一種小牛血去蛋白提取物組合物及其注射劑和制法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小牛血去蛋白提取物的制法，包括如下步驟：a)緩化；b)酸沉；c)低溫冷凍、升溫溶解、離心，取上清液；d)堿沉；e)重復c)步驟；f)將步驟e)的上清液醇沉、離心，取上清液；g)將步驟f)的上清液超濾、真空濃縮，得濃縮超濾液；h)將步驟g)的濃縮超濾液超濾，收集超濾液，即得。本發(fā)明所提供的制法，既不破壞生物活性、又不引入外源離子、能有效去除其中雜蛋白；由該小牛血去蛋白提取物制得的注射劑，不會引發(fā)過敏反應，安全度高，能有效治療腦中風、腦外傷、腦功能不全及腦癡呆等腦細胞代謝障礙性疾病，改善細胞氧含量和微循環(huán)；注射劑的制備方法，能充分保證最終產品的質量穩(wěn)定性和安全度，保證制劑的藥用效果，消除現有制劑的副作用。
【專利說明】一種小牛血去蛋白提取物組合物及其注射劑和制法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，特別涉及一種小牛血去蛋白提取物及其注射劑和制法。 技術背景
[0002] 小牛血去蛋白提取物水針劑，曾用名：血活素注射液，系由新鮮小牛血或血清經去 蛋白、濃縮、超濾或透析等工藝制得的含有無機物及小分子有機物的滅菌水溶液?？稍鰪娊M 織細胞對氧及葡萄糖攝取與利用，改善細胞乏氧狀態(tài)和機體內環(huán)境，增加心、腦、肝等臟器 的血流量，改善微循環(huán)。用于腦缺血、腦癡呆、腦外傷及大腦功能不全等腦細胞代謝障礙性 疾病的治療。目前，已公開了一些有關小牛血去蛋白提取物的制備工藝，多數工藝采用乙醇 沉淀、酶解、高溫、酸堿等方法去除雜蛋白，也有用柱層析除雜的方法。這些方法都存在去除 蛋白不完全的問題，臨床使用時會由于雜蛋白未有效去除而發(fā)生不良反應，其中的有機物 類物質如氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等發(fā)生聚合為大分子物質而易引起過敏反應；而且酶 解、高溫、酸堿等方法去除雜蛋白時，還存在破壞其中原有的生物活性、降低其藥用價值的 缺點；另外，酸堿法去除雜蛋白還會引入外源離子，這都會降低其藥用價值；另外，由于工 藝重現性不好，而難以大規(guī)模生產。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種既不破壞生物活性、又不引入外源離子、能有效去除其 中雜蛋白的的小牛血去蛋白提取物的制法，及由該小牛血去蛋白提取物制得的注射劑及制 法。
[0004] 本發(fā)明的小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0005] a)將小牛血在30-40°C緩化20min，得緩化后的小牛血；
[0006] b)向步驟a)得到的緩化后的小牛血中加入鹽酸溶液進行酸沉，調整pH至3. 5? 4.0,得酸化后的小牛血；所述鹽酸溶液是純化水與質量分數為36%?38%的鹽酸按照 1:1的體積比配制的；
[0007] c)將步驟b)得到的酸化后的小牛血在_25°C下低溫冷凍24h，然后再以1°C /min 的升溫速度升溫至60°C，并60°C恒溫lh，待冷凍后的小牛血融化后，在離心機轉速為15000 轉/分鐘的情況下進行離心分離12min，收集上清液，備用；
[0008] d)向步驟C)得到的上清液中加入質量分數為20%的NaOH溶液，調節(jié)pH值至 8. 0?8. 5,得堿化后的上清液；
[0009] e)將步驟d)得到的堿化后的上清液在-20°c下低溫冷凍24h，然后再以1°C /min 的升溫速度升溫至40°C，并40°C恒溫lh，待冷凍后的小牛血融化后，在離心機轉速為13000 轉/分鐘的情況下進行離心分離，收集上清液，備用；
[0010] f)將步驟e)得到的上清液置于配液罐內，在70r/min的攪拌速度下，按照上清液 與乙醇溶液的體積比為1 : 2的比例，緩慢加入質量分數為80%的乙醇溶液，在離心機轉速 為13000轉/分鐘的情況下進行離心分離，收集上清液，備用；
[0011] g)將步驟f)得到的上清液用截流分子量為5000道爾頓的超濾柱進行超濾，所 得超濾液在真空度為-〇. lMPa、60°C恒溫下進行真空濃縮，濃縮至體積為原超濾液體積的 1/15,得濃縮超濾液；
[0012] h)將步驟g)得到的濃縮超濾液用截流分子量為5000道爾頓的超濾柱進行超濾， 收集超濾后的液體，然后置于配液罐中在70r/min的攪拌速度下混合30min，即得小牛血去 蛋白提取物。
[0013] 步驟c)、e)對小牛血進行冷凍、融化的循壞，可以促使細胞內外的有效物質充分 釋放，不破壞有效成分的生物活性、保證有效成分的充分提??；步驟c)以1°C /min的升溫 速度升溫至60°C，并60°C恒溫lh，對冷凍的小牛血進行融化，不僅可以有效地、完全地去 除其中的雜蛋白，而且不會破壞有效成分的生物活性，同時具有殺菌作用，能對牛源性病毒 充分滅活，保證了小牛血去蛋白提取物的安全性；步驟e)以1°C /min的升溫速度升溫至 40°C，并40°C恒溫lh，可以進一步去除雜蛋白，滅活牛源性病毒；步驟f)中進一步用乙醇以 一定的比例對步驟b)得到的上清液進行混合，進一步去除雜蛋白，充分保證了雜蛋白去除 的完全性；超濾柱的使用，進一步保證了雜蛋白去除的完全性。
[0014] 本發(fā)明的小牛血去蛋白提取物的制備方法，不僅能有效地、完全地去除其中的雜 蛋白，而且不會破壞有效成分的生物活性，同時具有殺菌作用，能對牛源性病毒充分滅活， 保證了小牛血去蛋白提取物的安全性；另外工藝重現性好，利于大規(guī)模生產。
[0015] 由本發(fā)明的的制備方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射劑，包括粉針劑和 水針劑。
[0016] 為了方便存放和運輸，將由本發(fā)明的的制備方法制得的小牛血去蛋白提取物制成 粉針劑和水針劑，存放和攜帶方便，便于運輸。
[0017] 本發(fā)明的注射劑為粉針劑，粉針劑包括下列重量份的原料：
[0018] 小牛血去蛋白提取物4000
[0019] 凍干保護劑 200
[0020] 注射用水 4000，
[0021] 所述凍干保護劑是由海藻糖與PEG以3 : 1的重量份數比組成。
[0022] 凍干保護劑的加入，可有效保證最終的凍干劑中活性成分的生物活性，特別是海 藻糖與PEG以3 : 1的重量份數比作為凍干保護劑，在保證有效保證最終的凍干劑中活性 成分的生物活性的同時，也具有穩(wěn)定作用，使最終制得的凍干劑生物活性高、性質穩(wěn)定。
[0023] 本發(fā)明的注射劑為水針劑，水針劑包括下列重量份的原料：
[0024] 小牛血去蛋白提取物600
[0025] 注射用水 400。
[0026] 本發(fā)明的注射劑的制備方法，包括如下步驟：
[0027] a)準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用；
[0028] b)濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度大于等于1. 0560補加注 射用水進行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對小牛血去蛋白提取物進行 預濾，然后再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對小牛血去蛋白提取物進行超濾至稀配 罐中，得濃配液，備用；
[0029] c)稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1. 0260?1. 0560補加 注射用水進行稀配，得稀配液，備用；
[0030] d)向步驟c)得到的稀配液中添加10%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6. 8?7. 3， 攪拌lOmin至均勻，取樣檢測，得澄明度合格的稀配液；
[0031] e)向步驟d)得到的澄明度合格的稀配液中，邊攪拌邊加入海藻糖與PEG，混合均 勻，然后經0. 22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得除菌稀配液；
[0032] f)將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin，得處理后的除 菌稀配液；
[0033] g)灌裝：將清洗滅菌后的緩沖罐與硅膠管、陶瓷泵、灌裝針頭、分藥器、膠塞震蕩 器用無菌操作法連接安裝到灌裝機上，對步驟f)得到的處理后的除菌稀配液進行灌裝，得 灌裝稀配液；
[0034] h)凍干：將步驟g)得到的灌裝稀配液置于凍干機內進行凍干，得注射劑，即粉針 劑。
[0035] 對小牛血去蛋白提取物先濃配后稀配，得到的最終產品中，小牛血去蛋白提取物 分散均勻，最終產品質量穩(wěn)定；滅菌處理可以保證最終產品的安全性；制備方法工藝簡單， 工藝可重復性好，利于大規(guī)模生產。
[0036] 現有的小牛血去蛋白提取物藥物，患者使用后易出現興奮、睡眠質量差等副作用， 本發(fā)明在制備小牛血去蛋白提取物的粉針劑過程中，通過對制備工藝的改進，解決了該技 術問題，防止了患者使用后易出現興奮、睡眠質量差等副作用。其對制備工藝的改進是：在 步驟f)中，將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin。
[0037] 優(yōu)選地，本發(fā)明的注射劑的制備方法，步驟e)中，除菌過濾器上、下游壓力的壓差 不超過〇. 〇8Mpa。
[0038] 在這個參數設置范圍內，可以有效保證除菌效果，保證最終產品的安全性。
[0039] 優(yōu)選地，本發(fā)明的注射劑的制備方法，步驟f)中，灌裝過程每30分鐘抽檢裝量一 次，每個針頭抽檢2支，罐裝量為3. 95?4. 05ml/支。
[0040] 可以有效地保證最終產品的質量，保證其安全性和穩(wěn)定性。
[0041] 優(yōu)選地，本發(fā)明的注射劑的制備方法，步驟g)中，凍干過程的干燥設置如下：
[0042] 冷凍控制：設定導熱油溫度_45°C?-50°C，持續(xù)時間90分鐘；設定導熱油溫 度-10°c持續(xù)時間15分鐘；設定導熱油溫度-45°c?-50°c，持續(xù)時間180分鐘；
[0043] 后箱預冷：設定后箱溫度為-45°C?-50°C ;
[0044] 預抽真空：設定干燥箱預抽真空度為0. 15mPa ;
[0045] 升華干燥：
[0046] 設定干燥箱真空度為0. 10?0. 30mPa，導熱油溫度為-15°C，持續(xù)時間840分鐘；
[0047] 設定干燥箱真空度為0. 10?0. 30mPa，導熱油溫度為-10°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0048] 設定干燥箱真空度為0. 10?0. 30mPa，導熱油溫度為-5°c，持續(xù)時間180分鐘；
[0049] 設定干燥箱真空度為0. 10?0. 30mPa，導熱油溫度為0°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0050] 解析干燥：
[0051] 設定干燥箱真空度為0. 10?0. 30mPa，導熱油溫度為5°C，持續(xù)時間120分鐘；
[0052] 設定干燥箱真空度為0. 10?0. 30mPa，導熱油溫度為15°C，持續(xù)時間120分鐘；
[0053] 設定干燥箱真空度為0. 05mPa，導熱油溫度為36°C，持續(xù)時間360分鐘。
[0054] 凍干過程中各個階段的溫度設置對凍干的效果影響很大，如上的設置可保證小牛 血去蛋白提取物的生物活性和制劑的凍干效果，保證最終產品的質量。
[0055] 本發(fā)明的注射劑的制備方法，包括如下步驟：
[0056] a)準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用；
[0057] b)濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度大于等于1. 0260補加注 射用水進行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對補加注射水后的小牛血去 蛋白提取物溶液進行預濾，然后再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對其進行超濾至稀 配罐中，攪拌l〇min至均勻，得濃配液，備用；
[0058] c)稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1. 0242?1. 0260補加 注射用水進行稀配，得稀配液，備用；
[0059] d)向步驟c)得到的稀配液中添加5%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6. 7?7. 1，攪 拌lOmin至均勻，取樣檢測，得合格的稀配液；
[0060] e)將步驟d)得到的合格的稀配液，經0.22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得 除菌稀配液；
[0061] f)將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin，得處理后的除 菌稀配液；
[0062] g)灌裝：將清洗滅菌后的硅膠管、陶瓷泵、灌封針頭、分液器在A級保護下用無菌 操作法連接安裝到灌封機上，對步驟f)得到的處理后的除菌稀配液進行灌裝，得灌裝稀配 液；
[0063] h)滅菌：用推板將步驟g)得到的灌裝稀配液，足夠緊湊的裝入周轉盤中，把周轉 盤整齊裝滿滅菌車，進行滅菌，得注射劑，即水針劑。
[0064] 對小牛血去蛋白提取物先濃配后稀配，得到的最終產品中，小牛血去蛋白提取物 分散均勻，最終產品質量穩(wěn)定；滅菌處理可以保證最終產品的安全性；制備方法工藝簡單， 工藝可重復性好，利于大規(guī)模生產。
[0065] 現有的小牛血去蛋白提取物藥物，患者使用后易出現興奮、睡眠質量差等副作用， 本發(fā)明在制備小牛血去蛋白提取物的粉針劑過程中，通過對制備工藝的改進，解決了該技 術問題，防止了患者使用后易出現興奮、睡眠質量差等副作用。其對制備工藝的改進是：在 步驟f)中，將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin。
[0066] 優(yōu)選地，本發(fā)明的注射劑的制備方法，步驟g)中，滅菌條件為115°C、30分鐘。
[0067] 在這種滅菌條件設置下，對水針劑的滅菌效果最好，產品的穩(wěn)定性和安全度高。
[0068] 本發(fā)明的有益效果為：
[0069] 本發(fā)明所提供的小牛血去蛋白提取物的制法，既不破壞生物活性、又不引入外源 離子、能有效去除其中雜蛋白；由該小牛血去蛋白提取物制得的注射劑，不會引發(fā)過敏反 應，安全度高，能有效治療腦中風、腦外傷、腦功能不全及腦癡呆等腦細胞代謝障礙性疾病， 改善細胞氧含量和微循環(huán)；注射劑的制備方法，能充分保證最終產品的質量穩(wěn)定性和安全 度，保證制劑的藥用效果，防止患者使用后出現興奮、睡眠質量差等副作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0070] 圖1為對照組耳緣靜脈組織照片（X 200倍）；
[0071] 圖2為給藥組耳緣靜脈組織照片（X 200倍）。

【具體實施方式】
[0072] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明：
[0073] 實施例1小牛血去蛋白提取物的制法
[0074] -種小牛血去蛋白提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0075] a)將小牛血在35°C緩化20min，得緩化后的小牛血；
[0076] b)向步驟a)得到的緩化后的小牛血中加入鹽酸溶液進行酸沉，調整pH至4. 0,得 酸化后的小牛血；所述鹽酸溶液是純化水與質量分數為37%的鹽酸按照1 : 1的體積比配 制的；
[0077] c)將步驟b)得到的酸化后的小牛血在_25°C下低溫冷凍24h，然后再以1°C /min 的升溫速度升溫至60°C，并60°C恒溫lh，待冷凍后的小牛血融化后，在離心機轉速為15000 轉/分鐘的情況下進行離心分離12min，收集上清液，備用；
[0078] d)向步驟c)得到的上清液中加入質量分數為20%的NaOH溶液，調節(jié)pH值至 8. 0?8. 5,得堿化后的上清液；
[0079] e)將步驟d)得到的堿化后的上清液在_20°C下低溫冷凍24h，然后再以1°C /min 的升溫速度升溫至40°C，并40°C恒溫lh，待冷凍后的小牛血融化后，在離心機轉速為13000 轉/分鐘的情況下進行離心分離，收集上清液，備用；
[0080] f)將步驟e)得到的上清液置于配液罐內，在70r/min的攪拌速度下，按照上清液 與乙醇溶液的體積比為1 : 2的比例，緩慢加入質量分數為80%的乙醇溶液，在離心機轉速 為13000轉/分鐘的情況下進行離心分離，收集上清液，備用；
[0081] g)將步驟f)得到的上清液用截流分子量為5000道爾頓的超濾柱進行超濾，所 得超濾液在真空度為-〇. lMPa、60°C恒溫下進行真空濃縮，濃縮至體積為原超濾液體積的 1/15,得濃縮超濾液；
[0082] h)將步驟g)得到的濃縮超濾液用截流分子量為5000道爾頓的超濾柱進行超濾， 收集超濾后的液體，然后置于配液罐中在70r/min的攪拌速度下混合30min，即得小牛血去 蛋白提取物。
[0083] 實施例2粉針劑
[0084] 處方：
[0085] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0086] 凍干保護劑 200g
[0087] 注射用水 4000g
[0088] 所述凍干保護劑是由海藻糖與PEG以3 : 1的重量份數比組成；
[0089] 制法：
[0090] a)準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用；
[0091] b)濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度1. 0560補加注射用水進 行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對小牛血去蛋白提取物進行預濾，然后 再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對小牛血去蛋白提取物進行超濾至稀配罐中，得濃 配液，備用；
[0092] c)稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1.0260補加注射用水 進行稀配，得稀配液，備用；
[0093] d)向步驟c)得到的稀配液中添加10%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.8,攪拌 lOmin至均勻，取樣檢測，得澄明度合格的稀配液；
[0094] e)向步驟d)得到的澄明度合格的稀配液中，邊攪拌邊加入海藻糖與PEG，混合均 勻，然后經0. 22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得除菌稀配液；所述除菌過濾器上、下 游壓力的壓差為〇· 〇8Mpa ;
[0095] f)將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin，得處理后的除 菌稀配液；
[0096] g)灌裝：將清洗滅菌后的緩沖罐與硅膠管、陶瓷泵、灌裝針頭、分藥器、膠塞震蕩 器用無菌操作法連接安裝到灌裝機上，對步驟e)得到的處理后的除菌稀配液進行灌裝，得 灌裝稀配液；灌裝過程每30分鐘抽檢裝量一次，每個針頭抽檢2支，罐裝量為4. 00ml/支；
[0097] h)凍干：將步驟f)得到的灌裝稀配液置于凍干機內進行凍干，得凍干劑；凍干過 程中干燥設置如下：
[0098] 冷凍控制：設定導熱油溫度_45°C，持續(xù)時間90分鐘；設定導熱油溫度-10°C持續(xù) 時間15分鐘；設定導熱油溫度-45°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0099] 后箱預冷：設定后箱溫度為_45°C ;
[0100] 預抽真空：設定干燥箱預抽真空度為0. 15mPa ;
[0101] 升華干燥：
[0102] 設定干燥箱真空度為0. lOmPa，導熱油溫度為-15°C，持續(xù)時間840分鐘；
[0103] 設定干燥箱真空度為0. lOmPa，導熱油溫度為-10°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0104] 設定干燥箱真空度為0. lOmPa，導熱油溫度為-5°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0105] 設定干燥箱真空度為0. lOmPa，導熱油溫度為0°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0106] 解析干燥：
[0107] 設定干燥箱真空度為0. lOmPa，導熱油溫度為5°C，持續(xù)時間120分鐘；
[0108] 設定干燥箱真空度為0. lOmPa，導熱油溫度為15°C，持續(xù)時間120分鐘；
[0109] 設定干燥箱真空度為0. 05mPa，導熱油溫度為36°C，持續(xù)時間360分鐘。
[0110] 實施例3粉針劑
[0111] 處方：
[0112] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0113] 凍干保護劑 200g
[0114] 注射用水 4000g
[0115] 所述凍干保護劑是由海藻糖與PEG以3 : 1的重量份數比組成；
[0116] 制法：
[0117] a)準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用；
[0118] b)濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度1. 0580補加注射用水進 行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對小牛血去蛋白提取物進行預濾，然后 再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對小牛血去蛋白提取物進行超濾至稀配罐中，得濃 配液，備用；
[0119] c)稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1.0560補加注射用水 進行稀配，得稀配液，備用；
[0120] d)向步驟c)得到的稀配液中添加10%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至7.3,攪拌 lOmin至均勻，取樣檢測，得澄明度合格的稀配液；
[0121] e)向步驟d)得到的澄明度合格的稀配液中，邊攪拌邊加入海藻糖與PEG，混合均 勻，然后經0. 22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得除菌稀配液；所述除菌過濾器上、下 游壓力的壓差為〇· 〇6Mpa ;
[0122] f)將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin，得處理后的除 菌稀配液；
[0123] g)灌裝：將清洗滅菌后的緩沖罐與硅膠管、陶瓷泵、灌裝針頭、分藥器、膠塞震蕩 器用無菌操作法連接安裝到灌裝機上，對步驟e)得到的處理后的除菌稀配液進行灌裝，得 灌裝稀配液；灌裝過程每30分鐘抽檢裝量一次，每個針頭抽檢2支，罐裝量為4. 00ml/支；
[0124] h)凍干：將步驟f)得到的灌裝稀配液置于凍干機內進行凍干，得凍干劑；凍干過 程中干燥設置如下：
[0125] 冷凍控制：設定導熱油溫度_50°C，持續(xù)時間90分鐘；設定導熱油溫度-10°C持續(xù) 時間15分鐘；設定導熱油溫度-50°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0126] 后箱預冷：設定后箱溫度為-50°C ;
[0127] 預抽真空：設定干燥箱預抽真空度為0. 15mPa ;
[0128] 升華干燥：
[0129] 設定干燥箱真空度為0. 30mPa，導熱油溫度為-15°C，持續(xù)時間840分鐘；
[0130] 設定干燥箱真空度為0. 30mPa，導熱油溫度為-10°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0131] 設定干燥箱真空度為0. 30mPa，導熱油溫度為_5°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0132] 設定干燥箱真空度為0. 30mPa，導熱油溫度為0°C，持續(xù)時間180分鐘；
[0133] 解析干燥：
[0134] 設定干燥箱真空度為0. 30mPa，導熱油溫度為5°C，持續(xù)時間120分鐘；
[0135] 設定干燥箱真空度為0. 30mPa，導熱油溫度為15°C，持續(xù)時間120分鐘；
[0136] 設定干燥箱真空度為0. 05mPa，導熱油溫度為36°C，持續(xù)時間360分鐘。
[0137] 對照實施例1粉針劑
[0138] 處方：
[0139] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0140] 注射用水 4000g
[0141] 制法：
[0142] 除步驟e)為"將步驟d)得到的澄明度合格的稀配液，經0. 22μπι筒式除菌過濾器 過濾至緩沖罐，得除菌稀配液"不同于實施例2中的步驟e)，其余步驟均與實施例2相同。
[0143] 對照實施例2粉針劑
[0144] 處方：
[0145] 小牛血去蛋白提取物4000g
[0146] 凍干保護劑 200g
[0147] 注射用水 4000g
[0148] 所述凍干保護劑是由海藻糖與PEG以3 : 1的重量份數比組成；
[0149] 制法：
[0150] 除不含有實施例2中的步驟f)，S卩"將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的 紫外線照射lmin，得處理后的除菌稀配液"，其余步驟均于實施例2相同。
[0151] 實施例4水針劑的制法
[0152] 粉針劑的制法，包括如下步驟：
[0153] a)準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用；
[0154] b)濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度1. 0260補加注射用水進 行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對補加注射水后的小牛血去蛋白提取 物溶液進行預濾，然后再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對其進行超濾至稀配罐中，攪 拌lOmin至均勻，得濃配液，備用；
[0155] c)稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1.0242補加注射用水 進行稀配，得稀配液，備用；
[0156] d)向步驟c)得到的稀配液中添加 5%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6. 7,攪拌 lOmin至均勻，取樣檢測，得合格的稀配液；
[0157] e)將步驟d)得到的合格的稀配液，經0.22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得 除菌稀配液；
[0158] f)灌裝：將清洗滅菌后的硅膠管、陶瓷泵、灌封針頭、分液器在A級保護下用無菌 操作法連接安裝到灌封機上，對步驟e)得到的除菌稀配液進行灌裝，得灌裝稀配液；
[0159] g)滅菌：用推板將步驟f)得到的灌裝稀配液，足夠緊湊的裝入周轉盤中，把周轉 盤整齊裝滿滅菌車，進行滅菌，即得水針劑；滅菌條件為115°C、30分鐘。
[0160] 實施例5水針劑的制法
[0161] 粉針劑的制法，包括如下步驟：
[0162] a)準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用；
[0163] b)濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度1. 0280補加注射用水進 行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對補加注射水后的小牛血去蛋白提取 物溶液進行預濾，然后再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對其進行超濾至稀配罐中，攪 拌lOmin至均勻，得濃配液，備用；
[0164] c)稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1.0260補加注射用水 進行稀配，得稀配液，備用；
[0165] d)向步驟c)得到的稀配液中添加5%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至7.1，攪拌 lOmin至均勻，取樣檢測，得合格的稀配液；
[0166] e)將步驟d)得到的合格的稀配液，經0.22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得 除菌稀配液；
[0167] f)灌裝：將清洗滅菌后的硅膠管、陶瓷泵、灌封針頭、分液器在A級保護下用無菌 操作法連接安裝到灌封機上，對步驟e)得到的除菌稀配液進行灌裝，得灌裝稀配液；
[0168] g)滅菌：用推板將步驟f)得到的灌裝稀配液，足夠緊湊的裝入周轉盤中，把周轉 盤整齊裝滿滅菌車，進行滅菌，即得水針劑；滅菌條件為115°C、30分鐘。
[0169] 為說明這一情況，現通過試驗例進一步說明本發(fā)明的效果如下：
[0170] 試驗例1過敏試驗
[0171] 1.試驗對象：
[0172] 豚鼠，雄性18只，體重250_350g，黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
[0173] 隨機平均分成三組，分別為給藥組6只、生理鹽水組6只、陽性對照組6只，按無菌 操作。
[0174] 2.試驗方法：
[0175] 給藥組：隔日腹腔注射本發(fā)明的小牛血去蛋白提取物0. 5ml/只；首次注射后的第 14天，隨機選取其中的3只，靜脈注射本發(fā)明的小牛血去蛋白提取物lml/只；首次注射后 的第21天，取剩余的3只，靜脈注射本發(fā)明的小牛血去蛋白提取物lml/只；
[0176] 生理鹽水組：隔日腹腔注射生理鹽水0. 5ml/只；首次注射后的第14天，隨機選取 其中的3只，靜脈注射生理鹽水lml/只；首次注射后的第21天，取剩余的3只，靜脈注射生 理鹽水lml/只；
[0177] 陽性對照組：隔日腹腔注射1%新鮮雞蛋清溶液各0. 5ml/只；首次注射后的第14 天，隨機選取其中的3只，靜脈注射1 %新鮮雞蛋清溶液；首次注射后的第21天，取剩余的3 只，靜脈注射1 %新鮮雞蛋清溶液lml/只；
[0178] 觀察過敏反應現象，按表1進行過敏反應分級。
[0179] 表1豚鼠過敏反應級數
[0180]

【權利要求】
1. 一種小牛血去蛋白提取物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟： a) 將小牛血在30-40°C緩化20min，得緩化后的小牛血； b) 向步驟a)得到的緩化后的小牛血中加入鹽酸溶液進行酸沉，調整pH至3. 5?4. 0， 得酸化后的小牛血；所述鹽酸溶液是純化水與質量分數為36%?38%的鹽酸按照1 : 1的 體積比配制的； c) 將步驟b)得到的酸化后的小牛血在-25°C下低溫冷凍24h，然后再以1°C /min的升 溫速度升溫至60°C，并60°C恒溫lh，待冷凍后的小牛血融化后，在離心機轉速為15000轉/ 分鐘的情況下進行離心分離12min，收集上清液，備用； d) 向步驟c)得到的上清液中加入質量分數為20%的NaOH溶液，調節(jié)pH值至8. 0? 8. 5,得堿化后的上清液； e) 將步驟d)得到的堿化后的上清液在-20°C下低溫冷凍24h，然后再以1°C /min的升 溫速度升溫至40°C，并40°C恒溫lh，待冷凍后的小牛血融化后，在離心機轉速為13000轉/ 分鐘的情況下進行離心分離，收集上清液，備用； f) 將步驟e)得到的上清液置于配液罐內，在70r/min的攪拌速度下，按照上清液與乙 醇溶液的體積比為1 : 2的比例，緩慢加入質量分數為80%的乙醇溶液，在離心機轉速為 13000轉/分鐘的情況下進行離心分離，收集上清液，備用； g) 將步驟f)得到的上清液用截流分子量為5000道爾頓的超濾柱進行超濾，所得超濾 液在真空度為-0. lMPa、60°C恒溫下進行真空濃縮，濃縮至體積為原超濾液體積的1/15,得 濃縮超濾液； h) 將步驟g)得到的濃縮超濾液用截流分子量為5000道爾頓的超濾柱進行超濾，收集 超濾后的液體，然后置于配液罐中在70r/min的攪拌速度下混合30min，即得小牛血去蛋白 提取物。
2. 由權利要求1所述的制備方法制得的小牛血去蛋白提取物制得的注射劑，其特征在 于，所述注射劑包括粉針劑和水針劑。
3. 根據權利要求2所述的注射劑，其特征在于，所述注射劑為粉針劑，所述粉針劑包括 下列重量份的原料： 小牛血去蛋白提取物4000 凍干保護劑 200 注射用水 4000， 所述凍干保護劑是由海藻糖與PEG以3 : 1的重量份數比組成。
4. 根據權利要求2所述的注射劑，其特征在于，所述注射劑為水針劑，所述水針劑包括 下列重量份的原料： 小牛血去蛋白提取物600 注射用水 400。
5. 根據權利要求3所述的注射劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步 驟： a) 準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用； b) 濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度大于等于1. 0560補加注射用 水進行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對小牛血去蛋白提取物進行預濾， 然后再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對小牛血去蛋白提取物進行超濾至稀配罐中， 得濃配液，備用； c) 稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1. 0260?1. 0560補加注射 用水進行稀配，得稀配液，備用； d) 向步驟c)得到的稀配液中添加10%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6. 8?7. 3,攪拌 lOmin至均勻，取樣檢測，得澄明度合格的稀配液； e) 向步驟d)得到的澄明度合格的稀配液中，邊攪拌邊加入海藻糖與PEG，混合均勻，然 后經0. 22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得除菌稀配液； f) 將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin，得處理后的除菌稀 配液； g) 灌裝：將清洗滅菌后的緩沖罐與硅膠管、陶瓷泵、灌裝針頭、分藥器、膠塞震蕩器用 無菌操作法連接安裝到灌裝機上，對步驟f)得到的處理后的除菌稀配液進行灌裝，得灌裝 稀配液； h) 凍干：將步驟g)得到的灌裝稀配液置于凍干機內進行凍干，得注射劑，即粉針劑。
6. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟e)中，所述除菌過濾器上、 下游壓力的壓差不超過〇· 〇8Mpa。
7. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟f)中，灌裝過程每30分鐘 抽檢裝量一次，每個針頭抽檢2支，罐裝量為3. 95?4. 05ml/支。
8. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟g)中，所述凍干過程的干燥 設置如下： 冷凍控制：設定導熱油溫度_45°C?-50°C，持續(xù)時間90分鐘；設定導熱油溫度-10°C 持續(xù)時間15分鐘；設定導熱油溫度-45°C?-50°C，持續(xù)時間180分鐘； 后箱預冷：設定后箱溫度為_45°C?-50°C ; 預抽真空：設定干燥箱預抽真空度為〇. 15mPa ; 升華干燥： 設定干燥箱真空度為〇. 10?〇. 30mPa，導熱油溫度為-15°C，持續(xù)時間840分鐘； 設定干燥箱真空度為〇. 10?〇. 30mPa，導熱油溫度為-10°C，持續(xù)時間180分鐘； 設定干燥箱真空度為〇. 10?〇. 30mPa，導熱油溫度為-5°C，持續(xù)時間180分鐘； 設定干燥箱真空度為〇. 10?〇. 30mPa，導熱油溫度為0°C，持續(xù)時間180分鐘； 解析干燥： 設定干燥箱真空度為〇. 10?〇. 30mPa，導熱油溫度為5°C，持續(xù)時間120分鐘； 設定干燥箱真空度為〇. 10?〇. 30mPa，導熱油溫度為15°C，持續(xù)時間120分鐘； 設定干燥箱真空度為〇. 〇5mPa，導熱油溫度為36°C，持續(xù)時間360分鐘。
9. 根據權利要求4所述的注射劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步 驟： a) 準備配液容器：用注射用水將配液容器沖洗干凈，備用； b) 濃配：稱取處方量的小牛血去蛋白提取物，按相對密度大于等于1. 0260補加注射用 水進行濃配，用截流分子量為5000道爾頓的中空纖維柱對補加注射水后的小牛血去蛋白 提取物溶液進行預濾，然后再用截流分子量為5000道爾頓的膜片對其進行超濾至稀配罐 中，攪拌lOmin至均勻，得濃配液，備用； c) 稀配：向步驟b)中含有濃配液的稀配罐中，按相對密度1. 0242?1. 0260補加注射 用水進行稀配，得稀配液，備用； d) 向步驟c)得到的稀配液中添加5%的氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6. 7?7. 1，攪拌 lOmin至均勻，取樣檢測，得合格的稀配液； e) 將步驟d)得到的合格的稀配液，經0.22 μ m筒式除菌過濾器過濾至緩沖罐，得除菌 稀配液； f) 將步驟e)得到的除菌稀配液用波長為0. 3的紫外線照射lmin，得處理后的除菌稀 配液； g) 灌裝：將清洗滅菌后的硅膠管、陶瓷泵、灌封針頭、分液器在A級保護下用無菌操作 法連接安裝到灌封機上，對步驟f)得到的處理后的除菌稀配液進行灌裝，得灌裝稀配液； h) 滅菌：用推板將步驟g)得到的灌裝稀配液，足夠緊湊的裝入周轉盤中，把周轉盤整 齊裝滿滅菌車，進行滅菌，得注射劑，即水針劑。
10. -種權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述步驟g)中，滅菌條件為115°C、 30分鐘。
【文檔編號】A61K9/19GK104147047SQ201410367957
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權日:2014年7月30日
【發(fā)明者】姬彥峰 申請人:哈爾濱圣泰生物制藥有限公司