奶中一種或多種蛋白的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種存在于奶中的至少一種蛋白的提取方法，所述蛋白表現(xiàn)出與所述奶中復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子的親和性，包括如下步驟：a）通過將奶與可溶性鹽接觸產(chǎn)生鈣化合物沉淀而釋放蛋白，以通過這種方法獲得蛋白富集的液相，該可溶性鹽的陰離子由于其具有在這種介質(zhì)中形成所述不溶性鈣化合物的能力而被選擇；b)將蛋白富集的液相與鈣化合物沉淀分離，而且，所述液相被分離成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及c)回收含有蛋白的水性非脂相。
【專利說明】奶中一種或多種蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及奶中一種或多種蛋白的提取方法。所述蛋白對所述奶中復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子具有親和性。
[0002]本發(fā)明中，復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子指結(jié)合到酪蛋白以形成酪蛋白的膠束膠體結(jié)構(gòu)的磷酸鈣鹽，或者指這些沒有結(jié)合到酪蛋白并因此是自由的鹽。這些離子也是溶解在奶中的與上述不同的各種鈣鹽和/或有機的和/或無機鈣復(fù)合物。對奶中鈣離子具有親和性的蛋白是指那些自然存在的蛋白，例如乳清蛋白、乳球蛋白以及免疫球蛋白。這些蛋白也指存在于轉(zhuǎn)基因動物奶中的重組蛋白，例如，血凝因子，尤其是因子νπ、因子珊和因子IX。
【背景技術(shù)】
[0003]市售藥物的主要部分對應(yīng)于合成獲得的化學(xué)物質(zhì)。事實上，直到最近，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)高度依賴于利用化學(xué)合成生產(chǎn)的藥物，用于疾病的診斷和治療。
[0004]然而，蛋白代表攜帶生物信息的分子的實質(zhì)部分，尤其是大量的激素、生長因子、血凝因子或抗體。
[0005]通常，蛋白質(zhì)為基于氨基酸的聚合物，且大部分具有高分子量，其不能通過化學(xué)合成在可接受的成本下獲得。這些用于治療的蛋白質(zhì)通常從人類或者動物組織或血液，例如活體，通過分離和純化獲得。尤其是從豬胰腺提取的胰島素、從血漿中提取的例如為因子珊或因子IX的血凝因子、或 者免疫球蛋白。
[0006]盡管目前上述蛋白質(zhì)的制備方法被大量應(yīng)用，然而，它們具有缺陷。從血小板中提取的一些蛋白，例如為促紅細(xì)胞生成素，的低含量使得它們不能足夠量的分離以滿足不斷增長的治療需要。此外，在血漿蛋白的生產(chǎn)過程中，人體內(nèi)病毒、朊病毒或者其他致病劑的存在需要添加病毒滅活和/或病毒消除的包涵體，以獲得可用于治療的有用產(chǎn)品。
[0007]為了克服這些缺陷，遺傳工程被使用。該技術(shù)同樣大量應(yīng)用于合成蛋白中，從一個獨立基因轉(zhuǎn)移到負(fù)責(zé)分泌期望蛋白的細(xì)胞。從源細(xì)胞系統(tǒng)外獲得的這樣的蛋白稱之為《重組》。
[0008]根據(jù)這一技術(shù)，可以使用不同細(xì)胞系統(tǒng)。
[0009]細(xì)菌系統(tǒng)，例如Ε.coli，大量應(yīng)用且有效。它們能低成本的生產(chǎn)重組蛋白。然而，這些系統(tǒng)不能用于生產(chǎn)簡單的非糖基化蛋白，其不需要精細(xì)折疊處理。
[0010]真菌系統(tǒng)同樣應(yīng)用于分泌蛋白的生產(chǎn)。這些真菌系統(tǒng)的缺陷在于它們是翻譯后修飾的起因，包括，例如，接枝聚糖部分和硫酸基，其能高度影響生產(chǎn)的蛋白的藥代動力學(xué)，尤其是添加甘露糖衍生物的不同基團(tuán)。
[0011]使用桿狀病毒的系統(tǒng)可以生產(chǎn)非常不同的蛋白，例如疫苗蛋白或生長激素，但是它們工業(yè)化應(yīng)用不是最優(yōu)的。
[0012]同樣使用哺乳動物培養(yǎng)物以用于重組復(fù)合蛋白的生產(chǎn)，例如單克隆抗體。細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致正確的折疊的和修飾的重組蛋白。與生產(chǎn)成本相比，低的產(chǎn)量是其主要缺陷。
[0013]這些細(xì)胞系統(tǒng)的變體包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物以用于獲得大量的蛋白。然而，這些系統(tǒng)產(chǎn)生植物-特異性翻譯后修飾，尤其是在生產(chǎn)的蛋白中添加了高度致免疫木糖殘基，因此限制了它們在治療應(yīng)用中的用途。
[0014]前面提到的細(xì)胞系統(tǒng)的替代包括使用轉(zhuǎn)基因動物以用于生產(chǎn)重組疫苗或者復(fù)合治療蛋白。因此，獲得的蛋白表現(xiàn)出與人類接近的糖基化，且能被正確的折疊。這些復(fù)合蛋白并不僅由一個簡單的例如為生長激素的多肽鏈組成，它們組裝成氨基酸后用不同的途徑被修飾，尤其是通過特異性斷裂、糖基化和羧甲基化。大部分情況下，通過細(xì)菌細(xì)胞或酵母不能實現(xiàn)修飾。另一方面，轉(zhuǎn)基因動物能同時結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞系統(tǒng)中遇到的表達(dá)水平以及細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的翻譯后修飾，同時與使用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，降低了制造成本。
[0015]來自于轉(zhuǎn)基因動物的生物材料中，奶是研究的目標(biāo)，其被考慮為非常符合要求的分泌重組蛋白的來源。
[0016]從轉(zhuǎn)基因動物的奶中生產(chǎn)的重組蛋白，能很容易的通過將編碼所感興趣蛋白的基因接枝到一個負(fù)責(zé)合成奶蛋白的基因的調(diào)控區(qū)而獲得，其會指導(dǎo)特別是在乳腺中的合成，之后分泌到奶中。
[0017]例如，EP0527063描述了在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中感興趣蛋白的生產(chǎn)。提到了通過抗乳血清的啟動子來控制編碼感興趣蛋白的基因的表達(dá)。
[0018]另外的專利申請或者專利描述了抗體(EP0741515)、膠原(W096/03051)、人類因子IX (US6046380)、以及因子VDI /血管性血友病因子復(fù)合物(EP0807170)在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中的制備。
[0019]盡管這些方法在蛋白表達(dá)方面有滿意的結(jié)果，但是使用奶作為重組蛋白的源具有缺陷。主要缺陷一方面在于難以從奶中提取獲得滿意的產(chǎn)量，另一方面在于接下來難以提純。
[0020]事實上，奶是一種混合物，90%由含有不同成分的水組成，該成分能分為三類。第一類稱為抗乳血清(或乳清)，由糖類、可溶蛋白、礦物質(zhì)和水溶性維生素組成。第二類稱為脂相(或乳膏)，含有乳化形式的脂肪。第三類稱之為蛋白相，包含80%的酪蛋白，其在鈣的存在下，在PH4.6或者凝乳酶、酶促凝劑的作用下形成全部的可沉淀蛋白。不同的酪蛋白與磷酸鈣鹽能形成直徑達(dá)到0.5 μ m膠體膠束復(fù)合物，磷酸鈣鹽例如為磷酸三鈣鹽的聚合《團(tuán)簇》形式，即Ca9(P04)6。這些膠粒是由酪蛋白亞基形成的，酪蛋白亞基包含包圍著疏水核的富含酪蛋白-K的親水層，磷酸鈣鹽通過靜電作用與親水層結(jié)合。這些磷酸鹽也可存在于膠粒的內(nèi)部空間中，不與酪蛋白結(jié)合。這種蛋白相也包含可溶性蛋白，例如乳清蛋白和乳球蛋白，以及來自于血液的白蛋白和免疫球蛋白。
[0021]依賴于分泌到轉(zhuǎn)基因動物奶中的重組蛋白的性質(zhì)，其可以存在于抗乳血清或者蛋白相中，甚至是同時存在于上述兩者中。每個奶成分的含量和復(fù)雜度使得提取蛋白變的更為困難，尤其是當(dāng)其圈閉到酪蛋白膠束中。另外的困難在于蛋白存在于兩種相中的一個具有不可預(yù)見性。
[0022]重組蛋白還能與奶中以鹽和/或不同可溶性復(fù)合物、或者酪蛋白膠束的磷酸鈣鹽的形式存在的鈣離子表現(xiàn)出親合性。這一親合性通過蛋白與二價鈣離子的靜電連接表現(xiàn)出來。親合性蛋白/鈣離子可以定義親合常數(shù)，利用該值規(guī)定連接強度。通常來說，大部分與鈣離子表現(xiàn)出親合性的蛋白與膠束的磷酸鈣鹽相結(jié)合。其的提取需要執(zhí)行復(fù)合步驟，帶來了實現(xiàn)和產(chǎn)量的問題。[0023]乳品加工業(yè)的經(jīng)典溶劑不能用于這種情況，該經(jīng)典溶劑用于蛋白的分離，該分離由巴氏滅菌、接著再酶促凝或者酸促凝(PH4.6)組成。這是由于在溫度和pH聯(lián)合作用下，重組蛋白常常被變性。此外，蛋白在酪蛋白膠束中的圈閉導(dǎo)致了低的提取產(chǎn)量。另外用在通過過濾、離心和/或沉淀或析出技術(shù)來對奶進(jìn)行分離的物理方法中的溶劑也導(dǎo)致不能接受的提取產(chǎn)量，且提取出的重組蛋白純度低。
[0024]EP0264166描述了在遺傳學(xué)轉(zhuǎn)基因動物的奶中期望蛋白的分泌。該文獻(xiàn)中沒有提及這種蛋白從奶中的純化步驟。
[0025]US4519945描述了一種用于提取重組蛋白的方法，該方法通過從奶中制備酪蛋白的沉淀物，再進(jìn)行如前所述的酸化和加熱步驟。該方法顯著降低了期望蛋白的活性并且提
取產(chǎn)量低。
[0026]US6984772公開了從轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化重組纖維蛋白原的方法。該方法包括通過連續(xù)離心從酪蛋白球中分離抗乳血清，以及蛋白相的分離?？谷檠灞环蛛x并被儲存用于接下來的處理，獲得了一種纖維蛋白原的純化溶液。
[0027]然而，該方法不能用于生產(chǎn)產(chǎn)量滿意的圈閉到酪蛋白膠束內(nèi)和/或上的重組蛋白。例如血凝因子，例如因子νπ、因子VDI和因子IX。
[0028]專利申請W02004/076695描述了從轉(zhuǎn)基因動物的奶中重組蛋白的過濾方法。該方法包括第一步奶的凈化，該步驟即利用一種方法除去奶的成分以獲得一種易于過濾通過孔直徑為0.2μπι的過濾膜的溶液。最終該步驟除去了酪蛋白膠束。因此，如果酪蛋白膠束易于包含圈閉在其結(jié)構(gòu)內(nèi)的感興趣的蛋白，這個步驟在產(chǎn)量方面是有缺陷的，
[0029]US6183803描述了一種從奶中分離蛋白的方法，該蛋白為天然存在于奶中的例如為乳清蛋白的蛋白，以及例如為人類白蛋白或α 1-抗胰蛋白酶的重組蛋白。該方法包括將含有感興趣蛋白的奶與螯合劑接觸的初始步驟。這破壞了酪蛋白膠束，導(dǎo)致了含有酪蛋白、抗乳血清蛋白以及感興趣蛋白的澄清奶血清。該方法還包括酪蛋白膠束的再構(gòu)造步驟，該步驟為添加二價陽離子不溶性鹽到液體介質(zhì)(澄清奶血清)。由于鹽飽和了酪蛋白的靜電連接位點，這些膠束析出，并獲得了一個含有沒有被圈閉到膠束中的感興趣的蛋白的液相。因此，根據(jù)這一方法，感興趣的蛋白的分離最終通過膠束的再構(gòu)造以及它們的析出實現(xiàn)。
[0030]該方法操作復(fù)雜，不能被應(yīng)用到與鈣離子具有相對高度親和性的蛋白上。凝析的蛋白，以及尤其是那些已知的在維生素K影響下合成的蛋白，屬于這個類別。
[0031]觀察發(fā)現(xiàn)，對某一類別的、分泌到轉(zhuǎn)基因動物奶中的、存在于抗乳血清中的轉(zhuǎn)基因蛋白的分離和純化方法導(dǎo)致了非常低的產(chǎn)量，對于那些圈閉到酪蛋白膠束的其它類蛋白，該分離和純化方法操作復(fù)雜。 申請人:給自己設(shè)定了一個任務(wù)，以提供一種從奶中提取與奶中離子形式的鈣具有親和性的天然或非天然的奶組成蛋白的簡單方法，且具有滿意的產(chǎn)量，同時保留蛋白的生物活性，該奶組成蛋白例如為重組因子νπ、因子VDI和因子IX。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0032]因此，本發(fā)明涉及一種存在于奶中的至少一種蛋白的提取方法，所述蛋白表現(xiàn)出與所述奶中復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子的親和性，包括如下步驟:
[0033]a)通過將奶與可溶性鹽接觸產(chǎn)生鈣化合物沉淀而釋放蛋白，以通過這種方法獲得蛋白富集的液相，該可溶性鹽的陰離子由于其具有在這種介質(zhì)中形成所述不溶性鈣化合物的能力而被選擇；
[0034]b)將蛋白富集的液相與鈣化合物沉淀分離，而且，所述液相被分離成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及
[0035]c)回收含有蛋白的水性非脂相。
[0036] 申請人:驚奇的注意到添加可溶性的鹽可以沉淀鈣化合物，其中，感興趣的蛋白被從這些復(fù)合的或非復(fù)合的離子中釋放，并可以在液相的溶液中再次找到，該可溶性鹽的陰離子由于其具有在含有蛋白，尤其是重組蛋白的奶中形成所述不溶性鈣化合物的能力而被選擇，該蛋白表現(xiàn)出與復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子的親和性，即表現(xiàn)出固定到鈣離子的位點。
[0037]上述提到的復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子代表在奶中可溶的不同的有機和/或無機鈣鹽和/或復(fù)合物。這些鹽或復(fù)合物能存在于酪蛋白膠束的內(nèi)部空間中(參見后面圖1所示)。
[0038]這些鈣離子也表示與酪蛋白膠束，尤其是聚集形式(《團(tuán)簇》)的酪蛋白膠束，相互作用的磷酸鈣鹽。這些鹽還以磷酸一鈣和/或磷酸二鈣的形式存在于奶中，其與鈣的其他離子形式相平衡，取決于所執(zhí)行的化學(xué)的和生化的反應(yīng)。
[0039]最后，這些鈣離子代表鈣/酪蛋白復(fù)合物，即，通過靜電作用與磷酸鈣鹽相連的酪蛋白亞基。這些鈣/酪蛋白復(fù)合物也指與磷酸鈣鹽以及有機和/或無機可溶性鈣鹽和/或復(fù)合物相連的酪蛋白膠束。
[0040]不可溶鈣化合物指在奶中溶解度小于0.5%的鈣鹽或者復(fù)合物。
[0041]大部分情況下，感興趣的蛋白大多與酪蛋白膠束的磷酸鈣鹽相連。
[0042]因此，表現(xiàn)出與復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子親和性的蛋白是指具有足夠數(shù)量的固定位點的任何蛋白，該固定位點用于與鈣離子全部或部分相連，或者用于與酪蛋白膠束的磷酸鈣鹽全部或部分相連。
[0043]例如，如果感興趣的蛋白表現(xiàn)出許多與鈣離子的固定位點，例如8到10個GLA域，該域富含可以固定鈣離子的Y —羧基谷氨酸，至少70%到90%的感興趣的蛋白圈閉到酪蛋白膠束內(nèi)和/或上。對于其它蛋白表現(xiàn)出較少鈣離子固定位點，例如2到8個GLA域，其至少30%到60%圈閉到酪蛋白膠束內(nèi)和/或上。最后，甚至蛋白表現(xiàn)出非常少的鈣離子固定位點，例如O到2個GLA域，其可能以至少5%到20%的比例圈閉到酪蛋白膠束內(nèi)和/或上。對于工業(yè)范圍內(nèi)實現(xiàn)本方法，這些被圈閉蛋白的量是不可被忽視的，這意味著可以達(dá)到最高可能的產(chǎn)量。沒有被圈閉到膠束內(nèi)和/或上的余下的蛋白表現(xiàn)出與上面提到的奶中的其它形式的鈣離子的親和性。
[0044]因此，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于至少2%_10%、或者至少40%_60%、或者尤其是至少90%與鈣離子相連的蛋白中提取蛋白。
[0045]這些蛋白與鈣離子的親和性能由未修飾的或體內(nèi)或體外修飾過，例如通過翻譯后修飾，的蛋白的相互作用產(chǎn)生。
[0046]因此，表現(xiàn)出許多與復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子的固定位點的蛋白可以與奶中存在的不同形式的鈣離子相連。
[0047]沒有被任何所觀察到機理的解釋束縛， 申請人:假設(shè)可溶性鹽的加入替換了膠粒的磷酸鈣鹽 的平衡，尤其是鈣/磷酸鹽比，從而導(dǎo)致其變性，以及酪蛋白亞基的聚合沉淀。圈閉于膠粒中和/或上的與磷酸鈣鹽結(jié)合的感興趣蛋白在其變性時被釋放進(jìn)入媒介中。另外，同時，感興趣的蛋白還被從磷酸鈣鹽上釋放或分離，由于它們在本發(fā)明方法中所使用的可溶性鹽的作用下以不溶性鈣化合物的形式沉淀。同樣的，與可溶性鈣的有機和/或無機鹽或復(fù)合物結(jié)合的感興趣的蛋白將會由于相同類型的反應(yīng)而分離。
[0048]這一機制在圖1中舉例闡述。
[0049]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該可溶性鹽是任何可以獲得期望效果的鹽。
[0050]在本發(fā)明的方法中，為了成功將蛋白從與鈣離子的相互作用中釋放，所使用的可溶性鹽可以以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的濃度加入到奶中。事實上，該濃度是足夠允許至少20%的分離，或有利的，至少30%到50%的感興趣蛋白釋放的濃度。特別有利的，該濃度是足夠允許至少60%到80%的，或至少90%的感興趣蛋白釋放的濃度。
[0051]此外，本發(fā)明方法也可以被應(yīng)用到僅部分具有與鈣離子固定位點的蛋白。例如，本發(fā)明的方法能被應(yīng)用到奶中的1%與鈣離子結(jié)合的蛋白的提取。本發(fā)明的方法也能用于從至少2%到10%、或者至少40%到60%、或者尤其是至少90%與這些鈣離子結(jié)合的蛋白。
[0052]本發(fā)明的方法允許尤其是酪蛋白亞基聚合的沉淀。該沉淀是由于如前面提到的酪蛋白膠粒的變性。所應(yīng)用的本發(fā)明的方法通過沉淀而破壞了奶的膠質(zhì)狀態(tài)。[0053]因此，本發(fā)明的方法是一種允許奶從膠質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w狀態(tài)的方法，其對應(yīng)于膠質(zhì)/液體的直接提取。
[0054]本發(fā)明的方法還可以獲得比初始奶中顏色更淺的抗乳血清和脂相。事實上，這是鈣離子結(jié)合酪蛋白將它們的白色賦予了奶。一旦沉淀，它們不再能夠?qū)⑺鼈兊念伾x予奶。
[0055]因此，本發(fā)明的方法具有幾個優(yōu)點:第一，容易實現(xiàn)，這是由于其允許通過簡單的實施分離感興趣的蛋白，此外，它允許在非脂水性相中回收感興趣的蛋白，且具有很好的產(chǎn)量。有利的，本發(fā)明的提取方法獲得的產(chǎn)量至少為50%、或者至少60%、或者至少80%。特別有利的，產(chǎn)量為至少90%。
[0056]該方法還允許獲得含有感興趣蛋白的非脂水相，其適宜于實現(xiàn)另外的純化步驟，尤其是層析法步驟。
[0057]最終，由于本發(fā)明方法的步驟是在不改變它們的生物活性的pH下實施的，感興趣的蛋白仍具有生物活性。pH優(yōu)選為堿性，例如大約8。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的可溶性鹽是指在奶中至少具有0.5份鹽每份奶(w/w)的溶解度的鹽。
[0059]有利的，方法中所使用的可溶性鹽是磷酸鹽。該鹽可以是水溶液，其隨后被加入到奶中，或是粉狀的，其被直接加入到奶中。
[0060]優(yōu)選的，該磷酸鹽選自由磷酸鈉、磷酸鋰、磷酸鉀、磷酸銣和磷酸銫組成的組，而特定的，是磷酸鈉。
[0061]可選的，在本發(fā)明方法中所使用的可溶性鹽可以是堿金屬草酸鹽，特別是草酸鈉或鉀，或堿金屬碳酸鹽，特別是碳酸鈉或鉀，或其的混合物。
[0062]有利的，為實施方法而制備的可溶性鹽在水溶液中的濃度在IOOmM到3M之間，更優(yōu)選的，在200mM到500mM之間，特別的，在200mM到300mM之間。
[0063]因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，本發(fā)明的可溶性鹽是磷酸鈉，其在水溶液中的濃度在IOOmM到3M之間，更優(yōu)選的，在200mM到500mM之間，特別的，在200mM到300mM之間。
[0064]含有要提取的感興趣蛋白的奶可以是原始的全奶或脫脂奶。對脫脂奶采用本發(fā)明方法的優(yōu)勢在于其脂質(zhì)含量較低。該方法同樣可以應(yīng)用于新鮮的或冰凍過的奶。
[0065]步驟b)允許分離脂相中的液相以及含有蛋白的水性非脂相，優(yōu)選的是通過離心實現(xiàn)的。非脂水相實際上是抗乳血清。該分離步驟同時還可以分離酪蛋白膠粒狀亞基的聚合體以及鈣化合物的沉淀物。
[0066]含有蛋白的水性非脂相從脂相中分離。
[0067]有利的，該方法允許獲得清澈的水性非脂相。
[0068]而且，該方法能包括接著步驟c)的用孔隙度逐漸減小的過濾器對水性非脂相連續(xù)過濾的步驟，孔隙度優(yōu)選的為I μ m，接著是0.45 μ m。這些過濾器的使用，例如玻璃纖維基礎(chǔ)的，可以減少仍可能存在的脂類、脂肪球以及自然存在于奶中的磷脂的含量?？紫抖刃∮?.5 μ m的過濾器可以保持非脂水相以及隨后執(zhí)行純化的載體(超濾器，層析柱等)(見此后)的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量。脂相優(yōu)選的通過這些能完全保留奶中脂肪球的過濾器過濾，濾出液是清澈的。
[0069]這一步驟可以接著通過超濾的濃縮/透析的步驟。
[0070]濃縮允許減少非脂水相的體積以便于保存。超濾膜根據(jù)所感興趣蛋白的特征由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。通常，空隙尺寸小于或等于感興趣蛋白的分子量的孔隙度限制可以在沒有顯著損失的情況下濃縮產(chǎn)品。例如，空隙尺寸為50kDa的膜可以無損失地濃縮分子量為 50kDa 的 FVI10
[0071]透析意在為了接下來的純化步驟，尤其是層析法，調(diào)節(jié)含有蛋白的水相。透析也可以去除小分子量的組分，例如乳糖、鹽、肽、朊間質(zhì)一蛋白胨以及任何會破壞產(chǎn)品保藏的試劑。
[0072]優(yōu)選的，透析緩沖液是(λ 025M到(λ 050M、pH7.5到8.5的磷酸鈉溶液。
[0073]步驟c)之后，或者如果可能，在過濾和/或濃縮/透析步驟之后獲得的非脂水相可以冰凍并存放于_30°C，直到對其實施進(jìn)一步的純化步驟。
[0074]本發(fā)明的方法允許用這種方式，從奶中的以靜電相互作用結(jié)合到蛋白的鈣離子中提取并分離一種或多種感興趣的蛋白。
[0075]蛋白可以是自然存在于奶中的蛋白，表示例如為乳球蛋白、乳鐵蛋白、α-乳清蛋白、免疫球蛋白或者蛋白胨，或者它們的混合物。
[0076]蛋白也可以是非自然存在于奶中的蛋白。例如，因子νπ、因子珊、因子IX、因子X、α-1抗胰蛋白酶因子、抗凝血酶II1、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓鞘堿性蛋白、胰島素原、纖溶酶原組織激活劑et抗體。
[0077]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，含有感興趣蛋白的奶是轉(zhuǎn)基因奶。
[0078]事實上，由于重組DNA技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因，非自然存在于奶中的蛋白能通過非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物合成。
[0079]這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，允許在轉(zhuǎn)基因動物的奶中合成任何感興趣的蛋白。
[0080]這樣的蛋白是通過轉(zhuǎn)基因DNA技術(shù)合成的重組或轉(zhuǎn)基因蛋白，這兩個術(shù)語在本申請中被認(rèn)為是等同的。
[0081]《轉(zhuǎn)基因動物》指的是具有合并到其基因組的外生DNA片段的任何非人類動物，該外生DNA片段尤其是指能編碼感興趣蛋白的DNA片段。該動物表達(dá)編碼蛋白的外生DNA，且易于傳送外生DNA到其產(chǎn)物中。
[0082]照此，任何非人類哺乳動物適合于生產(chǎn)這樣的奶。
[0083]有利的，可以使用雌性的兔、綿羊、山羊、牛、豬和老鼠。上述列舉是非限制性的。
[0084]感興趣的蛋白從乳腺分泌，允許該分泌物進(jìn)入轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中，意味著用組織依賴性方法來控制重組蛋白的表達(dá)。
[0085]這控制方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。對表達(dá)的組織控制的執(zhí)行是由于允許導(dǎo)向特定動物組織進(jìn)行蛋白表達(dá)的序列。這些序列就是啟動子序列和肽信號序列。
[0086]本領(lǐng)域公知的啟動子的例子是WAP啟動子(乳清酸蛋白)、酪蛋白啟動子、β_乳球蛋白啟動子，此處列舉不是限制性的。
[0087]在轉(zhuǎn)基因動物奶中重組蛋白的生產(chǎn)方法可以包括下列步驟:合成DNA分子包含編碼感興趣蛋白的基因，該基因由天然分泌蛋白到奶中的啟動子控制，該合成DNA分子被整合到非人類的哺乳動物胚胎中。之后，胚胎被置于同種的雌性哺乳動物中。一旦從該胚胎中獲得的哺乳動物發(fā)育充分，誘導(dǎo)該哺乳動物進(jìn)入哺乳期，收集奶。然后，該奶中含有感興趣的蛋白。
[0088]在非人類的雌性哺乳動物的奶中制備蛋白的方法示例在ΕΡ0527063中進(jìn)行了描述，該教導(dǎo)可以作為本發(fā)明感興趣蛋白生產(chǎn)的參考。
[0089]含有WAP啟動子的血漿通過引入包含WAP基因啟動子的序列而制備，該血漿制備成能夠接受置于依賴WAP啟動子之下的外來基因。編碼感興趣蛋白的基因被整合，并被置于依賴WAP啟動子之下。含有該啟動子和編碼感興趣蛋白的基因的血漿用來通過顯微注射到兔雄原核中而獲得轉(zhuǎn)基因雌兔。之后，胚胎被轉(zhuǎn)移至通過激素制備的雌性的輸卵管中。轉(zhuǎn)基因的存在通過對從所獲得的轉(zhuǎn)基因幼兔中提取的DNA的Southern雜交來顯示。動物奶中的濃度通過專門的放射免疫學(xué)檢測進(jìn)行評估。
[0090]有利的，根據(jù)本發(fā)明的方法從奶中生產(chǎn)的和提取的蛋白是凝血蛋白或者凝血因子。實際上，這些蛋白表現(xiàn)出與鈣離子很強的親和性是已知的(Hibbard et al.(1980), J.Biol.Chem.1980, Jan25; 255 (2):638-645)0根據(jù)本發(fā)明的一個特殊方面，在本發(fā)明的提取過程中，凝血因子被活化了。它可以是一種尤其是蛋白《維生素K依賴》的物質(zhì)，其為血液凝固的關(guān)鍵因子。
[0091]有利的，根據(jù)本發(fā)明的方法從奶中生產(chǎn)的和提取的蛋白是含有《GLA域》的能固定鈣離子的蛋白，或者含有《EDF域》(類表皮生長因子)或者更多的具有固定鈣離子能力的域的蛋白，例如《main EF))結(jié)構(gòu)(可以固定鈣離子的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu))。
[0092]此外，鈣依賴蛋白也是易于通過本發(fā)明的方法純化的蛋白，尤其是抗體或單克隆抗體。
[0093]有利的，本發(fā)明的蛋白選自由因子II (FII)、因子VD(FVII)、因子IX(FIX)、因子X(FX)、以及它們的活化形式、蛋白C、活化蛋白C、蛋白S和蛋白Z組成的組，或者上述的混合物。
[0094]特別有利的，本發(fā)明的蛋白是FVII或者活化的FVII (FVIIa)。
[0095]在這一方面，可以根據(jù)EP0527063的教導(dǎo)生產(chǎn)FVII或FVIIa，該方法的概述在上文中已經(jīng)給出。序列為人類FVII的序列的DNA片段被置在WAP啟動子的控制下。例如，這樣的DNA序列如EP0200421中序列表1b所列。[0096]有利的，本發(fā)明的FVII是活化的。活體中，F(xiàn)VIIa由在兩條由二硫鍵連接的鏈上用不同蛋白酶(FIXa，F(xiàn)Xa，F(xiàn)VIIa)對酶原的裂解形成。FVIIa自身具有非常低的酶活性，但是與其輔助因子，組織因子(TF)復(fù)合后，其通過活化FX和FIX而觸發(fā)凝血過程。
[0097]FVIIa在與組織因子(TF)相互作用上表現(xiàn)出比FVII大25到100倍的凝血活性。
[0098]在本發(fā)明的一個實施例中，F(xiàn)VII可以在體外通過因子Xa，Vila, Ila，IXa和XIIa活化。
[0099]本發(fā)明的FVII也可以在其提純過程中被活化。
[0100] 申請人:驚奇的注意到感興趣的蛋白即使置于抗乳血清中天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的啟動子，例如WAP啟動子，的控制下，其仍然易與奶中的鈣離子結(jié)合，從而與酪蛋白膠粒結(jié)合。
[0101]因此，本發(fā)明的方法能用于分離在抗乳血清蛋白啟動子的控制下產(chǎn)生的重組蛋白。
[0102]而且，本發(fā)明的方法特別適用于在酪蛋白啟動子控制下生產(chǎn)的重組蛋白的分離。[0103]蛋白也可以選自由因子珊、α-1抗胰蛋白酶因子、抗凝血酶II1、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓鞘堿性蛋白、胰島素原、纖溶酶原組織激活劑、和抗體組成的組，或者上述的混合物。
[0104]本發(fā)明的方法也可以用于重組乳蛋白的制備。這種情況下，其為不同種類動物的乳腺中合成的乳蛋白(Simons and al, (1987)，Aug6_12; 328 (6130): 530-532)。為了這一目的，舉例提及了轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白、乳球蛋白、溶菌酶和/或乳清蛋白。
[0105]本發(fā)明的另一目的涉及一種奶中的水性非脂相，該奶含有至少一種易于通過本發(fā)明的方法獲得的蛋白。有利的，水性相是高鹽、堿性的，且含有可溶性酪蛋白和至少一種另外的感興趣蛋白。高鹽優(yōu)選指的是濃度為至少7g/l的鈉離子、或者至少18g/l的氯化鈉、或者至少0.3mol的氯化鈉。優(yōu)選的，濃度為大約8g/l的鈉離子、或者大約為20g/l的氯化鈉。堿性指的是pH在8到9之間，優(yōu)選高于7.8?？扇苄岳业鞍妆硎局辽?5%的酪蛋白，更優(yōu)選的指的是至少50%的酪蛋白。
[0106]與沒有進(jìn)行這樣方法步驟的奶相比，這樣的用于純化的相中含有至少50%或者優(yōu)選的至少60%到80%的所有感興趣蛋白。特別有利的，水性非脂相中包含至少90%的存在于提取前的奶中的所有蛋白。
[0107]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，存在與水性非脂相中的感興趣蛋白是因子VII(FVII)或者活化的因子VII (FVIIa)。
[0108]本發(fā)明的水性非脂相，即使其不再含有酪蛋白膠束以及不溶性鈣化合物，然而其仍然包括大部分的雜質(zhì)。因此，有必要依靠各自情況，繼續(xù)對水相中的蛋白進(jìn)行純化。
[0109]而且，本發(fā)明的方法可以包括接下來的對包含蛋白或者感興趣蛋白的水性非脂相的純化步驟，該水性非脂相在步驟c)后獲得，或者在步驟c)后的過濾和濃縮/透析之后獲得。
[0110]因此，步驟c)之后是使用標(biāo)準(zhǔn)層析設(shè)備的親和層析步驟d)，有利的在具有羥磷灰石膠(Caltl(PO4)6(OH)2)或者氟磷灰石(Caltl(PO4)6F2)膠的載體的層析柱上實施。這樣水性非脂相中的蛋白被留在載體上，大部分的未保留的乳蛋白被除去。通過在波長(λ)為280nm處的吸收測量進(jìn)行檢測。
[0111]優(yōu)選的，使用的層析柱與基于0.025M到0.035M磷酸鈉、pH7.5到8.5的水性緩沖液A相平衡。水性非脂相被注入到能夠保留感興趣蛋白的柱上。未保留部分通過緩沖液A的浸透而去除，直到回到基線(RBL)來保證對如乳蛋白這樣不期望的化合物進(jìn)行良好的去除。
[0112]蛋白的洗提用基于磷酸鹽的緩沖液以預(yù)定濃度進(jìn)行進(jìn)行，例如磷酸鈉或鉀或其混合，優(yōu)選的為基于0.25M到0.35M、pH7.5到8.5的磷酸鈉緩沖液B。被洗提的部分被收集直至RBL (回到基線)。
[0113]由于這一步驟，超過90%的所有乳蛋白被去除，而超過90%的感興趣的蛋白被回收。在這一步，該洗提部分中的純度約為5%。
[0114]純度定義為感興趣蛋白與被考慮的樣品、部分或洗提液中存在的所有蛋白的重量比例。
[0115]有利的，蛋白的特異活性作為感興趣蛋白對層析載體的親和力的結(jié)果從因子10增加到25。
[0116]有利的，對由步驟d)所得到的洗提液進(jìn)行切向過濾。切向過濾膜由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)感興趣蛋白的特性選擇。一般而言，孔隙尺寸比感興趣蛋白的分子量大兩倍的孔隙度可以對其進(jìn)行過濾。例如，孔隙尺寸為IOOkDa的膜可以對FVII進(jìn)行過濾，并有好的產(chǎn)量。
[0117]這一步過濾的目的是減少尤其是分子量大于感興趣蛋白的蛋白質(zhì)的量，特別的來去除感興趣蛋白的非典型形式(例如聚合形態(tài)的蛋白)，以及在一定時間后易于降解感興趣蛋白的蛋白酶。
[0118]優(yōu)選的，對獲得的過濾過的洗提液進(jìn)行濃縮和透析。用于通過超濾進(jìn)行濃縮/透析步驟的合適系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)行過描述。
[0119]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，方法包括至少一個用于純化感興趣的蛋白的離子交換層析步驟，以及特別的兩個連續(xù)的離子交換層析步驟。這優(yōu)選的允許去除保留的乳蛋白。
[0120]離子交換劑以及平衡、沖洗和洗提緩沖液的選擇取決于要純化蛋白的性質(zhì)。
[0121]該步驟可以直接在步驟c)后實施，可選的，在親和層析和/或切向過濾步驟之后實施。
[0122]優(yōu)選的，至少一步和兩步層析步驟為陰離子交換層析。更優(yōu)選的，該陰離子交換層析采用弱堿性層析載體實現(xiàn)。通過在波長(λ)為280nm處的吸收測量進(jìn)行檢測。
[0123]第二個層析步驟意在限制蛋白的可能的蛋白酶降解。
[0124]例如，在對從水性非脂相中獲得的因子VII進(jìn)行第一次層析步驟中，使用Q-Sepharose? FF膠型層析載體，在其上保留因子VII。為了獲得中間純度的因子VII的洗提液，使用基于0.05M Tris以及優(yōu)選的0.020M到0.05M氯化鈣的pH7.0到8.0的水性洗提緩沖液，該中間純度即純度為25%到75%。
[0125]FVII的洗提液可以進(jìn)一步進(jìn)行如前面所述的透析步驟，使用0.15到0.20M氯化鈉溶液緩沖液。
[0126]第二次層析步驟可以在Q-Sepharose? FF膠型層析載體上進(jìn)行，例如可以用于
對前一步驟獲得的因子VII洗提液進(jìn)行純化，該洗提液可選的進(jìn)行稀釋以允許其能被再次吸收，因子VII被保留在載體上。使用基于優(yōu)選的0.05M Tris以及優(yōu)選的0.005M氯化鈣的pH7.0到8.0的水性洗提緩沖液，以洗提因子VII的高純部分，即純度高于90%。
[0127]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，方法包括在兩次陰離子交換層析步驟之后進(jìn)行的第三次陰離子層析步驟。該步驟允許制備富含蛋白的合成物，以適用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。更優(yōu)選的，所述第三次陰離子層析采用弱堿性層析載體。通過在波長(λ)為280nm處的吸收測量進(jìn)行檢測。
[0128]例如，將稀釋后的第二次陰離子交換層析步驟獲得的洗提液注入到到充滿能保留因子VII的Q-Sepharose_? FF型載體的柱中。用組成為優(yōu)選的0.02MTris和0.20-0.30M
氯化鈉、PH6.5-7.5的水性緩沖液對保留在載體上的因子VII進(jìn)行洗提。
[0129]因此，在陰離子交換膠上進(jìn)行的三次層析步驟允許更進(jìn)一步的純化感興趣的蛋白。此外，它們允許感興趣蛋白的合成物的濃縮和配制。
[0130]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，當(dāng)要純化的感興趣蛋白為凝血因子時，三個在陰離子交換劑載體上進(jìn)行的層析步驟中的至少一個允許活化全部或部分凝血因子。有利的，第一次層析允許凝血因子的純化。
[0131]最終的洗提液一經(jīng)回收，對該洗提液可以進(jìn)行在0.22 μ m過濾器上進(jìn)行的過濾步驟、容器內(nèi)的分裝步驟，然后冷凍至_30°C并在該溫度下保存。
[0132]本發(fā)明的方法也可包括下列步驟中的至少一個:配制、病毒滅活和滅菌。通常來說，方法可以包括在親和層析之前進(jìn)行的抗病毒處理步驟，有利的，該步驟使用導(dǎo)致包膜病毒失活的溶劑/洗滌劑進(jìn)行，特別的含有Tween? 80 (l%w/v)和TnBP (tr1-n-磷酸丁酯)(0.3%v/v,)的混合物。 此外，對從第二次在陰離子交換柱上的層析步驟獲得的洗提液優(yōu)選地進(jìn)行一次納米過濾來有效地消除病毒，特別是非包膜病毒，例如細(xì)小病毒B19。使用ASAHIPLANOVAtmI5過濾器來截留大小大于15nm的病毒是可能的。
[0133]發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢將通過以下例子進(jìn)行描述，它們意在闡述而不是限制本發(fā)明的范圍。
【具體實施方式】
[0134]下面的實施例闡述了利用本發(fā)明的提取和純化方法，從轉(zhuǎn)基因雌兔的奶中制備活化的因子VII (FVIIa)的濃縮物的應(yīng)用(FVI1-tg:轉(zhuǎn)基因FVII)。
[0135]從5個雌性Fl (初始譜系的第二代)的初乳中獲得原奶。根據(jù)FVII抗原(FVI1:Ag)在乳分泌物中的比例選擇雌性。STAGO (ASSERACHROM VII)允許從D04到D25 (D:產(chǎn)奶日)的初乳中追求人類VII的含量。對于雌性來說這一分泌相對穩(wěn)定(188和844IU/ml之間的VII)，這依賴于雌性和采集天數(shù)。
[0136]例如，選擇的純化方法允許從500ml原奶中純化12mg的FVII_tg。純化的總產(chǎn)量是 22%。
[0137]根據(jù)非還原條件下進(jìn)行的SDS-PAGE電泳分析，該濃縮物是純凈的。即雙硫鍵被保留，且在還原條件下表現(xiàn)出重鏈和輕鏈的完全分裂。這導(dǎo)致在方法中完全轉(zhuǎn)化成活化的FVII (FVIIa)。
[0138]實施例1:從奶中提取FVII
[0139]取500ml全原奶，用9倍體積的0.25M，pH8.2的磷酸鈉緩沖液稀釋。室溫下攪拌30分鐘后，富含F(xiàn)VII的水相在15°C下1000Og離心I小時(離心機Sorvall Evolution RC 一6700rpm —轉(zhuǎn)子SLC-6000)。6罐約為835ml是必需的。
[0140]離心后，存在三個相:一脂相在表層(乳脂)，一非脂水性清澈富含F(xiàn)VII的相(主要相)以及一白色顆粒狀固相(不溶性酪蛋白和鈣化合物沉淀)。
[0141]含有FVII的非脂水相通過蠕動泵收集直至脂相。脂相單獨回收。固相(沉淀)被去除。
[0142]然而，非脂水相仍然含有非常少量的脂質(zhì)，其在一系列過濾器上過濾(PallSLK7002U010ZP 一孔徑為I μ m的玻璃纖維預(yù)濾器一之后Pall SLK7002NXP 一孔徑為
0.45 μ m的尼龍66)。在過濾的最后，脂相通過該過濾系列，其完全截留了奶中的脂肪球，濾出液是清澈的。
[0143]過濾過的非脂水相接著在超濾膜上進(jìn)行透析(Millipore Biomax50kDa - 0.1m2)以使其適合層析階段。分子量約為50kDa的FVII不濾過該膜，不像奶中的鹽、糖以及肽。第一時間內(nèi)，溶液(約5000ml)被濃縮到500ml,接著通過維持這個恒定體積的超濾膜透析可以去除電解質(zhì)以及使該生物材料適于層析步驟。透析緩沖液是0.025M的磷酸鈉緩沖液，pH8.2。
[0144]含有FVII的非脂水相可以被吸收到富含F(xiàn)VI1-tg的抗乳血清中。該制備物在后繼處理前被保存于_30°C。
[0145]這步的FVII的總回收率非常令人滿意:90% (用磷酸鹽提取91 %+透析/濃縮99%)。
[0146]包含F(xiàn)VII的非脂水相在這步的最后完全清澈，并適于后續(xù)層析步驟。
[0147]大約93000IU的FVI1-tg在這一步被提取。在這一步制備中的FVII的純度在0.2%的級別。
[0148]實施例2 =FVIIa的純化方法
[0149]1.羥磷灰石膠上的層析
[0150]Amicon90柱(直徑9cm —橫截面64cm2)充滿BioRad陶瓷羥磷灰石I型(CHT — I)膠。吸收測量在波長(X)為280nm處進(jìn)行。
[0151]該膠用水性緩沖液A平衡，A包含0.025M磷酸鈉和0.04氯化鈉的混合物，pH8.0。存于-30°C的所有制備物用水浴在37°C解凍，直到冰塊完全溶解，接著注入到膠上(直線流動速率100cm/h，即105ml/min)。未保留的部分利用含有0.025M磷酸鈉和0.04M氯化鈉、PH8.2的緩沖液的經(jīng)過而去除，直到回到基線(RBL)。
[0152]含有FVI1-tg部分用含有0.25M磷酸鈉和0.4M氯化鈉的、pH8.0的緩沖液B實施洗提。洗提部分被收集，直到回到基線。
[0153]該層析可以回收超過90%的FVI1-tg，同時消除超過95%的乳蛋白。該特異活性(S.A.)增加了 25倍。在這一步，可獲得約85000IU、純度為4%的FVI1-tg。
[0154]2.1OOkDa切向討濾以及50kDa濃縮/誘析
[0155]前一步驟中所有的洗提液在IOOkDa超濾膜(Pall OMEGA SClOOK - 0.1m2)的切向模式下過濾。FVII濾過IOOkDa的膜，同時分子量超過IOOkDa的蛋白不能濾過。
[0156]之后,濾過的部分被濃縮到約500ml,接著在50kDa的已在實施例1中描述了的超濾器上透析。透析緩沖液使用0.15M的氯化鈉。[0157]在這階段的處理中，產(chǎn)品在進(jìn)行離子交換層析前被保存于_30°C。
[0158]這一階段可以減少分子量超過IOOkDa蛋白的量，并且特別的是酶前體。在IOOkDa膜上的處理可以截留留約50%的蛋白，其中為高分子量蛋白，同時濾過95%的FVI1-tg，為82000IU 的 FVI1-tg。
[0159]該處理可以減少后續(xù)步驟中的蛋白酶水解的風(fēng)險。
[0160]3.在Q-Sepharose? FF 膠上的層析
[0161]這連續(xù)三步在離子交換膠Q-Sepharose? Fast Flow (QSFF)上進(jìn)行的層析是為
了純化有效成分，以允許FVII活化為活化的FVII(FVIIa)，以及最終濃縮并制備為FVII合成物。對化合物的檢測通過λ=280ηπι處的吸收測量而進(jìn)行。
[0162]3^ Q-Sepharose? FFl 步一洗提《高鈣》
[0163]一直徑 2.6cm (橫截面 5.3cm2)的柱用 100ml Q-Sepharose? FF 膠(GEHealthcare)填充。
[0164]該膠用0.05M, pH7.5的Tris緩沖液平衡。
[0165]保存于-30°C的整個部分在37°C水浴中解凍，直到所有冰塊都溶解。在注入到膠之前(流速13ml/min，即直線速度150cm/h)，該部分用平衡緩沖液稀釋到l/2[v/v]，未保留部分隨后隨緩沖液的通過去除，直到RBL。
[0166]具有低FVII含量的第一蛋白部分被0.05M的Tris和0.15M氯化鈉、pH7.5的緩沖液以9ml/min (即100cm/h)洗提而被去除。
[0167]第二富含F(xiàn)VII的蛋白部分被0.05M的Tris和0.05M氯化鈉和0.05M氯化鈣、pH7.5的緩沖液以9ml/min (即100cm/h)洗提。檢測通過λ =280nm處的吸收測量而進(jìn)行
[0168]該第二部分在50kDa的在實施例1中已描述過的超濾器上進(jìn)行透析。該透析緩沖液是0.15M氯化鈉。該部分在第二次通過陰離子交換層析前在夜間被存儲于+4°C。
[0169]這一步可以回收73%的FVII (即60000IU的FVI1-tg)，同時消除80%的結(jié)合蛋白。它同時允許FVII活化成FVIIa。
[0170]3^2 Q-Sepharose? FF2 步一洗提《低韓》
[0171]一直徑2.5cm(橫截面4.9cm2)的柱用 30ml Q-Sepharose? FF膠(GE Healthcare)填充。
[0172]該膠用0.05M, pH7.5的Tris緩沖液平衡。
[0173]之前存儲于+4°C的洗提部分(第二部分)在注入到膠(9ml/min，即直線流速100cm/h)之前被稀釋。
[0174]在注入第二部分后，該膠用平衡緩沖液沖洗以去除未保留的部分。
[0175]含有很高純度FVII的部分被0.05M的Tris和0.05M氯化鈉和0.005M氯化鈣、pH7.5的緩沖液以4.5ml/min (即50cm/h)洗提。
[0176]約23000IU 的 FVI1-tg 被純化，即 12mg 的 FVI1-tg。
[0177]這一步可以消除超過95 %的結(jié)合蛋白(雌兔奶中的蛋白)。
[0178] 該洗提液，純度高于90%，表現(xiàn)出接近天然人類FVII分子的結(jié)構(gòu)與功能特征。其在第三次通過離子交換層析時被濃縮和制備。[0179]3.3 O-Sepharose? FF3 步一《鈉》洗提
[0180]一直徑 2.5cm (橫截面 4.9cm2)的柱用 IOml Q-Sepharose? FF 膠(GEHealthcare)填充。
[0181]該膠用0.05M，pH7.5的Tris緩沖液平衡。
[0182]前一步驟中洗提的、純化的部分在注入到膠上(流速4.5ml/min，即直線速度50cm/h)前用注射用純水(PWI)稀釋五倍。
[0183]在注入所述部分后，該膠用平衡緩沖液沖洗以去除未保留的部分。
[0184]之后，F(xiàn)VI1-tg被0.02M的Tris和0.28M氯化鈉、pH7.0的緩沖液以3ml/min (即36cm/h)洗提。
[0185]FVI1-tg濃縮物被制備，純度高于95%。該產(chǎn)品適于靜脈注射。該方法累積產(chǎn)量為22%，每升所使用的奶可以純化至少20mg的FVII。
[0186]表A概括了按照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的處理步驟，并提供了在每一步后獲得的產(chǎn)量，純度以及比活性。
[0187]表A
[0188]
【權(quán)利要求】
1.提取存在于奶中的至少一種蛋白的方法，所述蛋白表現(xiàn)出與所述奶中復(fù)合的或非復(fù)合的鈣離子的親和性，包括如下步驟: a)通過將奶與可溶性鹽接觸產(chǎn)生鈣化合物沉淀而釋放蛋白，以通過這種方法獲得蛋白富集的液相，該可溶性鹽的陰離子選擇具有在這種介質(zhì)中形成不溶性鈣化合物的能力的陰離子； b)將蛋白富集的液相與鈣化合物沉淀分離，而且，所述液相被分離成脂相和包含蛋白的水性非脂相；以及 c)回收含有蛋白的水性非脂相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中可溶性鹽是磷酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中磷酸鹽選自由磷酸鈉、磷酸鋰、磷酸鉀、磷酸銣和磷酸銫組成的組，而特別的， 是磷酸鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中可溶性鹽是堿金屬草酸鹽，特別是鈉或鉀的草酸鹽，或堿金屬碳酸鹽，特別是鈉或鉀的碳酸鹽，或上述的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一的方法，其中可溶性鹽在水溶液中的濃度在IOOmM到3M之間，更優(yōu)選的，在200mM到500mM之間，特別的，在200mM到300mM之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一的方法，其中步驟b)通過離心實現(xiàn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一的方法，包括在步驟c)之后的用孔隙度逐漸減小的過濾器對水性非脂相連續(xù)過濾的步驟，孔隙度優(yōu)選的為I μ m、接著是0.45 μ m,接著是濃縮步驟/超濾透析步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一的方法，其中對脂相用孔隙度逐漸減小的過濾器進(jìn)行過濾，孔隙度優(yōu)選為I μ m、接著是0.45 μ m。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一的方法，其中蛋白是非自然存在于奶中的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一的方法，其中奶是轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物奶。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中哺乳動物選自雌性的兔、綿羊、山羊、牛、豬和鼠。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是凝血蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中蛋白選自由因子I1、因子VI1、因子IX、因子X、以及它們的活化形式、蛋白C、活化蛋白C、蛋白S和蛋白Z組成的組，或者是上述的混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是含有GLA域、EGF域(類表皮生長因子)或者具有固定鈣離子能力的另外的域。
15.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是維生素K依賴性蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是鈣依賴蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白選自由因子珊、α-l抗胰蛋白酶因子、抗凝血酶II1、白蛋白、纖維蛋白原、胰島素、髓鞘堿性蛋白、胰島素原、纖溶酶原組織激活劑和抗體組成的組，或者上述的混合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一所述的方法，其中蛋白是轉(zhuǎn)基因乳鐵蛋白、乳球蛋白、溶菌酶和/或乳清蛋白。
19.奶中的水性非脂相，其特征在于其是高鹽、堿性的，且含有可溶性酪蛋白和至少一種另外的蛋白，易于通過權(quán)利要求1-18中任一所述的方法獲得。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一所述的方法，其中在步驟c)之后進(jìn)行親和層析步驟d)，用基于磷酸鹽的緩沖液以預(yù)定的濃度對蛋白進(jìn)行洗提。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中親和層析在載體為羥磷灰石膠(Ca10(PO4)6(OH)2)或者氟磷灰石(Caltl(PO4)6F2)膠的層析柱上實施。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中，對步驟d)中獲得的洗提液進(jìn)行切向過濾。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一所述的方法，包括在步驟c)之后直接進(jìn)行的至少一步離子交換層析，且特別的，是兩步連續(xù)的離子交換層析。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中至少一步和兩步層析是陰離子交換層析。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，包括在兩步陰離子交換層析之后的第三次陰離子交換層析步驟。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-25中任一所述的方法，包括在親和層析之前的通過溶劑/洗滌劑進(jìn)行的抗病毒處理步驟。
27.根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一所述的方法，其中對從第二次陰離子交換層析步驟獲得的洗提液進(jìn)行納米過濾步驟。
【文檔編號】C07K1/22GK103910779SQ201410138470
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2007年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2006年5月31日
【發(fā)明者】阿蘭·勒雅爾, 米歇爾·諾格雷, 米歇爾·泰利耶 申請人:Lfb生物科技公司