腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/GB2006/000120、國際申請日為2006年1月 13日、進(jìn)入中國國家階段的申請?zhí)枮?00680005096. 4、名稱為"腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗"的發(fā) 明專利申請的分案申請。
[0002] 這里所引用的所有文獻(xiàn)全文納入作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及針對腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)的疫苗。具體地說， 本發(fā)明涉及基于偶聯(lián)的（conjugated)多種腦膜炎球菌血清群的莢膜糖的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0004] 基于生物的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定到12種腦膜炎奈瑟球菌（N. meningitidis)血清 群（A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。血清群A是非洲薩哈拉以南地區(qū)流行性疾病最 常見的病原體。血清群B和C引起美國和大多數(shù)發(fā)達(dá)國家的大多數(shù)病例。血清群W135和 Y引起美國和發(fā)達(dá)國家的其它病例。
[0005] 多年前就已經(jīng)知道由血清群A、C、Y和W135的莢膜多糖制成的四價(jià)疫苗[1，2]。 盡管這種疫苗對于青少年和承認(rèn)有效，但由于多糖是不依賴于T細(xì)胞的抗原，其誘導(dǎo)的弱 免疫應(yīng)答不能加強(qiáng)，因此它誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答弱、保護(hù)時(shí)間短，不能用于嬰兒[例如參考文獻(xiàn) 3]。這種疫苗中的多糖不是偶聯(lián)的[4]。
[0006] 血清群C的偶聯(lián)疫苗已批準(zhǔn)用于人類，其中包括Menjugate?[5]、Meningitec? 和NeisVac-C?。血清群A+C的偶聯(lián)物（conjugate)的混合物是已知的[6-8]，且血清群 A+C+W135+Y的偶聯(lián)物的混合物也已經(jīng)報(bào)道[9-13]。
[0007] 盡管腦膜炎球菌偶聯(lián)物是熟知的，但它們還不適用于兒科免疫接種計(jì)劃，發(fā)達(dá)國 家的兒科免疫接種計(jì)劃通常包括：出生時(shí)接種乙肝疫苗；從2個(gè)月時(shí)開始接種白喉/破傷 風(fēng)/百日咳（D-T-P)疫苗、b型流感嗜血桿菌（H. influenzae type b) (Hib)偶聯(lián)物、滅活 的脊髓灰質(zhì)炎病毒和肺炎球菌偶聯(lián)物。
[0008] 然而，當(dāng)將偶聯(lián)的疫苗加入現(xiàn)有免疫接種計(jì)劃時(shí)，必需解決載體誘導(dǎo)的表位抑制 (或者通常稱為"載體抑制"），尤其是載體初免（priming)造成的抑制。"載體抑制"是一 種由于用載體蛋白預(yù)先免疫動物從而阻止隨后引起針對該載體上呈遞的新抗原表位的免 疫應(yīng)答而造成的現(xiàn)象[14]。
[0009] 如參考文獻(xiàn)15所述，一些疫苗抗原含有相同的蛋白質(zhì)組分（用作免疫原和/或用 作偶聯(lián)物中的載體蛋白），因此那些抗原之間可能會發(fā)生干擾。在參考文獻(xiàn)15中，報(bào)道了對 偶聯(lián)破傷風(fēng)類毒素（Tt)載體的某抗原的免疫應(yīng)答受到先前存在的對Tt的免疫力的抑制。
[0010] 參考文獻(xiàn)16報(bào)道了 D-T-P疫苗與Hib偶聯(lián)疫苗的組合有何不利影響，因?yàn)镠ib偶 聯(lián)物的載體與D-T-P疫苗的破傷風(fēng)抗原是相同的。作者總結(jié)出，當(dāng)引入包含多種偶聯(lián)物的 疫苗時(shí)應(yīng)考慮這種由于通用蛋白質(zhì)載體的干擾而造成的"載體抑制"現(xiàn)象。
[0011] 與參考文獻(xiàn)15和16不同，參考文獻(xiàn)17報(bào)道了用破傷風(fēng)類毒素初免不會對針對隨 后給予的Hib-Tt偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答造成負(fù)面影響，但在帶有從母體獲得的抗-Tt抗體的患 者中觀察到抑制現(xiàn)象。然而在參考文獻(xiàn)18中報(bào)道了由于接種破傷風(fēng)疫苗而已經(jīng)具有抗-Tt 抗體的患者中的基于Tt的肽偶聯(lián)物的"表位抑制"效應(yīng)。
[0012] 在參考文獻(xiàn)19中提到，以CRM197 (白喉毒素的一種解毒突變體）作為載體的偶聯(lián) 物對于之前未接受白喉毒素作為疫苗一部分（例如作為D-T-P或D-T疫苗的一部分）的兒 童可能無效。參考文獻(xiàn)20繼續(xù)了該工作，在隨后用Hib偶聯(lián)物免疫時(shí)繼續(xù)觀察到D-T免疫 接種造成的載體初免效應(yīng)。
[0013] 在參考文獻(xiàn)21中，作者發(fā)現(xiàn)用白喉或破傷風(fēng)類毒素載體蛋白預(yù)先免疫降低了隨 后用與那些載體偶聯(lián)的Hib莢膜糖免疫接種后抗-Hib抗體水平的升高，但對IgGl和IgG2 的影響照舊。對偶聯(lián)物載體部分的反應(yīng)也被抑制。此外，觀察到更加常見的非表位特異性 抑制，即用一種偶聯(lián)物預(yù)先免疫似乎會影響針對4周后給予的第二種偶聯(lián)物的載體和糖部 分的免疫應(yīng)答。
[0014] 參考文獻(xiàn)22報(bào)道了在一種多價(jià)肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中采用不同載體蛋白，其中采 用多種載體是為了避免載體抑制。作者預(yù)測，多價(jià)偶聯(lián)疫苗中的最大載體蛋白負(fù)荷可使機(jī) 體產(chǎn)生耐受而不會引起負(fù)面干擾。參考文獻(xiàn)23報(bào)道，含有混合載體蛋白的肺炎球菌偶聯(lián)疫 苗在引起抗-肺炎球菌應(yīng)答反應(yīng)的同時(shí)也不經(jīng)意地增強(qiáng)了對載體的應(yīng)答反應(yīng)。
[0015] 參考文獻(xiàn)24研究了是否可與單價(jià)腦膜炎球菌血清群C偶聯(lián)物一起給予白喉和破 傷風(fēng)（類毒素）加強(qiáng)免疫，發(fā)現(xiàn)當(dāng)載體是破傷風(fēng)類毒素載體且患者之前已用含破傷風(fēng)類毒 素的疫苗免疫過時(shí)，產(chǎn)生的對腦膜炎球菌偶聯(lián)物的效價(jià)降低。
[0016] 最后，參考文獻(xiàn)25報(bào)道稱，"之前接觸載體蛋白能增強(qiáng)或抑制抗體對以糖-蛋白質(zhì) 偶聯(lián)物形式給予的多糖的反應(yīng)"。參考文獻(xiàn)25所用的偶聯(lián)物采用破傷風(fēng)類毒素或CRM197 突變體作為載體蛋白。
[0017] 與載體初免和/或抑制有關(guān)的情況使人非常困惑，還不清楚任何具體的偶聯(lián)物是 否將受到載體抑制的影響或?qū)⑹芤嬗谳d體初免而增強(qiáng)。除非這一問題得到解決，否則腦膜 炎球菌偶聯(lián)疫苗將不會被納入或加入現(xiàn)有兒童免疫計(jì)劃中。此外，由于給予的腦膜炎球菌 偶聯(lián)物為四價(jià)混合物（即四種不同偶聯(lián)物），因此載體抑制的可能性更加危險(xiǎn)。
[0018] 除了載體初免對糖類偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答有負(fù)面影響問題外，也可能發(fā)生相反的情 況，即用偶聯(lián)物免疫接種可能會對載體的免疫應(yīng)答產(chǎn)生負(fù)面影響[26]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 參考文獻(xiàn)27提到，用一種以上類型的載體蛋白應(yīng)該可以解決腦膜炎球菌偶聯(lián)疫 苗的載體抑制問題。具體地說，參考文獻(xiàn)27提到，流感嗜血桿菌蛋白D應(yīng)用作腦膜炎球菌 偶聯(lián)物的載體蛋白，同時(shí)也可使用破傷風(fēng)類毒素（Tt)。為避免表位抑制，蛋白D也是參考文 獻(xiàn)28的備選載體。類似地，參考文獻(xiàn)29提到，百日咳桿菌（Bordetella pertussis)的菌 毛應(yīng)用作載體以避免多價(jià)偶聯(lián)疫苗的載體抑制。相反，本發(fā)明采用破傷風(fēng)類毒素（Tt)作為 混合的腦膜炎球菌糖類偶聯(lián)物的載體。
[0020] 此外，參考文獻(xiàn)27還建議應(yīng)與D-T-P-Hib疫苗同時(shí)給予腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗（例 如見實(shí)施例3)，從而就沒有先接觸腦膜炎球菌偶聯(lián)物的載體蛋白的問題。相反，現(xiàn)在已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)，即便患者已經(jīng)接受載體蛋白，其形式為之前的免疫原（例如在D-T-P或D-T免疫接種 中）或之前的載體蛋白（例如在Hib偶聯(lián)物或肺炎球菌偶聯(lián)疫苗中），仍舊可以給予該患者 腦膜炎球菌偶聯(lián)物。之前對單價(jià)血清群C偶聯(lián)疫苗進(jìn)行的載體誘導(dǎo)的表位抑制研究[24] 不關(guān)心任何之前給予的偶聯(lián)物的影響。
[0021] 如同與參考文獻(xiàn)27相反的那樣，即使患者已接受了不同的偶聯(lián)物，仍能產(chǎn)生對腦 膜炎球菌偶聯(lián)物的免疫應(yīng)答，這與參考文獻(xiàn)21相反。
[0022] 因此，本發(fā)明提供了一種免疫患者以抵抗腦膜炎奈瑟球菌造成的疾病的方法，該 方法包括給予所述患者一種含有（a)、（b)、（c)和（d)中至少兩種物質(zhì)的組合物的步驟：(a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；(b) (i)血清群C腦 膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；（c) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟球 菌的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；以及（d) (i)血清群Y腦膜炎奈瑟球菌的莢膜 糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物，其中，所述患者已經(jīng)用（a)和/或（b)預(yù)先免疫過：(a) 破傷風(fēng)類毒素；(b) (i)除腦膜炎奈瑟球菌外的生物的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián) 物。
[0023] 本發(fā)明還提供了（a)、（b)、（c)和（d)中至少兩種物質(zhì)在制造用于免疫人類患者以 抵抗腦膜炎奈瑟球菌造成的疾病的藥物中的的應(yīng)用：(a) (i)血清群A腦膜炎奈瑟球菌的莢 膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；(b) (i)血清群C腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和（ii)破 傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物；（c) (i)血清群W135腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素 的偶聯(lián)物；以及（d) (i)血清群Y腦膜炎奈瑟球菌的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物， 其中，所述患者已經(jīng)用（a)和/或（b)預(yù)先免疫過：(a)破傷風(fēng)類毒素；(b) (i)除腦膜炎奈 瑟球菌外的生物的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物。
[0024] 腦膜炎球菌引起的疾病通常是腦膜炎，更通常是細(xì)菌性腦膜炎，最通常是腦膜炎 球菌性腦膜炎。因此，本發(fā)明可用于保護(hù)抵抗造成腦膜炎的腦膜炎球菌感染。
[0025] 預(yù)先免疫過的患者
[0026] 要免疫的患者已經(jīng)用（a)和/或（b)預(yù)先免疫過：（a)破傷風(fēng)類毒素；(b)⑴除腦 膜炎奈瑟球菌外的生物的莢膜糖和（ii)破傷風(fēng)類毒素的偶聯(lián)物。典型的預(yù)先免疫將通常 包括：破傷風(fēng)類毒素抗原；采用破傷風(fēng)類毒素載體的Hib莢膜糖偶聯(lián)物；和/或采用破傷風(fēng) 類毒素載體的肺炎球菌莢膜糖偶聯(lián)物。
[0027] 患者將已經(jīng)接受至少1次（例如1、2、3次或更多次）劑量的預(yù)先免疫抗原，且該 劑量（或多次劑量中最早的一次）已在用本發(fā)明的腦膜炎球菌偶聯(lián)物免疫前至少6(例如 6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多）個(gè)月時(shí)給予。在優(yōu)選的患者組 中，預(yù)先免疫在出生后3年內(nèi)進(jìn)行，例如在出生后2年內(nèi)、出生后1年內(nèi)、出生后6個(gè)月內(nèi)、 或者甚至出生后3個(gè)月內(nèi)、2個(gè)月內(nèi)或1個(gè)月內(nèi)。
[0028] 要用本發(fā)明免疫的患者通常是人。人的年齡通常為至少1個(gè)月，例如至少2個(gè)月、 至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少6個(gè)月、至少2歲、至少5歲、至少11歲、至少17歲、至少40 歲、至少55歲，等等，患者宜為至少6個(gè)月大。另一組優(yōu)選的患者年齡為2-55歲，另一組優(yōu) 選的患者年齡為11-55歲。再一組優(yōu)選的患者年齡為小于11歲，例如2-11歲。然而在所 有情況中，無論年齡如何，患者將已經(jīng)如上所述預(yù)先免疫過。
[0029] 患者將通常已經(jīng)接受過破傷風(fēng)類毒素，如D-T-P或D-T預(yù)先免疫接種中的'Τ'抗 原。這種免疫接種通常被給予2、3和4個(gè)月的新生兒。當(dāng)免疫接種包括百日咳疫苗時(shí)，該 疫苗可以是全細(xì)胞或細(xì)胞百日咳疫苗（"Pw"），但優(yōu)選非細(xì)胞百日咳疫苗（"Pa"）。預(yù)先 免疫接種Pa疫苗將通常包括1、2或3種以下熟知并充分表征的百日咳桿菌（B. pertussis) 抗原：（1)百日咳類毒素（'PT'），通過化學(xué)方法或通過定點(diǎn)誘變解毒，如'9K/129G'突變 體[30] ;(2)絲狀血凝素（'FHA'）；⑶黏附素（pertactin)(也稱為'69kDa外膜蛋白'）。 非細(xì)胞百日咳疫苗也可包含凝集原2和/或凝集原3。D-T-P預(yù)先免疫接種中的'D'抗原 通常是白喉類毒素。
[0030] 患者也可接受或者已經(jīng)接受破傷風(fēng)類毒素作為蛋白質(zhì)-糖類偶聯(lián)物的載體蛋白。 這種偶聯(lián)物包括'PRP-T' Hib偶聯(lián)物[見參考文獻(xiàn)31的表14-7]，例如ActHIB?、0mniHIBTM和HIBERIX?產(chǎn)品?；颊咭部梢呀?jīng)用血清群C腦膜炎球菌（'MenC'）偶聯(lián)物預(yù)先免疫過。 采用破傷風(fēng)類毒素載體的MenC偶聯(lián)物包括NeisVac-C?產(chǎn)品。然而優(yōu)選用Hib和/或肺炎 球菌偶聯(lián)物而不用MenC偶聯(lián)物預(yù)先免疫患者。如果已用MenC偶聯(lián)物預(yù)先免疫患者，則根 據(jù)本發(fā)明給予的疫苗可以包含或不含血清群C偶聯(lián)物。
[0031] 當(dāng)用偶聯(lián)的抗原預(yù)先免疫時(shí)，由于偶聯(lián)物有低水平污染（例如偶聯(lián)物在儲藏期間 發(fā)生水解），患者將不可避免地也接受少量游離的破傷風(fēng)類毒素，當(dāng)這種較小的量通常不足 以提供顯著的免疫應(yīng)答。
[0032] 破傷風(fēng)類毒素是一種熟知并充分表征的蛋白質(zhì)[例如見參考文獻(xiàn)31的第13章]， 可通過將破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani)產(chǎn)生的內(nèi)肽酶（'破傷風(fēng)毒素'）滅活得到。 可對這種毒素進(jìn)行處理以得到不再具有毒性但保留了抗原性因此能夠在注射后刺激產(chǎn)生 特定的抗-毒素抗體的類毒素。優(yōu)選的破傷風(fēng)類毒素是通過甲醛處理制得的?？墒蛊苽L(fēng) 梭菌（C.tetani)在生長培養(yǎng)基（例如衍生自牛酪蛋白的Latham培養(yǎng)基）中生長，然后通 過甲醛處理、超濾和沉淀以獲得破傷風(fēng)類毒素。然后用包括無菌過濾和/或透析的方法處 理該材料。術(shù)語'破傷風(fēng)類毒素'在文中包括保留了與破傷風(fēng)毒素的免疫交叉反應(yīng)性的破 傷風(fēng)類毒素的衍生物。
[0033] 預(yù)先免疫的結(jié)果為，患者的免疫系統(tǒng)已經(jīng)接觸過預(yù)先免疫抗原。這通常意味著患 者的抗-Tt抗體反應(yīng)將升高（抗-Tt效價(jià)通常將大于0. 01 IU/ml)并將產(chǎn)生特異于Tt的記 憶B細(xì)胞和/或T淋巴細(xì)胞，即預(yù)先免疫通常足以在患者中引起記憶性抗-Tt免疫應(yīng)答。當(dāng) 用Tt作為偶聯(lián)物中糖類的載體進(jìn)行預(yù)先免疫時(shí)，預(yù)先免疫將提高抗-糖類反應(yīng)，同時(shí)患者 將產(chǎn)生特異于糖類的記憶B細(xì)胞和/或T淋巴細(xì)胞，即預(yù)先免疫通常足以在患者中引起記 憶性抗-糖類免疫應(yīng)答。預(yù)先免疫宜足以在患者中引起例如分別針對破傷風(fēng)或針對含有糖 類的生物的保護(hù)性免疫力。
[0034] 因此，要按照本發(fā)明免疫的患者將不同于普通患者，他們屬于一小類免疫系統(tǒng)中 已產(chǎn)生對預(yù)先免疫抗原的免疫應(yīng)答的普通人群中的一元，因此，按照本發(fā)明用含有破傷風(fēng) 類毒素載體的腦膜炎球菌偶聯(lián)物免疫接種將在這一小類人群中產(chǎn)生與之前未產(chǎn)生對預(yù)先 免疫抗原的免疫應(yīng)答的患者不同的免疫應(yīng)答。優(yōu)選用Tt作為偶聯(lián)物（尤其是Hib偶聯(lián)物） 的載體預(yù)先免疫患者。特別優(yōu)選用Tt作為偶聯(lián)物的載體同時(shí)以Tt作為未偶聯(lián)的免疫原預(yù) 先免疫患者。
[0035] 除了可以用偶聯(lián)或非偶聯(lián)形式的破傷風(fēng)類毒素預(yù)先免疫，患者也可用其它抗原預(yù) 先免疫。這種抗原包括但不限于：百日咳抗原一見上文；白喉類毒素一見上文；B型流感嗜 血桿菌（Haemophilus influenzae type B) -見上文；乙肝表面抗原（HBsAg);脊髓