一種鹿茸蛋白提取物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鹿茸蛋白提取物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹿茸為我國傳統(tǒng)名貴中藥，已有2000多年的入藥歷史。李時珍在《本草綱目》上 稱鹿茸"善于補腎壯陽、生精益血、補髓健骨"。古典醫(yī)籍《神農(nóng)本草經(jīng)》對其功能和主治也 有詳細記載："味甘、性溫，主漏下惡血、寒熱驚癇、益氣強志、生齒不老"。鹿茸性溫而不燥， 具有振奮和提高機體功能，對全身虛弱、久病之后患者，有較好的強身作用?，F(xiàn)代藥物化學(xué) 分析表明，鹿茸中含有多種生理活性成分，具有抗衰老、抗氧化、提高機體免疫力、促進傷口 愈合等多種功效。鹿茸作為鹿體最活躍的生長點，每年周期性地生長、骨化與脫落，在骨化 之前貯存了大量調(diào)節(jié)生長的生長因子及相關(guān)蛋白。研宄表明鹿茸中含有脂類、多糖、多胺、 蛋白質(zhì)及多肽、激素樣物質(zhì)、生物堿等多種化學(xué)成分，其中蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)占總重量的 50%以上，這是鹿茸具有廣泛生物活性的基礎(chǔ)。
[0003] 霍玉書等（鹿茸生長因子制劑及工藝，CN 1104095A)公開了一種鹿茸中生長因子 制劑的生產(chǎn)工藝，該制備方法是將鹿茸粉碎浸提，浸提液經(jīng)過濾除菌，再經(jīng)層析分離出含有 神經(jīng)生長因子、上皮細胞生長因子等多肽的制劑。該制劑具有安全性，無副作用，無異種蛋 白抗原反應(yīng)。但國內(nèi)外對鹿茸提取物中的大分子蛋白的提取及功效研宄鮮有報道。
[0004] 研宄表明鹿茸的提取工藝對鹿茸中生理活性成分的保留有很大的影響。雖然對 鹿茸的研宄歷史悠久，但傳統(tǒng)的加工技術(shù)以反復(fù)水煮、烘烤和風(fēng)干為主，活性物質(zhì)的提取率 低，并且對蛋白質(zhì)等成分的破壞顯著影響了鹿茸的功效。因此，如何更好地保留鹿茸中活性 蛋白的成分成為了中藥提取領(lǐng)域研宄的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種鹿茸蛋白提取物的制備方法。該發(fā)明在提取過程中 采用接近生理PH和生理滲透壓的緩沖溶液作為提取劑，且在提取過程中保持低溫環(huán)境，最 后階段使用真空冷凍干燥制備鹿茸蛋白提取物，整個制備工藝最大限度地保持了鹿茸蛋白 的生物活性和提取效率；本發(fā)明制得的鹿茸蛋白提取物具有促進血管細胞生長或增殖作 用，特別是對人臍靜脈上皮細胞（HUVEC)生長的增殖率達到200%。
[0006] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種鹿茸蛋白提取物，其制備方法包括如下步驟：
[0008] 將新鮮鹿茸抽血、凍干、粉碎，獲得鹿茸粉末；
[0009] 將鹿茸粉末與緩沖溶液混合，超聲提取，離心，收集上清液，真空冷凍干燥，獲得鹿 茸蛋白提取物；
[0010] 緩沖溶液的pH值為L 0~8. 0,濃度為10~50mM。
[0011] 本發(fā)明選用不同生長時期新鮮鹿茸，在提取過程中采用接近生理pH和生理滲透 壓的緩沖溶液作為提取劑，且在提取過程中保持低溫環(huán)境，最后階段使用真空冷凍干燥制 備鹿茸蛋白提取物，整個制備工藝最大限度地保持了鹿茸蛋白的生物活性和提取效率。本 發(fā)明工藝簡單，提取效率高，能夠?qū)β谷姿幱脙r值充分利用。
[0012] 作為優(yōu)選，鹿茸為毛桃、鞍子、二杠、掛角、三岔、花砍茸或蓮花中的一種或兩者以 上的混合物。
[0013] 優(yōu)選地，鹿茸為毛桃、二杠或三岔中的一種或兩者以上的混合物。
[0014] 更優(yōu)選地，鹿茸為毛桃。
[0015] 作為優(yōu)選，緩沖溶液為Tris-base溶液、PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
[0016] 優(yōu)選地，緩沖溶液為Tris-base溶液或PBS緩沖液。
[0017] 作為優(yōu)選，緩沖溶液的pH值為7. 4。
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，PBS緩沖液的濃度為10mM。
[0019] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，Tris-base溶液的濃度為50mM。
[0020] 作為優(yōu)選，以g/mL計，鹿茸粉末與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1 : (5~100)。
[0021] 優(yōu)選地，以g/mL計，鹿茸粉末與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1 :10。
[0022] 作為優(yōu)選，超聲的溫度為_5°C~10°C，超聲的時間為10~60min。
[0023] 優(yōu)選地，超聲的溫度為0~4°C，超聲的時間為30min。
[0024] 作為優(yōu)選，超聲的程序為：超聲5~10s，間隔15~40s。
[0025] 優(yōu)選地，超聲的程序為：超聲5s，間隔15s。
[0026] 作為優(yōu)選，離心的溫度彡4°C，轉(zhuǎn)速為5000~15000rpm，時間為10~20min。
[0027] 優(yōu)選地，離心的溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為12000rpm，時間為15min。
[0028] 作為優(yōu)選，真空冷凍干燥的溫度< -50°C，時間為24~36h。
[0029] 優(yōu)選地，真空冷凍干燥的溫度為_50°C，時間為30h。
[0030] 作為優(yōu)選，粉碎的目數(shù)為10~300目。
[0031] 優(yōu)選地，粉碎的目數(shù)為200目。
[0032] 本發(fā)明還提供了該鹿茸蛋白提取物在促進血管細胞生長或增殖中的應(yīng)用；該鹿茸 蛋白提取物的制備方法包括：將新鮮鹿茸抽血、凍干、粉碎，獲得鹿茸粉末；將鹿茸粉末與 緩沖溶液混合，超聲提取，離心，收集上清液，真空冷凍干燥，獲得鹿茸蛋白提取物；緩沖溶 液的pH值為7. 0~8. 0,濃度為10~50mM ;作為優(yōu)選，鹿茸為毛桃、鞍子、二杠、掛角、三岔、 花砍茸或蓮花中的一種或兩者以上的混合物；優(yōu)選地，鹿茸為毛桃、二杠或三岔中的一種或 兩者以上的混合物；更優(yōu)選地，鹿茸為毛桃；作為優(yōu)選，緩沖溶液為Tris-base溶液、PBS緩 沖液或Tris-HCl緩沖液；優(yōu)選地，緩沖溶液為Tris-base溶液或PBS緩沖液；作為優(yōu)選，緩 沖溶液的pH值為7. 4 ;在本發(fā)明提供的一些實施例中，PBS緩沖液的濃度為IOmM ;在本發(fā) 明提供的另一些實施例中，Tris-base溶液的濃度為50mM ;作為優(yōu)選，以g/mL計，鹿茸粉末 與緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1 : (5~100);優(yōu)選地，以g/mL計，鹿茸粉末與緩沖溶液的質(zhì)量 體積比為1 :1〇 ;作為優(yōu)選，超聲的溫度為-5°C~10°C，超聲的時間為10~60min ;優(yōu)選地， 超聲的溫度為〇~4°C，超聲的時間為30min ;作為優(yōu)選，超聲的程序為：超聲5~10s，間隔 15~40s ;優(yōu)選地，超聲的程序為：超聲5s，間隔15s ;作為優(yōu)選，離心的溫度< 4°C，轉(zhuǎn)速為 5000~15000rpm，時間為10~20min ;優(yōu)選地，離心的溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為12000rpm，時間 為15min ;作為優(yōu)選，真空冷凍干燥的溫度彡-50°C，時間為24~36h ;優(yōu)選地，真空冷凍干 燥的溫度為_50°C，時間為30h;作為優(yōu)選，粉碎的目數(shù)為10~300目；優(yōu)選地，粉碎的目數(shù) 為200目。
[0033] 作為優(yōu)選，血管細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞。
[0034] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，心腦血管疾病為心肌損傷或心肌缺血。
[0035] 本發(fā)明還提供了一種中藥制劑，包括本發(fā)明提供的鹿茸蛋白提取物；該鹿茸蛋白 提取物的制備方法包括：將新鮮鹿茸抽血、凍干、粉碎，獲得鹿茸粉末；將鹿茸粉末與緩沖 溶液混合，超聲提取，離心，收集上清液，真空冷凍干燥，獲得鹿茸蛋白提取物；緩沖溶液的 pH值為7. 0~8. 0,濃度為10~50mM ;作為優(yōu)選，鹿茸為毛桃、鞍子、二杠、掛角、三岔、花砍 茸或蓮花中的一種或兩者以上的混合物；優(yōu)選地，鹿茸為毛桃、二杠或三岔中的一種或兩者 以上的混合物；更優(yōu)選地，鹿茸為毛桃；作為優(yōu)選，緩沖溶液為Tris-base溶液、PBS緩沖液 或Tris-HCl緩沖液；優(yōu)選地，緩