯(lián)物用紫外分光光度計進(jìn)行掃描，來判定SMD是否與載體蛋白偶聯(lián)。
SMD在253、244以及202.8nm處有吸收峰，BSA在214和278nm處有吸收峰，偶聯(lián)物在207.8、259.4、265nm處形成吸收峰，可見偶聯(lián)后吸收峰發(fā)生了漂移，可判定偶聯(lián)成功。結(jié)果見圖1，圖中，I為SMD-BSA偶聯(lián)物的掃描曲線；II為BSA的掃描曲線；III為SMD的掃描曲線?？v坐標(biāo)為OD值，橫坐標(biāo)為掃描的波長(nm)。
二、單克隆抗體的制備(1)實驗動物7周齡的BALB/c小鼠。
(2)免疫程序首免，50μg抗原溶于100μl PBS，與100μl完全福氏佐劑混勻，皮下注射。其后，每隔2周，用25μg抗原溶于100μl PBS，與100μl不完全福氏佐劑混勻，皮下注射，作4次增強(qiáng)免疫后，隔2周進(jìn)行抗原沖擊，25μg抗原溶于200μl PBS，腹腔注射，3d后，取脾細(xì)胞。
(3)細(xì)胞準(zhǔn)備①骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備及脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備取對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14(7～8個25ml培養(yǎng)瓶)，用彎頭滴管將細(xì)胞輕輕吹下，收集于50ml離心管，1700r/min離心5min，棄去上清，同法用不完全培養(yǎng)基離心洗滌一次，將細(xì)胞重新懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基。
脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備A.取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清，同時通過頸脫位致死小鼠。
B.浸泡于75％酒精中5min，于解剖臺上固定后，移入超凈臺。
C.掀開左側(cè)腹部皮膚，無菌手術(shù)取出脾臟，置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，洗滌并剝?nèi)ブ車M織。
D.將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟，使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基中制成單細(xì)胞懸液。
E.收獲脾細(xì)胞懸液，1700r/min離心5～10min，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1次。
②飼養(yǎng)細(xì)胞的制備按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法致死小鼠、體表消毒和固定后，掀開皮膚后，用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基到腹腔，輕輕按摩腹部，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。離心，棄上清。用5ml HAT培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮。
③細(xì)胞融合A.將上述的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合于一支50ml的帶蓋離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。
B.1700r/min離心5min，將上清盡量吸凈。
C.在手掌上輕擊管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻；置40℃水浴中預(yù)熱。
D.用吸管在45s左右加預(yù)熱至40℃的50％PEG 1ml，邊加邊輕輕晃動。
E.用吸管在90s內(nèi)加25ml預(yù)熱至37℃的不完全培養(yǎng)基；37℃靜置10min。(要遵照先慢后快的原則)F.1700r/min離心5min；棄去上清。
G.加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80ml。
H.分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔兩到三滴；然后將培養(yǎng)板置37℃，6％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
I.5d后用HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基。
J.9d后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基。
K.經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。
④確定包被抗原的工作濃度以及陽性血清效價(方陣實驗)包被抗原(SMD-OVA)作系列稀釋，每一行為一個稀釋度，70μl/孔，37℃作用2h，洗板3次，加入200μl含1‰OVA的PBS封閉，37℃ 2h，洗板3次；血清作系列稀釋，每一列為一個稀釋度，70μl/孔，37℃作用1.5h，洗板5次，加入1∶800稀釋的羊抗鼠的酶標(biāo)二抗，80μl/孔，37℃作用1.5h，洗板5次，加入底物OPD，70μl/孔，37℃避光顯色20min，用2mol/L的硫酸終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀取OD值。
結(jié)果見表1表1方陣實驗結(jié)果

由上表可知，包被原的工作濃度為1∶4050，血清效價為1∶16200。
⑤陽性孔的篩選間接ELISA聯(lián)合競爭ELISA篩選陽性孔將每一孔雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清分為等量的二份，一份加80μl洗液，另一份加80μl高濃度SMD，分別做ELISA，其他步驟同④。
陽性孔的判定上一孔顯色很明顯，OD值高，且下一孔顯色不明顯或不顯色，OD值明顯比上一孔低，(即二孔顏色差異大)則判定為陽性孔；兩孔顯色都明顯或都不顯色者(即二孔顏色差異小)，則判為陰性。
⑥陽性孔的亞克隆將96孔板上的陽性孔雜交瘤細(xì)胞吹下，作系列稀釋(10倍或20倍，可根據(jù)細(xì)胞的多少來決定)，分裝到另一塊96孔板上，37℃，6％CO2培養(yǎng)，觀察，標(biāo)記有單個細(xì)胞的孔。培養(yǎng)10d左右，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體。取陽性孔繼續(xù)亞克隆。亞克隆三次。
經(jīng)過三次亞克隆，篩選出三枚穩(wěn)定分泌針對SMD抗體的雜交瘤細(xì)胞。分別命名為3E8、4A7、2D2。其中以3E8分泌抗體效價最高，將一部分細(xì)胞做腹水，其余凍存在液氮中。
⑦腹水的制備取7周齡的BALB/c小鼠，用降植烷注入小鼠腹腔，0.4ml/只，9d后腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋的處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5×105/0.2ml。間隔5d后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，用16號針頭采集腹水，將腹水離心，取上清，測定效價，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 如圖2所示，為注入雜交瘤細(xì)胞的小鼠。其腸系膜以及腹腔布滿紅色的形狀不一的腫瘤團(tuán)塊。中間為正常小鼠；兩邊為注入雜交瘤細(xì)胞的小鼠，腹腔長滿腫瘤。
⑧Western印跡法檢驗單克隆抗體用BSA和SMD-BSA偶聯(lián)物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。膠的濃度為10％。再將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜。用脫脂奶粉封閉，用1∶100小鼠的腹水作為一抗。加入酶標(biāo)二抗經(jīng)充分洗絳后，加入3，3’-二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色。
左側(cè)的條帶是標(biāo)準(zhǔn)蛋白，右邊二條顯色的是BSA-SMD偶聯(lián)物，右側(cè)還有二條沒有作色的條帶是BSA，由此可知，產(chǎn)生的抗體可以與BSA-SMD偶聯(lián)物反應(yīng)，對載體蛋白不起反應(yīng)。
結(jié)果見圖3，染色的地方為BSA-SMD偶聯(lián)物，右方有二處為BSA，沒有著色。分子量Marker用考馬斯亮藍(lán)染。
⑨抗體特異性的鑒定用系列稀釋的磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺甲噁唑、磺胺、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶，做競爭ELISA。用BSA-SMD包被，用含牛血清白蛋白的PBS封閉，在加入腹水的同時加入競爭藥物，其它步驟同④。結(jié)果見表2交叉反應(yīng)性＝產(chǎn)生50％抑制時SMD的濃度/產(chǎn)生50％抑制時的其它藥物的濃度。
表2與其它8種磺胺藥的交叉性

由表2可知，三株細(xì)胞產(chǎn)生的抗體對幾種磺胺藥物基本無交叉性。
⑩標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的磺胺對甲氧嘧啶，0、1、5、10、50、100、300、500、1000ng/ml做競爭ELISA，具體步驟同⑨。
標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)的計算表3、表4為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的一些數(shù)據(jù)，包括間接競爭ELISA的結(jié)果，以及計算的一些相關(guān)參數(shù)，圖4為作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(用Microsoft Excel軟件處理)。
表3競爭ELISA的結(jié)果

表4相關(guān)參數(shù)

按下式計算抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)，以藥物濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，作圖，結(jié)果如圖4。
抑制率＝OD加入SMD/OD未加入SMD標(biāo)準(zhǔn)差(SD)＝[∑(X-Xi)2/(n-1)]1/2；標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＝SD/B檢測下限(LOD)為(B-3SD)相對應(yīng)的值，經(jīng)計算為1.766ng/ml；定量限(LOQ)為(B-10SD)相對應(yīng)的值，經(jīng)計算為11.274ng/ml。
三、SMD單克隆抗體3E8細(xì)胞株(于2002年7月制備凍存)的穩(wěn)定性實驗(1)復(fù)蘇凍存的3E8細(xì)胞株將水浴恒溫振蕩器的溫度調(diào)至37℃，從液氮中取出抗SMD單抗3E8細(xì)胞株的凍存小管，立即投入37℃溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解，要在1-2min內(nèi)完成復(fù)溫。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)液置37℃、5％二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后，細(xì)胞換液。棄去培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
經(jīng)復(fù)蘇凍存的3E8細(xì)胞株，得到系列細(xì)胞組，其中，以H5細(xì)胞組產(chǎn)生的抗體性能最好，故命名為3E8-H5。
(2)單抗細(xì)胞株傳代當(dāng)培養(yǎng)瓶壁鋪滿細(xì)胞時，用吸管將細(xì)胞從壁上吹下，制成細(xì)胞懸液，棄去一半的細(xì)胞懸液，余下的補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。將細(xì)胞傳代十幾代后，擴(kuò)增細(xì)胞。
一部分凍存，一部分進(jìn)行細(xì)胞亞克隆，做成抗SMD腹水。
(3)陽性細(xì)胞亞克隆用直接ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測結(jié)果呈陽性，將3E8細(xì)胞亞克隆。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的陽性雜交瘤細(xì)胞吹下，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上作系列稀釋，有限稀釋法亞克隆陽性細(xì)胞，分裝到一塊已經(jīng)加上飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，37℃，5％CO2培養(yǎng)，觀察，三天后標(biāo)記有單個細(xì)胞的孔。培養(yǎng)10d左右，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體。
(4)腹水的制備取8周的雜交小鼠，用降植烷注入小鼠腹腔，0.2ml/只，9d后腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋的處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5×105/0.5ml。間隔7d后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，用16號針頭采集腹水，將腹水離心，取上清，測定效價，分裝，-34℃凍存?zhèn)溆谩?br> (5)確定抗原、抗體的工作濃度將SMD-BSA作1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10000、1∶20000、1∶50000、1∶100000稀釋，每一行作為一個稀釋度，100μl每孔，37℃溫浴2h，PBST洗滌三次，每次間隔3min。15％小牛血清封閉，每孔加200μl，37℃作用2h，同上洗滌，拍干?？贵w縱向稀釋，每一列為一個稀釋度，100μl每孔，37℃作用1h，洗滌5次，拍干。加入1∶1000稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗100μl，37℃作用1h，洗板5次、拍干；每孔加入TMB底物顯色液100μl，37℃避光顯色10min，2mol/LH2SO4中止反應(yīng)。測定OD450值。選取OD值，確定抗原、抗體工作濃度，作為間接競爭ELISA工作濃度。結(jié)果見表5
表5方陣實驗的結(jié)果

根據(jù)結(jié)果選擇抗原工作濃度1∶6000，抗體工作濃度為1∶100000。
(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的SMD，0、1、10、50、100、500ng/ml做競爭ELISA，具體步驟同5。
用間接競爭ELISA制備SMD標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算出的相關(guān)參數(shù)見表6、表7。

表7相關(guān)參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)差(SD)＝[∑(X-Xi)2/(n-1)]1/2；標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＝SD/B按下式計算抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)，以藥物濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，作圖，結(jié)果如圖5。
抑制率＝OD加入SMD/OD未加入SMD×100％通過以上實驗結(jié)果表明，3E8細(xì)胞株經(jīng)過兩年多的凍存，重新復(fù)蘇、克隆，形成的新細(xì)胞株仍能穩(wěn)定地分泌抗SMD單克隆抗體，且效價較高。因此本實驗室所保存的抗SMD單抗細(xì)胞株穩(wěn)定性好，能夠長時間的保存。
抗體是試劑盒中核心試劑之一，所以單克隆抗體性質(zhì)的穩(wěn)定，是開發(fā)殘留快速檢測試劑盒的首要關(guān)鍵。
四、SMD單克隆抗體的應(yīng)用1、動物組織樣品中SMD的測定(1)樣品的前處理步驟A.取待測定的肌肉、肝臟或腎臟，去脂肪備用。
B.稱取剪碎的樣品2.5g于離心管中，加入乙腈水溶液(乙腈∶蒸餾水＝85∶15)10ml，以高速組織分散器分散后，加蓋，不時振蕩進(jìn)行提取。
C.4000r/min離心10min，吸取3ml上清液于一帶蓋試管中，加3ml雙蒸水和4.5ml乙酸乙酯，加蓋，振蕩提取。
D.3000r/min離心10min，將上層有機(jī)相吸出，用壓縮空氣吹干。
E.用1.5ml堿性PBS溶液(NaOH濃度為0.025mol/L)將殘渣溶解，加入3ml正己烷，振蕩。
F.離心，移去上層的正己烷及脂肪層，吸出下層液體。
G.用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2，待測。
注若步驟F離心后脂肪分層不好，可再加正己烷，振蕩，重復(fù)步驟F。
(2)SMD的藥物添加回收試驗配置0、1、10、50、100、500、1000ng/ml系列濃度的SMD溶液，將SMD添加到肌肉和肝臟中，按樣品的前處理步驟處理添加藥物的組織，用間接競爭ELISA方法檢測添加了50ng/ml、100ng/ml SMD的樣品，測定其回收率。
在50ng/ml時，在肌肉中的回收率為93.9％，在肝臟中的回收率為76.9％。在100ng/ml時，在肌肉中的回收率為88.5％，在肝臟中的回收率為91.4％。
(3)動物實驗將買回的肉雞先適應(yīng)飼養(yǎng)3天，提供飼料和飲水，適應(yīng)環(huán)境后分組。
27只體重1kg的雞分為二組I組，3只，為對照組，不喂藥；II組，24只，為低劑量組，投藥200mg/只，用藥10d。
將要飼喂的藥物稱取規(guī)定的重量，然后包裹在面粉中，做成面丸飼喂。對照組飼喂不加SMD的面丸，使動物實驗的條件一致。
(4)采集樣本采集雞的肌肉、肝臟、腎臟，用作樣品處理。
I組，第2、5、12d各殺一只；取其肌肉、肝臟、腎臟作為待檢樣品。II組，于停藥后第1、2、3、4、5、6、9、12d每天各殺3只；取其肌肉、肝臟、腎臟作為待檢樣品。
(5)樣品處理將采集的I、II組樣品的肌肉、肝臟進(jìn)行處理(方法如本節(jié)中A至G)。
(6)操作步驟先將全抗原(SMD-BSA)包被酶標(biāo)板，再向酶標(biāo)板加入上述小鼠腹水和待測樣品組織，最后加入底物顯色液，顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出所測樣品中磺胺-5-甲氧嘧啶含量。
(7)空白樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備間接競爭ELISA檢測方法制備肌肉、肝臟的空白樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線。用合成的全抗原(SMD-BSA)包被酶標(biāo)板，抗原的工作濃度為1∶5000，SMD抗體工作濃度為1∶100000。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、1、10、50、100、500ng/ml。樣品作5倍稀釋后進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將肌肉、肝臟的空白樣本處理后作本底做標(biāo)準(zhǔn)曲線，與PBS標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較，結(jié)果如圖6橫坐標(biāo)為SMD濃度對數(shù)，縱坐標(biāo)為抑制率。
從圖6中可以看出，肌肉、肝臟的組織空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線與PBS制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線在形狀上基本相似，且各方面的符合率比較高，雖然可以用稀釋的陰性樣本來減少組織對抗原、抗體結(jié)合的影響。但在實際應(yīng)用中用PBS標(biāo)準(zhǔn)曲線來代替陰性樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(8)樣品中的藥物殘留檢測將動物實驗獲得的分別停藥1、2、3、4、5、6、9、12天時的多個樣品，做樣品處理后，用PBS稀釋5倍，待測。用間接競爭ELISA檢測方法測定組織樣品中的SMD殘留。
1-12天樣品(200mg/只)檢測所得SMD殘留量，結(jié)果見表8表8樣品檢測所得SMD殘留量

從表8可以看出，SMD在停藥第5天時，肌肉中的SMD殘留已經(jīng)基本清除，而肝臟中藥物殘留可持續(xù)到12天以上。
2、牛奶中的藥物添加回收試驗(1)牛奶的樣品前處理步驟(本室另一研究結(jié)果)方法1取新鮮牛奶，室溫下4000r/min離心20min，棄去上層脂肪，取一份下層清液加四份PBS混勻后待測。
方法2新鮮牛奶，室溫下4000r/min離心20min，棄去上層脂肪，取下層清液1ml，加入正己烷1ml，充分振蕩，靜置10min，取下層液體待測。
人工配置含有系列濃度的SMZ(復(fù)方新諾明)新鮮牛奶，按照方法1進(jìn)行樣品處理，使處理后的藥物含量分別為0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、0.9μg/ml，并以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)用與測定肉質(zhì)中相同的方法測定添加了高、中、低三種濃度0.005、0.25、0.5μg/ml的SMZ的牛奶樣品。按照建立的回歸方程，計算藥物的添加回收率。
(3)牛奶中的藥物添加回收率試驗使用兩種牛奶處理樣品方法分別對添加標(biāo)準(zhǔn)濃度藥物的新鮮牛奶進(jìn)行處理。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，第一種方法，牛奶經(jīng)離心脫脂后用PBS做5倍稀釋，直接進(jìn)行檢測效果好，且處理方法簡單快捷，故選擇此法進(jìn)行樣品處理。
通過建立的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，計算出該方法的檢測下限LOD為6.148ng/ml，定量線LOQ為25.4ng/ml。
根據(jù)本發(fā)明方法測定的結(jié)果，通過回歸方程計算出牛奶樣品中添加三種濃度的SMZ，回收率分別為106％、71.6％和76.6％，變異系數(shù)為4.50％、7.40％和10.27％，具有較高的準(zhǔn)確性。
3、雞蛋中的藥物添加回收試驗(1)雞蛋的樣品前處理步驟將新鮮的雞蛋打碎后，一部分直接添加磺胺-5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)液，另一部分將蛋黃和蛋清分離后，分別添加磺胺-5-甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)液，于勻漿機(jī)上打散，使得磺胺-5-甲氧嘧啶在各樣品中的終濃度為2000ng/g、1000ng/g和0ng/g(空白樣)，再將上述樣本分別進(jìn)行以下處理稱取勻漿物5.0g，置50mL塑料離心管中。加入乙腈水溶液(乙腈∶蒸餾水＝85∶15)10mL，中速(200次/分)振蕩20～30min，4000r/min離心10min，吸取3mL上清液于一帶蓋試管中，加入3mL雙蒸水和4mL乙酸乙酯，加蓋振蕩提取30min后，于離心機(jī)上2000r/min離心10min，將上層有機(jī)相吸出，壓縮空氣下吹干。用1.5mL堿性PBS將殘渣溶解，然后加入3mL正己烷，振蕩。靜置至分層，棄去上層正己烷層，重復(fù)2次。用6mol/LHCl調(diào)pH至7.2左右，做20倍稀釋后(使得藥物的理論終濃度為100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml)，待測。
在已經(jīng)確定的抗原抗體工作濃度的基礎(chǔ)上，以經(jīng)過前處理，得到從蛋清蛋黃混合物中未添加SMD的提取液做適當(dāng)稀釋后，作為稀釋液，配置標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的SMD，0、1、10、50、100、500、1000、2000ng/ml，做間接競爭ELISA，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并將處理的樣品回收液進(jìn)行間接ELISA實驗，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中SMD的藥物的添加回收率。
(2)雞蛋中的藥物添加回收率通過建立的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，計算出該方法的檢測下限LOD為8.5ng/ml，定量線LOQ為31.6ng/m。
根據(jù)本發(fā)明方法測定的結(jié)果，通過回歸方程計算出蛋清、蛋黃、蛋清和蛋黃混合處理后的藥物添加回收率分別為84.7％、96.6％、91.1％，變異系數(shù)為3.30％、3.38％、3.05％，具有較高的準(zhǔn)確性。
五、SMD殘留快速檢測免疫分析試劑盒的研制(1)顯色系統(tǒng)改進(jìn)TMB顯色系統(tǒng)為濃度為0.5mg/ml的5，5-四甲基聯(lián)苯胺和濃度為0.35mg/ml的過氧化氫尿素組成，3，3’，5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫尿素的質(zhì)量比為1∶1。
先將3，3’，5，5-四甲基聯(lián)苯胺用無水乙醇配成5mg/ml的母液，再用蒸餾水配成0.5mg/ml的應(yīng)用液。
先將過氧化氫尿素用蒸餾水配成35mg/ml的母液，用時再用磷酸鹽緩沖液配成0.35mg/ml的應(yīng)用液。
以上兩種應(yīng)用液1∶1比例混合，作為底物顯色液。
配系列稀釋濃度的5，5-四甲基聯(lián)苯胺、過氧化氫尿素，進(jìn)行濃度及顯色穩(wěn)定性測試。用終止液(2mol/L濃硫酸)終止反應(yīng)后，在450nm波長下，酶標(biāo)儀上讀取OD值。
不同濃度的5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫尿素按比例混合，37℃水浴中顯色10min后，終止ELISA反應(yīng)，讀取OD450值。間隔10min后再次讀取OD值，重復(fù)兩次。結(jié)果見表9、10、11
表9第一次讀取的OD值

10min后再讀取OD值如下表表10第二次讀取的OD值

20min后讀取的OD值如下表表11第三次讀取的OD值

由以上的實驗得出結(jié)論顯色系統(tǒng)的濃度越高，酶標(biāo)板褪色的時間越快。確定5，5-四甲基聯(lián)苯胺為0.2mg/ml，過氧化氫尿素濃度為0.175mg/ml。
經(jīng)過實驗條件的優(yōu)化，最終確定5，5-四甲基聯(lián)苯胺濃度為0.21mg/ml，過氧化氫尿素濃度為0.165mg/ml。
(2)酶標(biāo)板保存酶標(biāo)板上抗原的結(jié)合比較牢固，不易脫落，因此，置于4℃冰箱內(nèi)可長期保存。
(3)抗體(一抗)的保存將抗SMD抗體保存在高壓滅菌的甘油中。最終稀釋一抗后，使甘油濃度低于5％，因此做了兩個稀釋倍數(shù)保存一抗，分別為2000倍和8000倍稀釋，甘油濃度為30％。使用時，2000倍稀釋的一抗再稀釋50倍，8000倍稀釋的一抗再稀釋12.5倍，使一抗工作濃度為1∶100000。結(jié)果見表12、13表124℃放置一個月后的SMD曲線OD值

表134℃、-20℃放置6個月后的藥物曲線OD值

從保存的抗體與現(xiàn)配的抗體之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線上，可以得出結(jié)論在30％甘油中保存的一抗工作曲線較好，效價幾乎沒有下降。稀釋8000倍的抗SMD抗體在4℃放置6個月后，工作濃度幾乎不變，標(biāo)準(zhǔn)曲線與現(xiàn)配的抗SMD抗體幾乎一致，證明稀釋8000倍的一抗在4℃能夠很好地保存。
(4)其它配制SMD標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為0、1、10、50、100，200ng/ml，配好后分裝于EP管。置4℃保存。終止液為2mol/L的硫酸。
用標(biāo)準(zhǔn)品配制的標(biāo)準(zhǔn)液，其水溶液性質(zhì)很穩(wěn)定，終止液硫酸也非常穩(wěn)定，它們兩者在常溫下都能放置很長時間，因此，在4℃能長期保存。六、本發(fā)明方法與高效液相色譜法(HPLC)比較試驗對喂給SMD藥物的雞停藥后3d、6d、9d的雞肉樣品按照下述方法進(jìn)行前處理，并用本發(fā)明方法和HPLC法作比較取2g樣品，加入0.5ml 10％Na2SO4和1.5ml CH3CN混合液，制成勻漿，再加入乙腈-氯仿(5∶1)2ml，劇烈混合1min，3500r/min離心3min，上清液轉(zhuǎn)移，殘渣用2ml乙腈-氯仿重提一次，合并二次上清液，在＜40℃條件下用氮氣或空氣吹干，再加入1ml 2％硫酸與2ml正己烷，混勻，離心3min，去掉正己烷層，再用2ml正己烷與上清液混合，洗水相一次，同法去掉正己烷層，分別加入3ml、2ml乙腈-氯仿(1∶2)混合離心3min，取氯仿層在低溫(＜40℃)下蒸干，用1ml流動相溶解做ELISA或高效液相色譜法測定，結(jié)果比較結(jié)果比較(ng/ml)

高效液相色譜法測定SMD時回收率明顯較低，檢測限相對較低，常有漏檢之疑。
同一樣品，用本發(fā)明方法測定，其檢出率較高，不易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。高效液相色譜法對同一份樣品中SMD測定值約為本發(fā)明方法的1/3，因本發(fā)明法不僅可測SMD原藥，而且可以同時檢測其代謝產(chǎn)物，而高效液相色譜法測定時，不包含其代謝產(chǎn)物。
七、總結(jié)本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在(1)特異性檢測用3E8-H5產(chǎn)生的抗體，對幾種磺胺藥作交叉反應(yīng)，能產(chǎn)生50％抑制濃度者為有效反應(yīng)，特異。否則，為非特異。結(jié)果表明只對SMD特異。
(2)靈敏性檢測可檢測樣品中SMD含量最低達(dá)15.84ng/g(肝臟)和1.02ng/g(肌肉)。
(3)回收率測定常規(guī)方法檢測，在100ng/ml添加時SMD肌肉中回收率為87.45％，肝臟中回收率為97％，腎臟中為87％，加入50ng/ml時，肌肉、肝、腎回收率分別為92％，89％，108％；牛奶樣品中添加三種濃度的SMZ，回收率分別為106％、71.6％和76.6％；蛋清、蛋黃、蛋清和蛋黃混合處理后的藥物添加回收率分別為84.7％、96.6％、91.1％，具有較高的準(zhǔn)確性。
(4)細(xì)胞株穩(wěn)定，3E8細(xì)胞株為本實驗室于2002年6月獲得，經(jīng)多次傳代、復(fù)蘇后仍能產(chǎn)生特異性抗體，復(fù)蘇后的新細(xì)胞株命名為3E8-H5。
權(quán)利要求
1.磺胺-5-甲氧嘧啶含量的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于1)采用戊二醛法把磺胺-5-甲氧嘧啶連接到牛血清白蛋白或卵清白蛋白形成全抗原；2)采用細(xì)胞融合法制備篩選含有穩(wěn)定分泌磺胺-5-甲氧嘧啶抗體的雜交瘤細(xì)胞株；小鼠腹水誘生法制備含有磺胺-5-甲氧嘧啶抗體的小鼠腹水；3)提取待測樣品組織；4)先將全抗原包被酶標(biāo)板，再向酶標(biāo)板加入上述小鼠腹水和待測樣品組織，最后加入底物顯色液，顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出所測樣品中磺胺-5-甲氧嘧啶含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于所述底物顯色液為由3，3’，5，5-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫尿素組成的混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于底物顯色液由濃度為0.2～0.5mg/ml的5，5-四甲基聯(lián)苯胺和濃度為0.165～0.35mg/ml的過氧化氫尿素組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于3，3’，5，5-四甲基聯(lián)苯胺的濃度為0.2～0.21mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于過氧化氫尿素的濃度為0.165～0.175mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于所述待測樣品的提取方法是將待測動物源性食品，用乙腈水溶液提取組織，再用乙酸乙脂水溶液再提取，取有機(jī)層，吹干，再用堿性液溶解沉渣，并加入正己烷震蕩，離心，進(jìn)一步脫脂，用鹽酸調(diào)節(jié)pH7.2±0.2，稀釋。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于所述稀釋倍數(shù)為5～20倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的檢測方法，其特征在于所述含有磺胺-5-甲氧嘧啶抗體的小鼠腹水的制備步驟是先制備雜交瘤細(xì)胞，并篩選出特異性強(qiáng)、分泌抗體穩(wěn)定的細(xì)胞株3E8-H5；然后將細(xì)胞株注入BALB/C小鼠腹腔，制備腹水。
全文摘要
磺胺－5－甲氧嘧啶含量的酶聯(lián)免疫檢測方法，涉及食品中獸藥殘留安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于篩選、定量檢測市場上奶、肉、蛋等動物類食品中殘留SMD定性和定量。本發(fā)明用免疫方法把半抗原SMD變?yōu)槿乖?，制備特異性抗體，由于酶的催化效率高，可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)很高的敏感度，使該法特異性強(qiáng)，靈敏度高，適合大批樣品的篩選。
文檔編號G01N33/531GK1916631SQ20061004145
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日
發(fā)明者王宗元, 王捍東, 楊春花, 彭會建, 唐娜, 劉學(xué)忠, 卞建春, 任建新 申請人:揚(yáng)州大學(xué)