腦膜炎雙球菌組合物及其方法
【專利摘要】一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包含與SEQ ID NO:71具有至少95％相同性的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之ORF2086多肽，以及至少一種來自腦膜炎雙球菌血清群之綴合的莢膜糖。
【專利說明】腦膜炎雙球菌組合物及其方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及腦膜炎雙球菌（Neisseria meningitidis)組合物及其方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦膜炎雙球菌為一種可以引起敗血癥、腦膜炎及死亡之革蘭氏陰性莢膜細菌。腦 膜炎雙球菌基于化學上及抗原性上獨特之多糖莢膜而可分為約13個血清群（包括血清群 八、8、(：329、!1、1、1(、1^1-135、乂、￥及2)。其中五個血清群仏、8、(：、￥及1135)為大部分疾 病之成因。
[0003] 腦膜炎雙球菌性腦膜炎為一種毀滅性疾病，盡管可使用抗生素，但其可以在數(shù)小 時內(nèi)致使兒童及年輕成人死亡。需要針對腦膜炎雙球菌血清群A、B、C、Y及W135及/或X 之經(jīng)改良之免疫原性組合物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了滿足這些及其它需要，本發(fā)明涉及腦膜炎雙球菌組合物及其方法。
[0005] -方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括與SEQ ID NO:71具有至少95%相同 性之氨基酸序列，其中該序列的前二十個氨基酸殘基不含半胱氨酸。
[0006] 在一個實施方式中，所述分離的多肽包括SEQ ID N0:71之位置1至184之氨基酸 序列。
[0007] 在一個實施方式中，所述分離的多肽包括SEQ ID NO: 71之位置158至185之氨基 酸序列。在另一實施方式中，所述分離的多肽包括SEQ ID N0:71之位置159至186之氨基 酸序列。
[0008] 在一個實施方式中，所述分離的多肽包括SEQ ID NO: 71之位置185至254之氨基 酸序列中至少6個連續(xù)氨基酸。
[0009] 在一個實施方式中，所述分離的多肽系非丙酮酸化。
[0010] 在一個實施方式中，所述分離的多肽系非脂化。
[0011] 在一個實施方式中，所述分離的多肽具有免疫原性。
[0012] 在一個實施方式中，所述分離的多肽包括由SEQ ID N0:71中所示之序列組成的氨 基酸序列。
[0013] 一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括與SEQ ID N0:76具有至少95%相同 性之氨基酸序列，其中該序列的前二十個氨基酸殘基不含半胱氨酸。
[0014] 在一個實施方式中，所述分離的多肽包括氨基酸序列SEQ ID N0:76。
[0015] 在一個實施方式中，所述分離的多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76，其中位置1之 半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，所述分離的多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO: 76,其 中位置1之半胱氨酸由非Cys殘基之氨基酸取代。在一個實施方式中，所述分離的多肽包 括氨基酸序列SEQ ID NO:77。
[0016] 在一個實施方式中，所述分離的多肽系非丙酮酸化。在一個實施方式中，所述分離 的多肽系非脂化。在一個實施方式中，所述分離的多肽具有免疫原性。
[0017] 另一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包括如上述任何實施方式中之多 肽。另一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包括如本文所述之任何實施方式中之多 肽。
[0018] 一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核酸序列，其編碼由SEQ ID N0:71中所示之氨基 酸序列組成的分離的多肽。
[0019] 在一個實施方式中，所述分離的核酸序列包括SEQ ID N0:72。
[0020] -方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之 分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及至少一種選自以下之綴合物：a)腦膜炎雙 球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物；c)腦膜炎 雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0021] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括至少兩種選自以下之綴合物：a)腦 膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物；c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴 合物。
[0022] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括至少三種選自以下之綴合物：a)腦 膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物；c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴 合物。
[0023] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之 綴合物；腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物；腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之 綴合物；及腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0024] 在一個實施方式中，所述多肽為亞家族A多肽。
[0025] 在一個實施方式中，所述多肽為亞家族B多肽。
[0026] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之A05。
[0027] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之A12。
[0028] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之A22。
[0029] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之BOl。
[0030] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之B09。
[0031] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之B44。
[0032] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之B22。
[0033] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之B24。
[0034] 在一個實施方式中，所述多肽為非丙酮酸化且非脂化之A62。
[0035] 在一個實施方式中，所述多肽包括選自SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:71 及 SEQ ID N0:75 的氨基酸序列。在一 個實施方式中，所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID N0:77。
[0036] -方面，本發(fā)明涉及一種誘導哺乳動物針對腦膜炎雙球菌之免疫應答的方法。該 方法包括給該哺乳動物施用有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包括來自腦膜炎 雙球菌血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及選自以下之至少一種綴 合物：a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之 綴合物；c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之 莢膜糖之綴合物。
[0037] -方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物針對腦膜炎雙球菌血清群C之殺細菌性抗 體的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包 括來自腦膜炎雙球菌血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽。
[0038] 在一個實施方式中，該多肽由SEQ ID N0:71中所示之氨基酸序列或選自以下序列 的氨基酸序列組成：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21，其中 位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:76中所示之氨基 酸序列。在另一實施方式中，該多肽之位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，該 多肽包括SEQ ID N0:77中所示之氨基酸序列。
[0039] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之綴合 物：a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴 合物；c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢 膜糖之綴合物。
[0040] 一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物針對腦膜炎雙球菌血清群Y之殺細菌性抗 體的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包 括來自腦膜炎雙球菌血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽。
[0041] 在一個實施方式中，該多肽由SEQ ID N0:71中所示之氨基酸序列或選自以下序列 的氨基酸序列組成：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21，其中 位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:76中所示之氨基 酸序列。在另一實施方式中，該多肽之位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，該 多肽包括SEQ ID N0:77中所示之氨基酸序列。
[0042] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之綴合 物：a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴 合物；c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢 膜糖之綴合物。
[0043] 另一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物針對腦膜炎雙球菌之殺細菌性抗體的方 法，其包括給該哺乳動物施用有效量之免疫原性組合物，該免疫原性組合物包括來自腦膜 炎雙球菌血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及至少一種選自以下之 綴合物：a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物；b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖 之綴合物；c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及d)腦膜炎雙球菌血清群Y 之莢膜糖之綴合物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 圖I :P2086變體核酸序列。
[0045] 圖2 :P2086變體氨基酸序列。各變體之N端尾中之Gly/Ser莖部（stalk)加下劃 線。
[0046] 圖3 :0RF2086蛋白質(zhì)之結(jié)構(gòu)。
[0047] 圖4 :N端Cys之移除導致在大腸桿菌（E. coli)中之表達喪失。
[0048] 圖5 :Gly/Ser莖部長度對非脂化之0RF2086變體表達之影響。與標記為BOl之蛋 白質(zhì)變體有關(guān)之序列示于SEQ ID NO: 35中。與標記為B44之蛋白質(zhì)變體有關(guān)之序列示于 SEQ ID NO:36中。與標記為A05之蛋白質(zhì)變體有關(guān)之序列示于SEQ ID NO:37中。與標記 為A22之蛋白質(zhì)變體有關(guān)之序列不于SEQ ID NO:38中。與標記為B22之蛋白質(zhì)變體有關(guān) 之序列示于SEQ ID N0:39中。與標記為A19之蛋白質(zhì)變體有關(guān)之序列示于SEQ ID N0:40 中。
[0049] 圖6 :Gly/Ser莖部雖短，但非脂化之B09之表達水平高。左邊兩個泳道表明在誘 導之前及之后N端Cys刪除型B09變體的表達。第三及第四泳道表明在誘導之前及之后N 端Cys陽性B09變體的表達。最右邊之泳道為分子量標準。圖像下方所示之氨基酸序列示 于SEQ ID NO:41。在圖中稱為"A22_001"之表示N端Cys刪除型A22變體之核苷酸序列示 于SEQ ID NO:42中，其在圖中展示于SEQ ID NO:41下方。在圖中稱為"B22_001"之表示N 端Cys刪除型B22變體之核苷酸序列示于SEQ ID NO: 52中。在圖中稱為"B09_004"之表 示N端Cys刪除型B09變體之核苷酸序列示于SEQ ID NO: 53中。
[0050] 圖7 :密碼子優(yōu)化增加非脂化之B22及A22變體之表達。左側(cè)畫面表示在IPTG誘 導之前（泳道1及3)及之后（泳道2及4) N端Cys刪除型B22變體之表達。右側(cè)畫面表 示在IPTG誘導之前（泳道7)及之后（泳道8) N端Cys刪除型A22變體之表達。泳道5及 6為分子量標準。
[0051] 圖8 :P2086變體核酸及氨基酸序列。
[0052] 圖9A至9B :實施例15至19中所論述之所選的野生型亞家族A與B fHBP變體 之序列比對。應注意，A62之N端與B09100%相同且其C端與A22100%相同。所示序列 為 A05(SEQ ID N0:13) ;A12(SEQ ID N0:14) ;A22(SEQ ID N0:15) ;A62(SEQ ID N0:70); B09(SEQ ID N0:18) ;B24(SEQ ID N0:20);及共有序列（SEQ ID N0:78)。
[0053] 序列標示符
[0054] SEQ ID NO: I給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A04基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0055] SEQ ID NO: 2給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0056] SEQ ID NO: 3給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A12基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0057] SEQ ID NO:4給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A12-2基因之DNA序列， 其包括編碼N端Cys之密碼子。
[0058] SEQ ID NO: 5給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0059] SEQ ID NO:6給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B02基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0060] SEQ ID NO: 7給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B03基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0061] SEQ ID NO:8給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0062] SEQ ID NO:9給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0063] SEQ ID NO: 10給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B24基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0064] SEQ ID NO: 11給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B44基因之DNA序列，其 包括編碼N端Cys之密碼子。
[0065] SEQ ID NO: 12給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A04之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0066] SEQ ID NO: 13給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0067] SEQ ID NO: 14給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A12之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0068] SEQ ID NO: 15給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0069] SEQ ID NO: 16給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B02之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0070] SEQ ID NO: 17給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B03之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0071] SEQ ID NO: 18給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0072] SEQ ID NO: 19給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0073] SEQ ID NO: 20給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B24之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0074] SEQ ID N0:21給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B44之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0075] SEQ ID N0:22給出了實施例2中所示之正向引物之DNA序列。
[0076] SEQ ID N0:23給出了實施例2中所示之反向引物的DNA序列。
[0077] SEQ ID N0:24給出了實施例2表1中所示之正向引物的DNA序列。
[0078] SEQ ID N0:25給出了實施例2表1中所示之反向引物的DNA序列。
[0079] SEQ ID N0:26給出了實施例2表1中所示之正向引物的DNA序列。
[0080] SEQ ID N0:27給出了實施例2表1中所示之反向引物的DNA序列。
[0081] SEQ ID NO: 28給出了實施例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
[0082] SEQ ID NO: 29給出了由例如SEQ ID NO: 28編碼之實施例4中所示之Gly/Ser莖 部之氨基酸序列。
[0083] SEQ ID NO: 30給出了實施例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
[0084] SEQ ID NO: 31給出了由例如SEQ ID NO: 30編碼之實施例4中所示之Gly/Ser莖 部之氨基酸序列。
[0085] SEQ ID NO: 32給出了實施例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
[0086] SEQ ID NO: 33 給出了 由例如 SEQ ID NO: 32 及 SEQ ID NO: 34 編碼之 Gly/Ser 莖部 之氨基酸序列。
[0087] SEQ ID NO: 34給出了實施例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
[0088] SEQ ID NO: 35給出了圖5中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體BOl之N 端的氨基酸序列。
[0089] SEQ ID NO: 36給出了圖5中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B44之N 端的氨基酸序列。
[0090] SEQ ID NO: 37給出了圖5中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05之N 端的氨基酸序列。
[0091] SEQ ID NO: 38給出了圖5中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22之N 端的氨基酸序列。
[0092] SEQ ID NO: 39給出了圖5中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22之N 端的氨基酸序列。
[0093] SEQ ID NO: 40給出了圖5中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A19之N 端的氨基酸序列。
[0094] SEQ ID NO: 41給出了圖6中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體之N端的 氨基酸序列。
[0095] SEQ ID NO: 42給出了圖6中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22之N 端的DNA序列。
[0096] SEQ ID NO:43給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B44基因之經(jīng)密碼子優(yōu) 化之DNA序列，其中相較于SEQ ID NO: 11，刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。質(zhì)粒pDK087 包括 SEQ ID NO:43。
[0097] SEQ ID NO:44給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B44之氨基酸 序列。SEQ ID N0:44與SEQ ID N0:21相同，其中刪除了 SEQ ID N0:21之位置1之N端半 胱氨酸。SEQ ID N0:44由例如SEQ ID N0:43編碼。
[0098] SEQ ID NO:45給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09基因之經(jīng)密碼子優(yōu) 化之DNA序列，其中相較于SEQ ID N0:8,刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子，且其中該序列 包括編碼另外之Gly/Ser區(qū)域之密碼子。質(zhì)粒pEB063包括SEQ ID N0:45。
[0099] SEQ ID NO:46給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09基因之經(jīng)密碼子優(yōu) 化之DNA序列，其中相較于SEQ ID N0:8,刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。質(zhì)粒pEB064 包括 SEQ ID NO:46。
[0100] SEQ ID NO:47給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09基因之經(jīng)密碼子優(yōu) 化之DNA序列，其中相較于SEQ ID N0:8,刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。質(zhì)粒pEB065 包括 SEQ ID NO:47。
[0101] SEQ ID N0:48給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09基因之DNA序列， 其中相較于SEQ ID N0:8,刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。質(zhì)粒pLA134包括SEQ ID N0:48。
[0102] SEQ ID NO:49給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09的氨基酸 序列。SEQ ID N0:49與SEQ ID NO: 18相同，其中刪除了 SEQ ID NO: 18之位置1之N端半 胱氨酸。SEQ ID NO:49 由例如選自 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47 及 SEQ ID NO:48 的 DNA 序列編碼。
[0103] SEQ ID NO: 50給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09之氨基酸序列，其 中刪除了相較于SEQ ID NO: 18編碼N端半胱氨酸之密碼子，且其中該序列包括編碼另外之 Gly/Ser區(qū)域之密碼子。SEQ ID N0:50由例如SEQ ID N0:45編碼。
[0104] SEQ ID NO: 51給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B44基因之DNA序列， 其中相較于SEQ ID NO: 11，刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。質(zhì)粒pLN056包括SEQ ID N0:51。
[0105] SEQ ID NO:52給出了圖6中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22之N 端的DNA序列。
[0106] SEQ ID NO:53給出了圖6中所示之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B09之N 端的DNA序列。
[0107] SEQ ID NO: 54給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05基因之DNA序列，其 中相較于SEQ ID NO: 2,刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。
[0108] SEQ ID NO: 55給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05的氨基酸 序列。SEQ ID N0:55與SEQ ID NO: 13相同，其中刪除了 SEQ ID NO: 13之位置1之N端半 胱氨酸。SEQ ID NO:55由例如SEQ ID NO:54編碼。
[0109] SEQ ID NO:56給出了實施例7中所示之絲氨酸-甘氨酸重復序列之氨基酸序列。
[0110] SEQ ID NO: 57給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體BOl的氨基酸 序列。SEQ ID N0:57與SEQ ID N0:58相同，其中刪除了 SEQ ID N0:58之位置1之N端半 胱氨酸。
[0111] SEQ ID N0:58給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體BOl之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0112] SEQ ID NO: 59給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B15之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0113] SEQ ID NO: 60給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B16之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0114] SEQ ID N0:61給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22之DNA序列，其中 SEQ ID NO: 19之氨基酸位置1之N端Cys之密碼子由甘氨酸之密碼子置換。
[0115] SEQ ID N0:62給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22之氨基酸序列，其中 SEQ ID NO: 19之氨基酸位置1之N端Cys由甘氨酸置換。
[0116] SEQ ID NO:63給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22之DNA序列，其中 SEQ ID NO: 15之氨基酸位置1之N端Cys的密碼子由甘氨酸之密碼子置換。
[0117] SEQ ID N0:64給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22之氨基酸序列，其中 SEQ ID NO: 15之氨基酸位置1之N端Cys由甘氨酸置換。
[0118] SEQ ID NO: 65給出了編碼非脂化且非丙酮酸化之A05多肽的經(jīng)密碼子優(yōu)化之DNA 序列（pEB042)。
[0119] SEQ ID NO:66給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A12的氨基酸 序列。SEQ ID NO:66與SEQ ID NO: 14相同，其中SEQ ID NO: 14之位置1之N端半胱氨酸 系經(jīng)刪除。SEQ ID N0:66由例如SEQ ID N0:67編碼。
[0120] SEQ ID NO:67給出了非脂化且非丙酮酸化之A12多肽的經(jīng)密碼子優(yōu)化之DNA序 列。
[0121] SEQ ID NO:68給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A22的氨基酸 序列。SEQ ID N0:68與SEQ ID NO: 15相同，其中刪除了 SEQ ID NO: 15之位置1之N端半 胱氨酸。SEQ ID N0:68由例如SEQ ID N0:69編碼。
[0122] SEQ ID NO:69給出了非脂化且非丙酮酸化之A22多肽的經(jīng)密碼子優(yōu)化之DNA序 列。
[0123] SEQ ID NO: 70給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A62之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0124] SEQ ID NO: 71給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A62的氨基酸 序列。SEQ ID N0:71與SEQ ID N0:70相同，其中刪除了 SEQ ID N0:70之位置1之N端半 胱氨酸。
[0125] SEQ ID NO: 72給出了 SEQ ID NO: 71之經(jīng)密碼子優(yōu)化之DNA序列。
[0126] SEQ ID NO: 73給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05基因之經(jīng)密碼子優(yōu) 化之DNA序列（pDK086)，其中相較于SEQ ID NO: 2,刪除了編碼N端半胱氨酸之密碼子。
[0127] SEQ ID NO: 74給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A29之氨基酸序列，其在 氨基酸位置1包括N端Cys。
[0128] SEQ ID NO: 75給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B22的氨基酸 序列。SEQ ID N0:75與SEQ ID NO: 19相同，其中刪除了 SEQ ID NO: 19之位置1之N端半 胱氨酸。
[0129] SEQ ID NO: 76給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05的氨基酸序列。
[0130] SEQ ID NO: 77給出了非脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體A05的氨基酸 序列。SEQ ID NO:77與SEQ ID NO: 19相同，其中SEQ ID NO:76之位置1之N端半胱氨酸 不存在。
[0131] SEQ ID NO: 78給出了圖9A至9B中所示之共同序列之氨基酸序列。
[0132] SEQ ID NO:79 除不存在 SEQ ID NO:78 之位置 1 之 Cys 外與 SEQ ID NO:78 相同。
[0133] SEQ ID NO: 80給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B24的氨基酸序列。SEQ ID N0:80與SEQ ID N0:20相同，其中刪除了 SEQ ID N0:20之位置1之N端半胱氨酸。
[0134] SEQ ID NO: 81給出了腦膜炎雙球菌血清群B之2086變體B24的氨基酸序列。SEQ ID N0:81與SEQ ID N0:20相同，其中刪除了 SEQ ID N0:20之位置1至3之殘基。
[0135] 發(fā)明詳述
[0136] 除非另外定義，否則本文所用之所有技術(shù)及科學術(shù)語的意義與一般本發(fā)明所屬領 域的普通技術(shù)人員通常所了解之意義相同。盡管在實踐或測試本發(fā)明時可使用類似于或等 效于本文所述方法及材料的方法及材料，但在下文中描述適合之方法及物質(zhì)。這些物質(zhì)、方 法及實施例僅具說明性，而不是要具有限制性。本文提及之所有出版物、專利及其它文獻以 引用方式全文并入本文中。
[0137] 定義
[0138] 術(shù)語"抗原"一般系指含有同源抗體可選擇性結(jié)合之至少一個表位的生物分子，通 常為蛋白質(zhì)、肽、多糖、脂質(zhì)或綴合物；或在有些情況下系指可刺激動物產(chǎn)生抗體或T細胞 應答或兩者皆具之免疫原性物質(zhì)，包括注射或吸收至動物體內(nèi)之組合物。免疫應答可針對 整個分子或該分子各個部分之一或多個（例如表位或半抗原）產(chǎn)生。該術(shù)語可用以指個別 分子或抗原性分子之同源或異源群體?？乖煽贵w、T細胞受體或特異性體液及/或細胞免 疫之其它元件識別。術(shù)語"抗原"包括所有相關(guān)之抗原表位。給定抗原之表位可使用此項技 術(shù)中熟知之許多表位定位技術(shù)鑒定。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.MorrisEd.，1996)Humana Press, Totowa，N. J0 舉 例而言，線性表位可藉由下述方法確定，例如，在固體支撐物上同時合成大量肽，所述肽對 應于蛋白質(zhì)分子之部分，以及當所述肽仍與所述支撐物連接時使所述肽與抗體反應。這些 技術(shù)為本領域已知的且描述于例如美國專利第4, 708, 871號；Geysen等人，（1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 ;Geysen 等人，（1986)Molec. Immunol. 23:709-715 中， 上述文獻皆以引用方式全文并入本文中。相似地，構(gòu)象表位可藉由通過諸如X射線結(jié)晶學 及二維核磁共振確定的氨基酸空間構(gòu)象來鑒定。參見例如Epitope Mapping Protocols (同 上）。此外，出于本發(fā)明之目的，"抗原"亦可用以指包括對天然序列的修飾（諸如刪除、添 加及取代（一般為性質(zhì)上保守的，但可為非保守的））的蛋白質(zhì)，只要該蛋白質(zhì)維持引起免 疫應答之能力即可。這些修飾可為有意的，如經(jīng)由定點突變誘發(fā)或經(jīng)由特定合成程序或經(jīng) 由基因工程方法達成，或可為偶然的，諸如經(jīng)由產(chǎn)生抗原之宿主突變所致。此外，所述抗原 可自微生物（例如細菌）產(chǎn)生、獲得或分離或可為整個生物體。相似地，在此定義中亦包括 諸如在核酸免疫接種應用中表達抗原之寡核苷酸或多核苷酸。亦包括合成抗原，例如多表 位（polyepitope)、側(cè)翼表位及其它重組或合成衍生之抗原（Bergmann等人，（1993)Eur. J. Immunol. 23:27772781 ;Bergmann 等人，（1996) J. Immunol. 157:32423249 ；Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75:402408 ;Gardner 等人，（1998) 12th World AIDS Conf erence, Geneva, Switzerland, 1998 年6 月 28 日-7月 3 日）。
[0139] 術(shù)語"保守性"氨基酸取代可基于所涉及殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水 性及/或酸堿兼性性質(zhì)方面之相似性來進行。舉例而言，非極性（疏水性）氨基酸包括丙 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；極性/中性氨基酸包括甘氨 酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；帶正電荷（堿性）氨基酸包 括精氨酸、賴氨酸及組氨酸；以及帶負電荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。在一 些實施方式中，所述保守性氨基酸變化會改變0RF2086多肽之一級序列，但不改變分子之 功能。當產(chǎn)生這些突變體時，可考慮氨基酸之親水指數(shù)。氨基酸親水指數(shù)在賦予多肽以相 互作用的生物學功能方面的重要性是本領域普遍理解的（Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol.，157 (1) : 105-32)。已知某些氨基酸可經(jīng)其它具有相似親水指數(shù)或得分之氨基酸取 代且仍產(chǎn)生具有相似生物學活性之多肽。各氨基酸已基于其疏水性及電荷特征指定親水指 數(shù)。那些指數(shù)為：異亮氨酸（+4. 5);纈氨酸（+4. 2);亮氨酸（+3. 8);苯丙氨酸（+2. 8);半胱 氨酸/胱氨酸（+2.5);甲硫氨酸（+1.9);丙氨酸（+1.8);甘氨酸（-0.4);蘇氨酸（-0.7); 絲氨酸（-0.8);色氨酸（-0.9);酪氨酸（-1.3);脯氨酸（-1.6);組氨酸（-3.2);谷氨酸 (-3.5);谷氨酰胺（-3.5);天冬氨酸（-3.5);天冬酰胺（-3.5);賴氨酸（-3.9);及精氨酸 (-4. 5)。
[0140] 相信氨基酸殘基之相對親水特征確定所得多肽之二級及三級結(jié)構(gòu)，繼而限定所述 多肽與其它分子（諸如酶、基質(zhì)、受體、抗體、抗原及其類似分子）之相互作用。本領域已知 氨基酸可經(jīng)具有相似親水指數(shù)之另一氨基酸取代且仍獲得功能等效之多肽。在該等變化 中，優(yōu)選未水指數(shù)相差 +/_2以內(nèi)之氨基酸的取代優(yōu)選，特別優(yōu)選未水指數(shù)相差+/-1以內(nèi)之 氨基酸的取代優(yōu)選，更優(yōu)選親水指數(shù)相差+/_〇. 5以內(nèi)之氨基酸的取代優(yōu)選。
[0141] 亦可基于親水性進行保守性氨基酸取代或插入。如美國專利第4, 554, 101號 (其以引用方式并入本文中）中所述，取決于相鄰氨基酸之親水性的多肽最大局部平均親 水性與其免疫原性及抗原性有關(guān)，亦即與多肽之生物學特性有關(guān)。美國專利第4, 554, 101 號敘述已對氨基酸殘基指定下列親水性值：精氨酸（+3.0);賴氨酸（+3.0);天冬氨酸 (+3. 0±1);谷氨酸（+3. 0±1);絲氨酸（+0. 3);天冬酰胺（+0. 2);谷氨酰胺（+0. 2);甘氨酸 (〇);脯氨酸（_〇. 5±1);蘇氨酸（-0. 4);丙氨酸（-0. 5);組氨酸（-0. 5);半胱氨酸（-1. 0); 甲硫氨酸（-1.3);繳氨酸（-1.5);亮氨酸（-1.8);異亮氨酸（-1.8);酪氨酸（-2.3);苯丙 氨酸（-2.5);色氨酸（-3.4)。應了解，氨基酸可經(jīng)具有相似親水性值之另一氨基酸取代且 仍獲得生物學上等效且尤其免疫學上等效之多肽。在這些變化中，優(yōu)選親水性值相差±2 以內(nèi)之氨基酸的取代優(yōu)選；特別優(yōu)選親水性值相差±1以內(nèi)之氨基酸的取代優(yōu)選；更優(yōu)選 親水性值相差±0. 5以內(nèi)之氨基酸的取代優(yōu)選。考慮到上述各種特征之例示性取代為本領 域技術(shù)人員所熟知且包括（不限于）：精氨酸與賴氨酸；谷氨酸與天冬氨酸；絲氨酸與蘇氨 酸；谷氨酰胺與天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。
[0142] 如本文所用之術(shù)語"免疫原性有效量"系指多肽或包含多肽之組合物在脊椎動物 宿主體內(nèi)引起免疫應答之有效量。舉例而言，本發(fā)明rLP2086蛋白之免疫原性有效量為在 脊椎動物宿主體內(nèi)引起免疫應答之有效量。特定之"免疫原性有效劑量或量"將視宿主之 年齡、體重及醫(yī)學病狀以及施用方法而定。本領域技術(shù)人員可以容易地確定適合之劑量。
[0143] 如本文所用之術(shù)語" Gly/Ser莖部"系指與由0RF2086編碼之蛋白質(zhì)之N端Cys 殘基緊鄰之下游處的一系列Gly及Ser殘基。在Gly/Ser莖部中可存在5至12個Gly及 Ser殘基。因此，Gly/Ser莖部由0RF2086所編碼之蛋白質(zhì)之2位氨基酸至7-13位氨基酸 組成。優(yōu)選地，Gly/Ser莖部由0RF2086所編碼之蛋白質(zhì)之2位氨基酸至最多7-13位氨基 酸組成。本發(fā)明之P2086變體之Gly/Ser莖部在圖2中（SEQ ID NO: 12-21)由加下劃線之 序列表示。如本文所示，Gly/Ser莖部之長度可以影響非脂化之P2086變體之穩(wěn)定性或表 達量。在一例示性實施方式中，將由影響Gly/Ser莖部之長度所產(chǎn)生之效應與相應之野生 型變體進行比較。
[0144] 術(shù)語"免疫原性"系指抗原或疫苗引起體液或細胞或兩者介導之免疫應答的能力。
[0145] "免疫原性量"或"免疫有效量"或"劑量"在本文中可互換使用，一般系指由本領 域技術(shù)人員已知之標準分析所測量量的抗原或免疫原性組合物的足以引其免疫應答之量， 所述免疫應答是細胞（T細胞）應答或體液〇細胞或抗體）應答或兩者。
[0146] 術(shù)語"免疫原性組合物"涉及任何含有抗原（例如微生物或其組分）之藥物組合 物，該組合物可用于引起個體之免疫應答。本發(fā)明之免疫原性組合物可用于治療易受腦膜 炎雙球菌感染之人類，所述治療用經(jīng)由全身性經(jīng)皮或黏膜途徑施用所述免疫原性組合物的 方法進行。這些施用可包括經(jīng)由肌肉內(nèi)（i.m.)、腹膜內(nèi)（i.p.)、皮內(nèi)（i.d.)或皮下途徑注 射；藉由貼劑或其它經(jīng)皮傳遞裝置敷用；或經(jīng)由黏膜施用至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生 殖道。在一個實施方式中，所述免疫原性組合物可用于生產(chǎn)疫苗或激發(fā)可用于被動地保護 或治療個體之多克隆或單克隆抗體。
[0147] 特定免疫原性組合物之組分之最佳量可藉由涉及觀測個體之適當免疫應答之標 準研究來確定。在最初的疫苗接種后，個體可接受一次或多次時間間隔足夠長之追加免疫 接種。
[0148] 術(shù)語"分離"意謂將物質(zhì)自其原始環(huán)境移出（例如，若其為天然存在的，則自自然 環(huán)境移出，或若其為重組實體，則自其宿主生物體移出，或自一個環(huán)境放入不同之環(huán)境）。舉 例而言，"分離"之蛋白質(zhì)或肽基本上不含來自產(chǎn)生該蛋白質(zhì)之細胞或組織來源之細胞物質(zhì) 或其它污染蛋白，或基本上不含在化學合成時或以其它方式存在于作為化學反應之一部分 之混合物中的化學前體或其它化學物質(zhì)。在本發(fā)明中，可自細菌細胞或細胞碎片分離蛋白 質(zhì)，以使其以適用于生產(chǎn)免疫原性組合物之形式提供。術(shù)語"分離（isolated)"或"分離 (isolating)"可包括純化（purifying)或純化（purification),包括例如如本文所述之純 化蛋白質(zhì)之方法。措辭"基本上不含細胞物質(zhì)"涉及多肽或蛋白質(zhì)制劑，其中所述多肽或蛋 白質(zhì)與細胞的細胞組分分開，所述多肽或蛋白質(zhì)自所述細胞分離或重組產(chǎn)生。因此，基本 上不含細胞物質(zhì)之蛋白質(zhì)或肽包括莢膜多糖、蛋白質(zhì)或肽制劑，所述制劑具有少于約30%、 20%、10%、5%、2. 5%或1% (以干重計）之污染蛋白或多糖或其它細胞物質(zhì)。當重組產(chǎn) 生多肽/蛋白質(zhì)時，亦優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，亦即培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制劑之體積的少于約 20%、10%或5%。當藉由化學合成產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)時，優(yōu)選優(yōu)選基本上不含化學前體或 其它化學物質(zhì)，亦即將其與合成蛋白質(zhì)或多糖所涉及之化學前體或其它化學物質(zhì)分開。因 此，這些多肽或蛋白質(zhì)制劑具有少于約30%、20%、10%、5% (以干重計）之除感興趣的多 肽/蛋白質(zhì)或多糖片段以外的化學前體或化合物。
[0149] 如本文所用之術(shù)語"N端尾"系指由0RF2086編碼之蛋白質(zhì)之N端部分，其使蛋白 質(zhì)附于細胞膜。N端尾展示于圖3中側(cè)視圖結(jié)構(gòu)之底部。N端尾通常包含由0RF2086編碼 之蛋白質(zhì)之N端16個氨基酸。在一些實施方式中，N端尾為SEQ ID NO: 12-21中任一者之 氨基酸1至16。如本文所用之術(shù)語"0RF2086"系指奈瑟氏菌屬（Neisseria)細菌之開放閱 讀框2086。奈瑟氏菌屬0RF2086、由其編碼之蛋白質(zhì)、那些蛋白質(zhì)之片段以及包含那些蛋白 質(zhì)之免疫原性組合物為本領域已知且描述于例如W02003/063766及美國專利申請公開案 第US 20060257413號及第US 20090202593號中，上述各文獻以引用之方式全文并入本文 中。
[0150] 術(shù)語"P2086"一般系指由0RF2086編碼之蛋白質(zhì)。"2086"之前的"P"為"蛋白質(zhì)" 的縮寫。本發(fā)明之P2086蛋白可經(jīng)脂化或非脂化。"LP2086"及"P2086"通常分別指2086 蛋白質(zhì)之脂化及非脂化形式。本發(fā)明之P2086蛋白可為重組蛋白。"rLP2086"及"rP2086" 通常分別指重組2086蛋白之脂化及非脂化形式。"2086"因其能夠與因子H結(jié)合而亦稱為 因子H結(jié)合蛋白（fHBP)。
[0151] 如本文所用之術(shù)語"藥學可接受之稀釋劑、賦形劑及/或載劑"意欲包括與給人 類或其它脊椎動物宿主施用兼容之任何溶劑、分散介質(zhì)、包覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等 張劑及吸收延遲劑等。通常，藥學可接受之稀釋劑、賦形劑及/或載劑為經(jīng)聯(lián)邦、州政府或 其它管理機構(gòu)批準或列于美國藥典（U.s. Pharmacopeia)或其它公認之藥典中之用于動物 (包括人類以及非人類哺乳動物）的稀釋劑、賦形劑及/或載劑。術(shù)語稀釋劑、賦形劑及/ 或"載劑"系指與藥物組合物一起施用之稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體（vehicle)。這些 藥物稀釋劑、賦形劑及/或載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來 源之油。水、鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液可作為液體稀釋劑、賦形劑及/或載劑，尤其 是用于可注射溶液。適合之藥物稀釋劑及/或賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、 麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、 丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，所述組合物亦可含有少量濕潤劑、膨脹劑、乳化劑或pH 值緩沖劑。這些組合物可呈溶液、懸濁液、乳液、持續(xù)釋放配制品等形式。適合之藥物稀 釋劑、賦形劑及/或載劑之實例描述于E. W. Martin之"雷明登氏藥物科學（Remington's Pharmaceutical Sciences)"中。所述配制品應適于施用方式。適當之稀釋劑、賦形劑及/ 或載劑對于本領域技術(shù)人員而言是明顯的且在很大程度上將視給藥途徑而定。
[0152] "保護性"免疫應答系指免疫原性組合物引起體液或細胞介導之免疫應答用以保 護個體免遭感染之能力。所提供之保護作用不需要為絕對保護作用，亦即不需要完全防止 或根除感染，只要相較于對照個體群體（例如未施用疫苗或免疫原性組合物之受感染動 物），存在統(tǒng)計顯著性改良作用即可。保護作用可限于減輕感染癥狀發(fā)病之嚴重度或快速 性。一般而言，"保護性免疫應答"將包括誘導至少50%之個體體內(nèi)針對特定抗原具特異性 之抗體水平提高，包括針對各抗原某種程度之可測測量的功能性抗體應答。在特定情況下， "保護性免疫應答"可包括誘導至少50%個體體內(nèi)對特定抗原具特異性之抗體水平提高至 兩倍或抗體水平提高至四倍，包括針對各抗原某種程度之可測測量的功能性抗體反應。在 某些實施方式中，調(diào)理抗體（opsonising antibody)與保護性免疫應答有關(guān)。因此，可藉由 在血清殺細菌活性（SBA)分析或調(diào)理吞噬作用分析（例如下文所述者）中測量的細菌計數(shù) 降低百分比來分析保護性免疫應答。這些分析亦為本領域已知的。例如，對于腦膜炎雙球菌 疫苗而言，SBA分析是為保護作用而設立之替代分析。在一些實施方式中，相較于在不存在 免疫原性組合物情況下之細菌計數(shù)，細菌計數(shù)降低至少10 %、25 %、50 %、65 %、75 %、80 %、 85%、90%、95% 或更多。
[0153] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"多肽"及"肽"指氨基酸殘基之聚合物且不限于產(chǎn)物之最小長度。 因此，在該定義內(nèi)包括肽、寡肽、二聚體、多聚體等。該定義涵蓋全長蛋白及其片段由。所 述術(shù)語亦包括相對于天然序列的修飾，諸如刪除、添加及取代（一般在性質(zhì)上為保守的，但 其可為非保守的），優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)維持在施用該蛋白質(zhì)之動物體內(nèi)之引起免疫應答的能 力。所述術(shù)語亦包括表達后修飾，例如糖基化、乙?；?、脂化、磷酸化等。
[0154] 在本文中亦描述所揭示之多核苷酸及多肽之活性變體及片段。"變體"系指基本上 相似之序列。如本文所用之變體多肽"變體多肽"系指源自天然蛋白質(zhì)之藉由對天然蛋白 質(zhì)之N端及/或C端處之一或多個氨基酸進行修飾而產(chǎn)生的多肽。所述修飾可包括刪除天 然蛋白質(zhì)之N端及/或C端處之一或多個氨基酸（所謂之截短）；在蛋白質(zhì)之一或多個內(nèi)部 位點處刪除及/或添加一或多個氨基酸；或天然蛋白質(zhì)中之一或多個位點處一或多個氨基 酸之取代。變體多肽繼續(xù)具有天然多肽之想要的生物學活性，即其具免疫原性。本文公開 之多肽或多核苷酸序列之變體（亦即SEQ ID NO: 1-25或39)通常將與參照序列具有至少 約 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或大于99%之序列相同性。
[0155] 術(shù)語"片段"系指包含指定數(shù)目之連續(xù)氨基酸或核苷酸殘基之一部分氨基酸或核 苷酸序列。在特定實施方式中，本文公開之多肽之片段可保留全長多肽之生物學活性，因此 具免疫原性。多核苷酸之片段可編碼保留蛋白質(zhì)之生物學活性，因此具免疫原性之蛋白質(zhì) 片段?；蛘?，適用作PCR引物之多核苷酸片段一般不保留生物學活性。因此，本文公開之核 苷酸序列之片段可在至少約15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100 個、110 個、120 個、130 個、140 個、150 個、175 個、200 個、225 個、250 個、300 個、400 個、500 個、600 個、700 個、800 個、900 個、1000 個、1100 個、1200 個、1300 個、1400 個或 1500 個連 續(xù)核苷酸或直至全長多核苷酸的范圍內(nèi)。本文公開之多肽序列之片段可包含至少10個、15 個、20 個、25 個、30 個、50 個、60 個、70 個、80 個、90 個、100 個、110 個、120 個、130 個、140 個、150 個、160 個、170 個、180 個、190 個、200 個、225 個、250 個、275 個、300 個、400 個、425 個、450個、475個或500個連續(xù)氨基酸，或直至全長多肽中存在之氨基酸總數(shù)。
[0156] 如本文所用之術(shù)語"重組"系指藉由基因工程方法產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)、多肽或表達 感興趣的基因之細胞。如對于蛋白質(zhì)或多肽使用之術(shù)語"重組"意謂藉由使重組多核苷酸 表達所產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明之蛋白質(zhì)可自天然來源分離或藉由基因工程方法產(chǎn)生。如本文 所用之"重組"進一步描述核酸分子，其因其來源或操作而不與其在自然界中所關(guān)聯(lián)之全部 或一部分多核苷酸關(guān)聯(lián)。如對于宿主細胞所使用之術(shù)語"重組"意謂宿主細胞包括重組多 核苷酸。
[0157] 術(shù)語"個體"系指哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或任何其它動物。術(shù)語"個體"亦包 括人類。術(shù)語"個體"亦包括家庭寵物。家庭寵物之非限制性實例包括：狗、貓、豬、兔、大 鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、天竺鼠、雪貂、鳥、蛇、蜥蜴、魚、龜及蛙。術(shù)語"個體"亦包括家畜動物。 家畜動物之非限制性實例包括：羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿羊、山羊、 兔、馴鹿、耗牛、雞、鶴及火雞。
[0158] 如本文所用之術(shù)語"哺乳動物"系指任何哺乳動物，諸如人類、小鼠、兔、非人類靈 長類動物。在一優(yōu)選實施方式中，所述哺乳動物為人類。
[0159] 術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"可互換使用，指包含至少一種可誘導個體之免疫應 答的免疫原性組合物的藥物組合物。
[0160] -般描述
[0161] 本發(fā)明亦鑒定出先前未鑒定出之在表達非脂化之P2086變體方面之困難且提供 克服這些困難之方法以及由其產(chǎn)生之新穎組合物。雖然編碼非脂化之P2086變體的質(zhì)粒構(gòu) 建體會使得非脂化之變體強烈表達，但這些變體在N端Cys上經(jīng)丙酮酸化。丙酮酸化會防 礙多肽之生產(chǎn)相同性或均一性或降低其可能性。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)自非脂化之P2086變體 序列中刪除N端Cys可避免非脂化之P2086變體丙酮酸化。試圖藉由刪除N端Cys之密碼 子來克服丙酮酸化會消除表達或?qū)е卤磉_不可溶變體?；蛘?，自非脂化之P2086變體移除 N端Cys會減少一些變體之表達。然而，令人驚奇的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)盡管N端Cys殘基經(jīng)刪 除，但至少非丙酮酸化且非脂化之405、412、422、462、801、809、822及財4變體可表達。一 般而言，與相應的野生型非脂化之序列相比，這些多肽可在不存在除Cys刪除以外之其它 修飾的情況下表達。參見例如實施例2及4。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)非丙酮酸化且非脂化之變體 驚人地具免疫原性且其出人意料地激發(fā)殺細菌性抗體。
[0162] 因此，本發(fā)明提供兩種克服在表達非脂化之變體方面的這些困難或降低這些困難 之可能性的方法。然而，本發(fā)明考慮其它方法。第一種方法為改變N端尾中與N端Cys緊鄰 之下游處的Gly/Ser莖部之長度。第二種方法為在N端尾內(nèi)進行密碼子優(yōu)化。然而，本發(fā) 明考慮對額外的密碼子進行優(yōu)化。這些方法使得可溶性非脂化之P2086變體之表達增強。 舉例而言，在一個實施方式中，與相應的野生型非脂化之變體之表達相比，可溶性非脂化之 P2086變體之表達增強。
[0163] 分離的多肽
[0164] 意外地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了分離的非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽。發(fā)明人進一 步發(fā)現(xiàn)所述多肽出人意料地具免疫原性且能夠引起殺細菌性免疫應答。
[0165] 如本文所用之術(shù)語"非丙酮酸化"系指多肽不具有丙酮酸成分。具有丙酮酸成分 之非脂化之0RF2086多肽相較于相應之野生型多肽通常展現(xiàn)+70之質(zhì)量位移。在一個實施 方式中，在藉由質(zhì)譜測量時，本發(fā)明多肽相較于相應之野生型非脂化之多肽未展現(xiàn)+70之 質(zhì)量位移。參見，例如，實施例10。
[0166] 在另一實施方式中，相較于相應之野生型非脂化之0RF2086多肽，分離的非丙酮 酸化且非脂化之0RF2086多肽包括N端半胱氨酸殘基之刪除。術(shù)語"N端半胱氨酸"系指多 肽之N端或N端尾處之半胱氨酸（Cys)。更具體而言，如本領域已知，如本文所用之"N端半 胱氨酸"系指如下N端半胱氨酸，在該N端半胱氨酸上LP2086脂蛋白以三棕櫚?；|(zhì)尾 進行脂化。舉例而言，在以SEQ ID N0:12-21中之任一者作為參照序列時，N端半胱氨酸位 于位置1。作為另一實例，在以SEQ ID N0:70作為參照序列時，N端半胱氨酸位于位置1。
[0167] 如本文所用之術(shù)語"野生型非脂化之0RF2086多肽"或"野生型非脂化之2086 多肽"或"野生型非脂化之多肽"系指氨基酸序列與在自然界中發(fā)現(xiàn)之相應脂化之成熟 0RF2086多肽之氨基酸序列相同的0RF2086多肽。非脂化之分子與脂化之分子之間的唯一 差異在于野生型非脂化之0RF2086多肽在N端半胱氨酸處未經(jīng)三棕櫚酰基脂質(zhì)尾脂化。
[0168] 如本領域已知，非脂化之2086形式系藉由沒有原始前導序列之蛋白質(zhì)或藉由用 一部分未指定用于在宿主細胞中進行脂肪酸?；稽c的序列置換前導序列而產(chǎn)生。參 見，例如，W02003/063766,其以全文引用的方式并入本文。
[0169] 非脂化之0RF2086之實例不僅包括剛才所描述之野生型非脂化之0RF2086多肽， 且亦包括具有根據(jù)SEQ ID NO: 12-21中之任一者之氨基酸序列的多肽，其中N端Cys系經(jīng)刪 除，以及具有根據(jù)SEQ ID N0:12-21中之任一者之氨基酸序列的多肽，其中N端Cys經(jīng)不為 Cys殘基之氨基酸取代。非脂化之0RF2086多肽之另一實例包括具有根據(jù)SEQ ID NO: 70之 氨基酸序列的多肽，其中N端Cys系經(jīng)刪除，以及具有根據(jù)SEQ ID N0:70之氨基酸序列的多 肽，其中N端Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。非脂化之0RF2086多肽之其它實施例包 括選自以下之氨基酸序列：SEQ ID NO: 44 (B44)、SEQ ID NO: 49 (B09)、SEQ ID NO: 55 (A05)、 SEQ ID NO:57(BOl)、SEQ ID NO:58(BOl)、SEQ ID NO:62(B22)、SEQ ID NO:64(A22)及 SEQ ID N0:75(B22)。非脂化之0RF2086多肽之其它實例包括選自SEQ ID N0:66(A12)、SEQ ID NO: 68 (A22)及 SEQ ID NO: 71 (A62)之氨基酸序列。更多實例包括SEQ ID NO: 80 (B24)及 SEQ ID N0:81(B24)。非脂化之0RF2086多肽之額外的實例包括示于SEQ ID N0:76及SEQ ID NO:77中之氨基酸序列。在一個實施方式中，非脂化之多肽包括與編碼相應非脂化之多肽 的序列具有至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。舉例而言， 在一例示性實施方式中，非脂化之A62多肽包括與SEQ ID N0:71具有至少約60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%或100%相同性的氨基酸序列。
[0170] 野生型非脂化之0RF2086多肽之實例包括具有根據(jù)SEQ ID NO: 12-21(展示于圖2 中）、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60中之任一者之氨基酸序列的多肽。野 生型非脂化之0RF2086多肽之另一實例包括具有根據(jù)SEQ ID NO: 70之氨基酸序列的多肽。 這些例示性野生型非脂化之0RF2086多肽包括N端Cys。
[0171] 如本文所用之例如"非脂化"之B44多肽包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽： SEQ ID N0:21、位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID N0:21及SEQ ID N0:44。"野生型非脂 化"之B44多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:21之多肽。"非丙酮酸化且非脂化"之B44 多肽包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID N0:21以 及 SEQ ID NO:44。
[0172] 作為另一實例，如本文所用之"非脂化"之B09多肽包括具有選自以下之氨基酸序 列的多肽：SEQ ID NO: 18、位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 18、SEQ ID N0:49以及 SEQ ID NO: 50。"野生型非脂化"之B09多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 18之多肽。 "非丙酮酸化且非脂化"之B09包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys 經(jīng)刪除的 SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:49 及 SEQ ID NO:50。
[0173] 作為另一實例，如本文所用之"非脂化"之A05多肽包括具有選自以下之氨基酸序 列之多肽：SEQ ID NO: 13、位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 55。"非 脂化"之A05多肽之另一實施例包括具有選自以下之氨基酸序列之多肽：SEQ ID NO: 13,其 中位置1之N端Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。"非脂化"之A05多肽之其它實例包 括具有SEQ ID N0:76中所示之氨基酸序列的多肽。"非脂化"之A05多肽之另一實例包括 具有SEQ ID N0:77中所示之氨基酸序列的多肽。"野生型非脂化"之A05包括具有氨基酸 序列SEQ ID NO: 13之多肽。"非丙酮酸化且非脂化"之A05包括具有選自以下之氨基酸序 列的多肽：位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 13以及SEQ ID NO:55。"非丙酮酸化且 非脂化"之A05之其它實施例包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 13,其中 位置1之N端Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代；SEQ ID NO: 76,其中位置1之Cys系經(jīng)刪 除；SEQ ID NO: 76,其中位置1之Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代；以及SEQ ID NO: 77。
[0174] 如本文所用之"非脂化"之A62多肽包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 70、位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 70,以及SEQ ID NO: 71。非脂化之A62 多肽之另一實例包括具有SEQ ID N0:70之多肽，其中位置1之N端Cys經(jīng)不為Cys殘基之 氨基酸取代。"野生型非脂化"之A62多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 70之多肽。"非 丙酮酸化且非脂化"之A62包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys經(jīng) 刪除的SEQ ID NO: 70,以及SEQ ID NO: 71。非丙酮酸化且非脂化之A62多肽之另一實例包 括具有SEQ ID N0:70之多肽，其中位置1之N端Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。優(yōu)選 地，"非丙酮酸化且非脂化"之A62包括具有SEQ ID NO: 71中所示之氨基酸序列的多肽。
[0175] 如本文所用之"非脂化"之A12多肽包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 14、位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 14,以及SEQ ID勵:66。"野生型非脂化" 之A12多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 14之多肽。"非丙酮酸化且非脂化"之A12包 括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID N0:14,以及SEQ ID N0:66。
[0176] 如本文所用之"非脂化"之A22多肽包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO: 15、位置 1 之 N 端 Cys 經(jīng)刪除的 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:64 以及 SEQ ID NO:68。 "野生型非脂化"之A22多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 15之多肽。"非丙酮酸化且非 脂化"之A22包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：位置1之N端Cys經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:68。優(yōu)選地，"非丙酮酸化且非脂化"之A22包括具有 SEQ ID N0:68中所示之氨基酸序列的多肽。
[0177] 如本文所用之術(shù)語"刪除" N端Cys包括相較于野生型非脂化之多肽序列使N端 Cys經(jīng)刪除的突變。舉例而言，"刪除"N端Cys系指自參照序列，例如自相應之野生型序列， 移除氨基酸Cys，從而使得氨基酸殘基相較于參照序列有所減少。除非另外描述，否則術(shù)語 "N端Cys"、"位置1之N端Cys"、"位置1之Cys"可互換。
[0178] 在另一實施方式中，N端Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。舉例而言，在一例示 性實施方式中，SEQ ID NO: 12-21之位置1之N端Cys包括位置1之C - G取代。參見例 如 SEQ ID NO: 62 相較于 SEQ ID NO: 19 (B22 野生型），以及 SEQ ID NO: 64 相較于 SEQ ID NO: 15 (A22野生型）。置換N端Cys之例示性氨基酸包括任何非Cys氨基酸，優(yōu)選為極性不 帶電荷之氨基酸，諸如甘氨酸。在一優(yōu)選實施方式中，用非保守性殘基對Cys進行取代。
[0179] 意外地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)表達N端Cys殘基經(jīng)刪除之非脂化之0RF2086多肽會使得 在藉由質(zhì)譜測量時，相較于相應之野生型非脂化之0RF2086多肽，丙酮酸化不可檢測。非 丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽之實例包括具有選自以下序列的氨基酸序列之多肽： SEQ ID N0:12(A04)、SEQ ID N0:13(A05)、SEQ ID N0:14(A12)、SEQ ID N0:15(A22)、SEQ ID NO: 16 (B02)、SEQ ID NO: 17 (B03)、SEQ ID NO: 18 (B09)、SEQ ID NO: 19 (B22)、SEQ ID N0:20(B24)、SEQ ID N0:21(B44)及 SEQ ID N0:70(A62)，其中位置 I 之半胱氨酸系經(jīng)刪除。 非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽之另一實例包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 58 (BOl) 之多肽，其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。分離的非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽 之其它實例包括具有選自以下序列的氨基酸序列之多肽：SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:49、 SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:71 及 SEQ ID N0:75。非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽之另一實例包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 57 (BOl)之多肽。分離的非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽之另一實例包括具有SEQ ID NO: 77 (A05)之多肽；具有SEQ ID NO: 76 (A05)之多肽，其中位置1之Cys系經(jīng)刪除；以 及具有SEQ ID N0:76(A05)之多肽，其中位置1之Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。非 丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽之其它實例包括具有選自以下序列的氨基酸序列之多 肽：SEQ ID NO: 12 (A04)、SEQ ID NO: 13 (A05)、SEQ ID NO: 14 (A12)、SEQ ID NO: 15 (A22)、 SEQ ID N0:58(B01)、SEQ ID N0:16(B02)、SEQ ID N0:17(B03)、SEQ ID N0:18(B09)、SEQ ID NO: 19 (B22)、SEQ ID NO: 20 (B24)、SEQ ID NO: 21 (B44)及 SEQ ID NO: 70 (A62)，其中位置 I 之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。優(yōu)選地，非丙酮酸化且非脂化之2086多肽包括 至少約250個、255個或260個連續(xù)氨基酸，及至多約270個、269個、268個、267個、266個、 265個、264個、263個、260個、259個、258個、257個、256個或255個連續(xù)氨基酸。任何最 小值可與任何最大值組合以確定范圍。更優(yōu)選地，所述多肽具有至少254個或262個連續(xù) 氨基酸。在一些實施方式中，所述多肽具有至多262個連續(xù)氨基酸。在其它實施方式中，所 述多肽具有至多254個連續(xù)氨基酸。在一個實施方式中，非丙酮酸化且非脂化之多肽包括 與編碼相應之非丙酮酸化且非脂化之多肽的序列具有至少約60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同性的氨基酸序列。舉例而言，在一例示性實施方式中，非丙酮酸化且非脂化之A62 多肽包括與SEQ ID NO:71 具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同性的氨基酸序 列。
[0180] 在一個實施方式中，分離的非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽系由可操作地連 接至表達系統(tǒng)之核苷酸序列編碼，其中該表達系統(tǒng)能夠于細菌細胞中表達。在一例示性實 施方式中，所述核苷酸序列連接至控制核苷酸序列表達之調(diào)節(jié)序列。
[0181] 適合之表達系統(tǒng)、調(diào)節(jié)序列及細菌細胞是本領域已知的。舉例而言，可使 用任何質(zhì)粒表達載體，例如 PET?(Novogen, Madison Wis.)或 PMAL?(New England Biolabs，Beverly, Mass.)，只要該多肽能夠在細菌細胞中表達即可。優(yōu)選地，使用PET?載 體克隆并在大腸桿菌（E. coli)中表達重組蛋白。在PET?系統(tǒng)中，所克隆之基因可在噬菌體 ?啟動子控制下表達。例示性細菌細胞包括突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)， 以及，優(yōu)選地，大腸桿菌。
[0182] -方面，本發(fā)明涉及一種可藉由該方法獲得之非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多 肽。優(yōu)選地，該多肽是分離的。本發(fā)明進一步涉及包括可藉由一種方法獲得之非丙酮酸化 且非脂化之0RF2086多肽的組合物。該組合物優(yōu)選為免疫原性組合物。該方法包括表達 編碼具有選自以下序列的氨基酸序列之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:58 及 SEQ ID NO:70,其中位置 1 之半胱氨酸系 經(jīng)刪除。在另一實施方式中，該方法包括表達編碼具有氨基酸序列SEQ ID N0:76之多肽的 核苷酸序列，其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，該方法包括表達編碼具 有選自以下序列的氨基酸序列之多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:58 及 SEQ ID N0:70,其中位置 1 之半胱氨酸經(jīng)不為 Cys 殘基之氨基酸取代。所述核苷酸序列可操作地連接至表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)能夠在細菌細 胞中表達。
[0183] 在一個實施方式中，該方法包括表達編碼具有選自以下序列的氨基酸序列之多肽 的核苷酸序列：SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:66、 SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:71、SEQ ID N0:57 及 SEQ ID N0:75。在另一實施方式中，該方 法包括表達編碼具有氨基酸序列SEQ ID N0:77之多肽的核苷酸序列。在另一實施方式 中，核苷酸序列選自：SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69 及 SEQ ID NO:72。優(yōu)選地，所述細菌細胞為大腸桿菌。
[0184] B09、B44、A05 :-方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包括第一分離多肽和第二分離 多肽，所述第一分離多肽包括SEQ ID N0:49(B09)中所示之氨基酸序列，所述第二分離多肽 包括SEQ ID N0:44(B44)中所示之氨基酸序列的。在一優(yōu)選實施方式中，所述多肽具免疫 原性。在另一優(yōu)選實施方式中，該組合物進一步包括來自血清群B腦膜炎雙球菌之0RF2086 亞家族A多肽。優(yōu)選地，0RF2086亞家族A多肽為非丙酮酸化且非脂化之0RF2086亞家族A 多肽。在一例示性實施方式中，0RF2086亞家族A多肽為A05,其實例包括例如位置1之N 端半胱氨酸經(jīng)刪除的SEQ ID NO: 13,以及SEQ ID N0:55。在另一例示性實施方式中，該組 合物包括具有以下氨基酸序列之非丙酮酸化且非脂化之A05多肽：位置1之Cys經(jīng)刪除的 SEQ ID NO:76 ;位置1之Cys經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代的SEQ ID NO:76 ;以及SEQ ID N0:77。
[0185] 多肽結(jié)構(gòu)域
[0186] 另一方面，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生分離的多肽的方法。該方法包括在細菌細胞 中表達多肽，該多肽包括與SEQ ID N0:21具有大于90%相同性的序列，所述序列包括至少 一個選自以下的結(jié)構(gòu)域：SEQ ID NO:21之氨基酸13至18、SEQ ID NO:21之氨基酸21至 34,以及SEQ ID NO: 21之氨基酸70至80,或其組合，其中該多肽沒有N端半胱氨酸。該方 法進一步包括純化該多肽。其中產(chǎn)生之多肽包括非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽。優(yōu) 選地，該多肽具免疫原性。在一優(yōu)選實施方式中，所述細菌細胞為大腸桿菌。
[0187] 包括至少一個選自SEQ ID NO:21之氨基酸13-18、SEQ ID NO:21之氨基酸21-34 及SEQ ID N0:21之氨基酸70-80或其組合的結(jié)構(gòu)域之多肽的實例包括SEQ ID NO: 12(A04)、 SEQ ID NO: 13 (A05)、SEQ ID NO: 14 (A12)、SEQ ID NO: 15 (A22)、SEQ ID NO: 16 (B02)、SEQ ID NO: 17 (B03)、SEQ ID NO: 18 (B09)、SEQ ID NO: 19 (B22)、SEQ ID NO: 20 (B24)及 SEQ ID N0:21(B44)。優(yōu)選地，這些多肽之位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，位置 1之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。其它例示性多肽包括SEQ ID N0:44、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 62 及 SEQ ID NO: 64。另一例示性多肽包 括SEQ ID N0:70及SEQ ID N0:71。另一例示性多肽包括SEQ ID N0:76。另一例示性多肽 包括 SEQ ID NO: 77。其它實例包括 SEQ ID NO: 80 (B24)及 SEQ ID NO: 81 (B24)。
[0188] 在一個例示性實施方式中，分離的多肽序列進一步包括至少一個選自以下的結(jié)構(gòu) 域：SEQ ID NO: 21 之氨基酸 96-116、SEQ ID NO: 21 之氨基酸 158-170、SEQ ID NO: 21 之 氨基酸 172-185、SEQ ID N0:21 之氨基酸 187-199、SEQ ID N0:21 之氨基酸 213-224、SEQ ID NO: 21之氨基酸226-237、SEQ ID NO: 21之氨基酸239-248,或其組合。包括至少一個 選自 SEQ ID NO:21 之氨基酸 13-18、SEQ ID NO:21 之氨基酸 21-34 及 SEQ ID NO:21 之氨 基酸70-80,或其組合的結(jié)構(gòu)域，且進一步包括至少一個選自以下的結(jié)構(gòu)域：SEQ ID NO: 21 之氨基酸 96-116、SEQ ID NO: 21 之氨基酸 158-170、SEQ ID NO: 21 之氨基酸 172-185、SEQ IDN0:21之氨基酸 187-199、SEQIDN0:21之氨基酸 213-224、SEQIDN0:21之氨基酸 226-237、SEQ ID N0:21之氨基酸239-248或其組合之多肽的實例包括SEQ ID N0:16(B02)、 SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及 SEQ ID NO:21 (B44)。優(yōu)選地，這些多肽之位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。其它例示性多肽包括具 有選自 SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50 及 SEQ ID NO:55 以及 SEQ ID NO:62 之氨基酸序列的多肽。
[0189] 一方面，本發(fā)明涉及一種藉由本文所述之方法產(chǎn)生的分離的多肽。在一個實施方 式中，所述分離的多肽為非丙酮酸化且非脂化之多肽。另一方面，本發(fā)明涉及一種藉由本文 所述之方法產(chǎn)生的免疫原性組合物。
[0190] 編碼多肽之核苷酸序列
[0191] B09 :-方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括位置1之N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID NO: 18,或SEQ ID NO: 49中所示之氨基酸序列。編碼SEQ ID NO: 49之例示性核苷酸序列 包括選自以下之序列：SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47及SEQ ID N0:48。優(yōu)選地，所述核苷酸 序列為SEQ ID N0:46。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID N0:46。 一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID N0:47。一方面，本發(fā)明涉及一 種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:48。
[0192] 一方面，本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒，其包括選自以下之核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:48及SEQ ID N0:45,其中該質(zhì)粒能夠在細菌細胞中表達。如上文所 述，適合之表達系統(tǒng)、調(diào)節(jié)序列及細菌細胞是本領域已知的。優(yōu)選地，所述細菌細胞為大腸 桿菌。
[0193] 另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括SEQ ID NO:50中所示之氨基酸序 列。在一例示性實施方式中，SEQ ID N0:50由SEQ ID N0:45編碼。
[0194] B44:另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID N0:21，或SEQ ID N0:44中所示之氨基酸序列。編碼SEQ ID N0:44之例示性核苷酸序列 包括選自以下之序列：SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 51。優(yōu)選地，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:43。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:43。
[0195] A05 :-方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括位置1之N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID NO: 13 (A05)，或SEQ ID NO: 55中所示之氨基酸序列。編碼SEQ ID NO: 55之例示性核苷 酸序列包括選自以下之序列：SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:65及SEQ ID N0:73。優(yōu)選地，所述 核苷酸序列為SEQ ID N0:65。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID N0:54。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID N0:65。一方面，本發(fā)明 涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID N0:73。
[0196] A12:另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID NO: 14 (A12)，或SEQ ID NO: 66中所示之氨基酸序列。編碼SEQ ID NO: 66之例示性核苷酸序 列包括SEQ ID NO:67。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:67。
[0197] A22:另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID NO: 15 (A22)或SEQ ID NO: 68中所示之氨基酸序列。編碼SEQ ID NO: 68之例示性核苷酸序 列包括SEQ ID NO:69。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:69。
[0198] A62 :-方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其具有與SEQ ID N0:71具有至少95% 相同性之氨基酸序列，其中該序列之前20個氨基酸殘基不含半胱氨酸。優(yōu)選地，該多肽包 括如SEQ ID N0:71之位置1至184處所示之氨基酸序列。優(yōu)選地，該多肽是非脂化且非丙 酮酸化的。在另一實施方式中，所述多肽具免疫原性。
[0199] 在另一實施方式中，所述分離的多肽包括A62之片段。A62之例示性片段包括來 自SEQ ID NO: 70或SEQ ID NO: 71之任何數(shù)目之連續(xù)殘基。在一個實施方式中，所述分離 的多肽包括SEQ ID NO: 71之位置158至185之氨基酸序列。在另一實施方式中，所述分離 的多肽包括SEQ ID NO: 71之位置159至186之氨基酸序列。在一個實施方式中，所述多肽 包括SEQ ID NO:71之位置185至254之氨基酸序列中之至少6個連續(xù)氨基酸。
[0200] 另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核酸序列，其編碼分離的多肽，該分離的多肽具 有與SEQ ID N0:71具有至少95%相同性之氨基酸序列，其中該氨基酸序列之前20個氨基 酸殘基不含半胱氨酸。優(yōu)選地，所述多肽由SEQ ID N0:71中所示之氨基酸序列組成。在一 個實施方式中，所述分離的核酸序列包括SEQ ID N0:72。
[0201] 另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，其包括N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID NO: 70 (A62)，或SEQ ID NO: 71中所示之氨基酸序列。編碼SEQ ID NO: 71之例示性核苷酸序 列包括SEQ ID NO: 72。一方面，本發(fā)明涉及一種分離的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO: 72。
[0202] 免疫原性組合物
[0203] 在一優(yōu)選實施方式中，包括分離的非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽之本文所 述之組合物具免疫原性。本領域已知包括由來自腦膜炎雙球菌0RF2086之核苷酸序列編碼 之蛋白質(zhì)的免疫原性組合物。例示性免疫原性組合物包括W02003/063766及美國專利申請 公開案第US 20060257413號及第US 20090202593號中所述者，其以全文引用方式并入本 文中。其中所述之這樣的免疫原性組合物包括鑒定為0RF2086蛋白質(zhì)之展現(xiàn)殺細菌活性之 蛋白質(zhì)、其免疫原性部分和/或其生物學等效物。0RF2086蛋白質(zhì)系指由奈瑟菌屬之開放閱 讀框架2086編碼之蛋白質(zhì)。
[0204] 所述蛋白質(zhì)可為重組蛋白或自天然的奈瑟菌屬之分離的蛋白質(zhì)。舉例而言，奈瑟 菌屬0RF2086蛋白可自諸如以下之細菌菌株分離：奈瑟菌屬之細菌菌株，包括腦膜炎雙球 菌（血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z及29E)、淋病雙球菌（Neisseriagonorrhoeae)及乳 糖奈瑟菌（Neisseria Iactamica)之菌株，以及所述蛋白質(zhì)之免疫原性部分和/或生物等 效物。
[0205] 0RF2086蛋白質(zhì)包括2086亞家族A蛋白及亞家族B蛋白、其免疫原性部分和/或其 生物等效物。2086亞家族A蛋白及2086亞家族B蛋白是本領域已知的，參見例如上文所引 用之Fletcher等人，2004及Murphy等人，J Infect Dis. 2009年8月 1 日；200(3) :379-89。 亦參見W02003/063766,其公開代表與2086亞家族A之蛋白質(zhì)有關(guān)之氨基酸序列的SEQ ID N0:260至278。另外，W02003/063766中公開代表與2086亞家族B之蛋白質(zhì)有關(guān)之氨基酸 序列的SEQ ID N0:279至299。W02003/063766系以全文引用之方式并入本文中。0RF2086 蛋白質(zhì)或其等效物等可以是脂化或非脂化的。優(yōu)選地，奈瑟菌屬0RF2086蛋白質(zhì)是非脂化 的。或者，所述免疫原性組合物可為脂化0RF2086蛋白質(zhì)與非脂化之0RF2086蛋白質(zhì)的組 合。
[0206] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括一種分離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與由 來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼之蛋白質(zhì)具有至少95%氨基酸序列相同性。在另 一實施方式中，所述免疫原性組合物包括一種分離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與由來自奈瑟菌屬 0RF2086之核苷酸序列編碼之蛋白質(zhì)具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 氨基酸 序列相同性。
[0207] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括一種分離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與由 來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼之亞家族A蛋白質(zhì)具有至少95 %氨基酸序列相 同性。優(yōu)選地，所述免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼的分 離的亞家族A蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，0RF2086亞家族A多肽為A05、A04、A12、A62或 A22變體。在一些實施方式中，0RF2086亞家族A多肽為A05、A12或A22變體。
[0208] 亞家族A多肽之組合：在一個實施方式中，所述組合物包括0RF2086亞家族A多肽 之任何組合。0RF2086亞家族A多肽之例示性組合包括，例如，A05與A12 ;A05與A22 ;A05 與 A62 ;A12 與 A62 ;A12 與 A22 ;A22 與 A62 ;A05、A12 與 A22 ;A05、A12 與 A62 ;A12、A22 與 A62 ;及A05、A22與A62。優(yōu)選地，0RF2086亞家族A多肽是非經(jīng)脂化且非丙酮酸化的。
[0209] 在另一實施方式中，免疫原性組合物包括一種分離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與由來自 奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼之亞家族B蛋白質(zhì)具有至少95%氨基酸序列相同性。 優(yōu)選地，所述免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼的分離的亞 家族B蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，所述0RF2086亞家族B蛋白質(zhì)為B44、B02、B03、B22、 B24或B09變體。在一些實施方式中，所述0RF2086亞家族B蛋白質(zhì)為B44、B22或B09變 體。
[0210] 亞家族B多肽之組合：在一個實施方式中，所述組合物包括0RF2086亞家族B多肽 之任何組合。0RF2086亞家族B多肽之例示性組合包括，例如，B09與B22 ;B22與B44 ;B44 與 B09 ;B01 與 B09 ;B01 與 B22 ;B01 與 B44 ;及 B09、B22 與 B44 ;B09 與 B24 ;B22 與 B24 ;B24 與 B44 ;B01 與 B24 ;B02 與 B24 ;B02 與 BOl ;B02 與 B09 ;B02 與 B44 ;B01、B09 與 B24 ;B01、 B24 與 B44。
[0211] 在一優(yōu)選實施方式中，所述免疫原性組合物包括一種分離的非丙酮酸化且非脂化 之多肽，該多肽與由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼的亞家族B蛋白質(zhì)具有至少 95 %氨基酸序列相同性。舉例而言，在一些實施方式中，0RF2086亞家族B蛋白質(zhì)為選自以 下之序列：具有如SEQ ID N0:21中所示之氨基酸序列的B44;具有如SEQ ID NO: 16中所 示之氨基酸序列的B02 ;具有如SEQ ID NO: 17中所示之氨基酸序列的B03 ;具有如SEQ ID NO: 19中所示之氨基酸序列的B22 ;具有如SEQ ID NO: 20中所示之氨基酸序列的B24 ;具有 如SEQ ID N0:58中所示之氨基酸序列的BOl ;或具有如SEQ ID NO: 18中所示之氨基酸序 列的B09變體，其中N端Cys系經(jīng)刪除，或其組合。
[0212] 更優(yōu)選地，所述免疫原性組合物包括非丙酮酸化且非脂化之B09多肽、非丙酮酸 化且非脂化之B44多肽或其組合。在一個實施方式中，所述組合物包括具有如SEQ ID NO: 18 中所示之氨基酸序列的非丙酮酸化且非脂化之B09變體（其中N端Cys經(jīng)刪除）、具有如 SEQ ID NO: 21中所示之氨基酸序列的非丙酮酸化且非脂化之M4(其中N端Cys經(jīng)刪除） 或其組合。在另一實施方式中，所述免疫原性組合物包括具有SEQ ID NO:49之非丙酮酸化 且非脂化之B09、具有SEQ ID NO: 44之非丙酮酸化且非脂化之B44,或其組合。
[0213] 一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包括來自血清群B腦膜炎雙球菌之 0RF2086亞家族B多肽，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B44。B44可包括如N端Cys 經(jīng)刪除之SEQ ID N0:21，或SEQ ID N0:44中所示之氨基酸序列。在一個實施方式中，該組 合物進一步包括來自血清群B腦膜炎雙球菌之第二0RF2086亞家族B多肽，其中該第二多 肽為非丙酮酸化且非脂化之B0LB09可包括如N端Cys經(jīng)刪除之SEQ ID NO: 18,或SEQ ID NO:49中所示之氨基酸序列。在一個實施方式中，所述免疫原性組合物為疫苗。
[0214] 在另一實施方式中，所述組合物包括至多3種0RF2086亞家族B多肽。在另一實 施方式中，所述組合物包括至多2種0RF2086亞家族B多肽。
[0215] 在另一實施方式中，所述組合物包括至多1、2或3種0RF2086亞家族B變體。在 另一實施方式中，所述組合物包括至多1、2或3種0RF2086亞家族A變體。
[0216] 包括亞家族B多肽及亞家族A多肽之組合物：在一個實施方式中，所述組合物進一 步包括一或多種0RF2086亞家族A多肽。在一優(yōu)選實施方式中，所述組合物包括A05亞家 族A多肽。更優(yōu)選地，A05亞家族A多肽是非脂化且非丙酮酸化的。在另一優(yōu)選實施方式 中，所述組合物包括A62亞家族A多肽。更優(yōu)選地，A62亞家族A多肽是非脂化且非丙酮酸 化的。
[0217] 在另一實施方式中，所述免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷 酸序列編碼之亞家族A蛋白質(zhì)具有至少95%氨基酸序列相同性的分離的蛋白質(zhì)以及與由 來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼之亞家族B蛋白質(zhì)具有至少95 %氨基酸序列相同 性的分離的蛋白質(zhì)。
[0218] 優(yōu)選地，所述免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼 的分離的亞家族A蛋白質(zhì)以及由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼的分離的亞家 族B蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，所述免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之亞家族A 0RF2086多肽以及分離的非丙酮酸化且非脂化之亞家族B 0RF2086多肽。
[0219] 組合：涵蓋0RF2086多肽之任何組合。在一個實施方式中，所述組合物在不存在亞 家族B多肽的條件下包括至少一種亞家族A多肽。舉例而言，所述組合物僅包括亞家族A 多肽。在另一實施方式中，所述組合物在不存在亞家族A多肽的條件下包括至少一種亞家 族B多肽。舉例而言，組合物僅包括亞家族A多肽。
[0220] 所述免疫原性組合物可包括任何亞家族A多肽或其組合。在一些實施方式中，所 述0RF2086亞家族A多肽為A05、A04、A12或A22變體。在另一實施方式中，所述0RF2086 亞家族A多肽包括A62。在一優(yōu)選實施方式中，所述0RF2086亞家族A多肽為具有如SEQ ID NO: 13中所示之氨基酸序列的A05 ;具有如SEQ ID NO: 12中所示之氨基酸序列的A04 ;具有 如SEQ ID NO: 14中所示之氨基酸序列的A12 ;或具有如SEQ ID NO: 15中所示之氨基酸序 列的A22變體，其中N端Cys系經(jīng)刪除，或其任何組合。另一例示性免疫原性組合物包括分 離的非丙酮酸化且非脂化之A05與A62亞家族A0RF2086多肽之組合。舉例而言，免疫原性 組合物可包括具有SEQ ID NO: 55之多肽及具有SEQ ID NO: 71之多肽。另一例示性免疫原 性組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之A05與A12亞家族A 0RF2086多肽之組合。另 一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之A12與A62亞家族A 0RF2086 多肽之組合。
[0221] 所述免疫原性組合物可包括任何亞家族B多肽或其組合。在一些實施方式中，所 述0RF2086亞家族B蛋白質(zhì)為M4、B02、B03、B22、B24或B09變體。在一優(yōu)選實施方式中， 所述0RF2086亞家族B蛋白質(zhì)為具有如SEQ ID NO: 21中所示之氨基酸序列的B44 ;具有如 SEQ ID NO: 16中所示之氨基酸序列的B02;具有如SEQ ID NO: 17中所示之氨基酸序列的 B03;具有如SEQ ID NO: 19中所示之氨基酸序列的B22;具有如SEQ ID N0:20中所示之氨 基酸序列的B24;或具有如SEQ ID NO: 18中所示之氨基酸序列的B09變體，其中N端Cys系 經(jīng)刪除，或其組合。另一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之B09與 B44亞家族B 0RF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化且 非脂化之B09與B22亞家族B 0RF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括分離 的非丙酮酸化且非脂化之B22與B44亞家族B 0RF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性 組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之B09、B22與B44亞家族B 0RF2086多肽之組合。
[0222] 在一個實施方式中，所述組合物在不存在脂化之0RF2086多肽的條件下包括非脂 化之0RF2086多肽。在另一實施方式中，所述組合物包括非脂化之0RF2086多肽及至少一 種脂化之0RF2086多肽。
[0223] 在一個實施方式中，所述組合物在不存在脂化之0RF2086多肽的條件下包括非丙 酮酸化且非脂化之0RF2086多肽。在另一實施方式中，所述組合物包括脂化之0RF2086多 肽以及非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽。舉例而言，所述組合物可包括具有SEQ ID NO: 76之脂化之A05多肽以及具有SEQ ID NO: 77之非丙酮酸化且非脂化之A05。另一例示 性組合物包括具有SEQ ID NO: 76之脂化之A05多肽以及具有SEQ ID NO: 71之非丙酮酸化 且非脂化之A62。另一例示性組合物包括具有SEQ ID NO: 58之脂化之BOl多肽以及具有 SEQ ID NO: 71之非丙酮酸化且非脂化之A62。
[0224] 例示性組合：一種例示性免疫原性組合物包括分離的非脂化之A05、B09、B22及 B440RF2086多肽之組合。舉例而言，免疫原性組合物可包括非丙酮酸化且非脂化之A05(SEQ ID N0:55)亞家族A 0RF2086多肽以及分離的非丙酮酸化且非脂化之B09(SEQ ID N0:49)、 B22(SEQ ID N0:75)及 B44(SEQ ID N0:44)亞家族 B 0RF2086 多肽。
[0225] 另一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之A05及A12亞家族 A 0RF2086多肽以及分離的非丙酮酸化且非脂化之B22及B44亞家族B 0RF2086多肽之組 合。另一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之A05、A12、B09及B44多 肽。另一實例包括分離的非丙酮酸化且非脂化之A12、A62、B09及B44多肽。另一實施例包 括分離的非丙酮酸化且非脂化之A05、A12、A62、B09及B44多肽。另一例示性免疫原性組 合物包括分離的非丙酮酸化且非脂化之A62及B09多肽。另一例示性免疫原性組合物包括 分離的非丙酮酸化且非脂化之A62及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括分離的非 丙酮酸化且非脂化之A62、B09及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮 酸化且非脂化之A05、A62及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括分離的非丙酮酸化 且非脂化之A05、A62、B09及B44多肽。
[0226] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括1:1比率之亞家族A蛋白質(zhì)與亞家 族B蛋白質(zhì)。在另一實施方式中，所述免疫原性組合物包括以下任一比率之亞家族A多肽與 亞家族B多肽：1:1 ;1:2 ;1:3 ;1:4 ;1:5 ;1:6 ;1:7 ;1:8 ;1:9 ;或 1:10。在另一實施方式中，所 述免疫原性組合物包括以下任一比率之亞家族B多肽與亞家族A多肽：1:1 ;1:2 ;1:3 ;1:4 ; 1:5 ;1:6 ;1:7 ;1:8 ;1:9 ;或 1:10。
[0227] 殺細菌性免疫應答
[0228] -方面，本文所述之分離的多肽及組合物引起哺乳動物針對由腦膜炎雙球菌之任 何血清群，諸如選自血清群八、8、(：329、!1、1、1(、1^1-1353、￥及2之血清群，所致之感染的 殺細菌性免疫應答。在一優(yōu)選實施方式中，本文所述之分離的多肽及組合物引起哺乳動物 針對由血清群A、B、C、W-135、Y和/或X所致之感染的殺細菌性免疫應答。
[0229] 另一方面，本文所述之分離的多肽及組合物引起哺乳動物針對來自血清群B腦膜 炎雙球菌之0RF2086多肽的殺細菌性免疫應答。所述組合物能夠在給哺乳動物施用之后誘 導殺細菌性抗腦膜炎雙球菌抗體，且在優(yōu)選實施方式中，可誘導針對各個亞家族之菌株具 殺細菌性的抗體。關(guān)于殺細菌性反應之其它信息在下文中給出。參見，例如，實施例6、11、 12 及 13。
[0230] 在一個實施方式中，所述組合物引起針對腦膜炎雙球菌血清群B之異源亞家族的 殺細菌性免疫應答。舉例而言，包括非脂化之亞家族A多肽之組合物可引起針對腦膜炎雙 球菌血清群B之亞家族A變體和/或針對腦膜炎雙球菌血清群B之亞家族B變體的殺細菌 性免疫應答。參見，例如，實施例18至19。
[0231] 另一方面，本文所述之分離的多肽及組合物引起針對以下至少一者的殺細菌性免 疫應答：腦膜炎雙球菌之血清群A、血清群B、血清群C、血清群W135和/或血清群Y菌株。 在一優(yōu)選實施方式中，組合物引起至少針對腦膜炎雙球菌之血清群B、血清群C及血清群Y 的殺細菌性免疫應答。參見，例如，實施例21。
[0232] 在人體內(nèi)及用作代替品之臨床前研究中，殺細菌性抗體是保護作用的指示物，且 本文所述之任何新免疫原性組合物候選者應激發(fā)這些功能性抗體。
[0233] B09 :-方面，分離的非脂化之B09多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié) 合于）來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。在一例示性 實施方式中，具有SEQ ID NO: 18 (其中位置1之N端Cys經(jīng)刪除）或SEQ ID NO: 49之分離 的非丙酮酸化且非脂化之B09多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié)合于）來自血 清群B腦膜炎雙球菌亞家族A或優(yōu)選亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。優(yōu)選地，非 丙酮酸化且非脂化之B09多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對以下之殺細菌性抗體：A05變 體（SEQ ID N0:13) ;B44變體（SEQ ID N0:21) ;B16變體（SEQ ID N0:60) ;B24變體（SEQ ID N0:20) ;B09變體（SEQ ID N0:18)或其組合。在一例示性實施方式中，非丙酮酸化且非脂化 之B09多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對以下之殺細菌性抗體：B44變體（SEQ ID N0:21); B16 變體（SEQ ID NO: 60) ;B24 變體（SEQ ID NO: 20) ;B09 變體（SEQ ID NO: 18)或其組合。 參見例如實施例11、實施例12及實施例13。
[0234] B44 :-方面，分離的非脂化之B44多肽及其免疫原性組合物引起針對（例如可結(jié) 合于）來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。在另一例示 性實施方式中，具有SEQ ID N0:21(其中位置1之N端Cys經(jīng)刪除）或SEQ ID NO:44之分 離的非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié)合于）來自 血清群B腦膜炎雙球菌亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。優(yōu)選地，非丙酮酸化且 非脂化之B44多肽及其免疫原性組合物引起針對以下之殺細菌性抗體：B44變體（SEQ ID N0:21) ;B16 變體（SEQ ID N0:60) ;B24 變體（SEQ ID N0:20) ;B09 變體（SEQ ID N0:18)或 其組合。參見例如實施例11。另外，非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性組合物 亦可激發(fā)結(jié)合于B02變體（SEQ ID NO: 16)之殺細菌性抗體。參見，例如，實施例12及實施 例13。此外，非丙酮酸化且非脂化之B44多肽及其免疫原性組合物亦可激發(fā)結(jié)合于B03變 體（SEQ ID NO: 17)及B15變體（SEQ ID NO: 59)之殺細菌性抗體。參見，例如，實施例6。
[0235] B22 :-方面，分離的非脂化之B22多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié) 合于）來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。在另一例示 性實施方式中，具有SEQ ID NO: 19 (其中位置1之N端Cys經(jīng)刪除）之分離的非丙酮酸化 且非脂化之B22多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié)合于）來自血清群B腦膜炎 雙球菌亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。優(yōu)選地，非丙酮酸化且非脂化之B22多 肽激發(fā)針對以下之殺細菌性抗體：B44變體（SEQ ID N0:21) ;B16變體（SEQ ID N0:60) ;B24 變體（SEQ ID N0:20) ;B09變體（SEQ ID N0:18)或其組合。參見，例如，實施例13。
[0236] A05 :-方面，分離的非脂化之A05多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié) 合于）來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族A之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。在一個實施 方式中，具有SEQ ID N0:13(其中N端Cys經(jīng)刪除）或SEQ ID N0:55之分離的非丙酮酸化 且非脂化之A05多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié)合于）來自血清群B腦膜炎 雙球菌亞家族A之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。在一個實施方式中，分離的A05多肽包 括氨基酸序列SEQ ID N0:76,其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一實施方式中，分離 的A05多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:76,其中位置1之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基 酸取代。在一個實施方式中，分離的A05多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO: 77。優(yōu)選地，非丙 酮酸化且非脂化之A05及其免疫原性組合物激發(fā)針對以下之殺細菌性抗體：A05變體（SEQ ID N0:13)、A22 變體（SEQ ID N0:15)、A12 變體（SEQ ID N0:14)或其組合。參見，例如，實 施例6及13。
[0237] A62 :-方面，分離的非脂化之A62多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié) 合于）來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族A之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。在一個實 施方式中，分離的A62多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO: 70,其中位置1之半胱氨酸經(jīng)不為 Cys殘基之氨基酸取代。在另一實施方式中，具有SEQ ID NO: 70 (其中N端Cys系經(jīng)刪除） 或SEQ ID NO: 71之分離的非丙酮酸化且非脂化之A62多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對 (例如可結(jié)合于）來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族A和/或亞家族B之0RF2086多肽的 殺細菌性抗體。舉例而言，非丙酮酸化且非脂化之A62及其免疫原性組合物激發(fā)針對以下 之殺細菌性抗體：A05 變體（SEQ ID NO: 13)、A12 變體（SEQ ID NO: 14)、A22 變體（SEQ ID NO: 15)及A62變體（SEQ ID NO: 70)。作為另一實施例，非丙酮酸化且非脂化之A62及其免 疫原性組合物激發(fā)針對A29變體、B09變體及B24變體之殺細菌性抗體。參見例如實施例18 至19。在另一實施方式中，非丙酮酸化且非脂化之A62及其免疫原性組合物激發(fā)針對B16 變體之殺細菌性抗體。
[0238] A12 :在一個實施方式中，具有SEQ ID NO: 14 (其中N端Cys系經(jīng)刪除）或SEQ ID NO: 66之分離的非丙酮酸化且非脂化之A12多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對來自血清群 B腦膜炎雙球菌亞家族A和/或亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。優(yōu)選地，非丙酮 酸化且非脂化之A12及其免疫原性組合物激發(fā)針對以下之殺細菌性抗體：A05變體（SEQ ID NO: 13)、A22 變體（SEQ ID NO: 15)、A12 變體（SEQ ID NO: 14)、A62 變體（SEQ ID N0:70)、 A29變體、B09變體。參見，例如，實施例18至19。
[0239] 在一個實施方式中，具有SEQ ID NO: 15(其中N端Cys系經(jīng)刪除）或SEQ ID N0:68 之分離的非丙酮酸化且非脂化之A22多肽及其免疫原性組合物激發(fā)針對（例如可結(jié)合于） 來自血清群B腦膜炎雙球菌亞家族A和/或亞家族B之0RF2086多肽的殺細菌性抗體。優(yōu) 選地，非丙酮酸化且非脂化之A22及其免疫原性組合物激發(fā)針對以下之殺細菌性抗體：A05 變體（SEQ ID N0:13)、A22 變體（SEQ ID N0:15)、A62 變體（SEQ ID N0:70)、A29 變體。參 見，例如，實施例18至19。
[0240] 激發(fā)殺細菌性抗體之方法
[0241] 一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對血清群A腦膜炎雙球菌具特異性之殺 細菌性抗體的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對血清群C腦膜炎雙球菌具 特異性之殺細菌性抗體的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對血清群W135腦 膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對 血清群X腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺 乳動物之對血清群Y腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。一方面，本發(fā)明涉及 一種激發(fā)哺乳動物之對血清群A、B、C、W-135、X和/或Y腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌 性抗體的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對血清群B腦膜炎雙球菌具特異 性之殺細菌性抗體的方法。在一例示性實施方式中，該方法包括激發(fā)對0RF2086亞家族B 血清群B腦膜炎雙球菌、0RF2086亞家族A血清群B腦膜炎雙球菌或其組合具特異性之殺 細菌性抗體。
[0242] 該方法包括給該哺乳動物施用有效量的如上文所述之分離的非丙酮酸化且非脂 化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見，例如，實施例18至19及22。
[0243] 在一優(yōu)選實施方式中，該方法包括激發(fā)對0RF2086亞家族B血清群B腦膜炎雙球 菌具特異性之殺細菌性抗體。所述分離的多肽或免疫原性組合物包括非丙酮酸化且非脂化 之B44多肽。在另一優(yōu)選實施方式中，所述組合物進一步包括非丙酮酸化且非脂化之B09 多肽。在一例示性實施方式中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:44或其組合。在另一例示性實施方式中，所述分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO: 18,其中位置1之N端Cys系經(jīng)刪除；SEQ ID NO: 21，其中位置1之N端Cys系經(jīng)刪 除；或其組合。在另一例示性實施方式中，所述分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:19,其中位置1之N端Cys系經(jīng)刪除。在一個實施方式中，用于激發(fā)對0RF2086亞家族 B血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的免疫原性組合物包括非丙酮酸化且非 脂化之A05、A12及A62多肽中之至少一者。參見，例如，實施例19。
[0244] 在一優(yōu)選實施方式中，該方法包括激發(fā)對0RF2086亞家族A血清群B腦膜炎雙球 菌具特異性之殺細菌性抗體。分離的多肽或免疫原性組合物包括非丙酮酸化且非脂化之 A05多肽。在一優(yōu)選實施方式中，所述分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO: 13,其 中位置1之N端Cys系經(jīng)刪除。在另一優(yōu)選實施方式中，蘇搜組合物進一步包括非丙酮酸 化且非脂化之B44多肽。參見，例如，實施例6及13。在一例示性實施方式中，所述分離的 多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:44或其組合。在一優(yōu)選實施方式 中，分離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO: 13,其中位置1之N端Cys系經(jīng)刪除；SEQ ID N0:21，其中位置1之N端Cys系經(jīng)刪除；或其組合。在另一例示性實施方式中，所述分 離的多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO: 77 (A05)、SEQ ID NO: 44 (B44)或其組合。在一 個實施方式中，用于激發(fā)對0RF2086亞家族A血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性 抗體的免疫原性組合物包括非丙酮酸化且非脂化之A05、A12及A62多肽中之至少一者。參 見例如實施例18至19。
[0245] 當給哺乳動物施用包括至少兩種如上文所述之非丙酮酸化且非脂化之0RF2086 多肽的例示性免疫原性組合物時，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)相較于包括一種各別非丙酮酸化且非 脂化之0RF2086多肽的免疫原性組合物，可引起針對腦膜炎雙球菌之血清群B的協(xié)同殺細 菌性免疫應答。參見，例如，實施例19。因此，在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括 至少一種第一非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽，其與至少一種第二非丙酮酸化且非脂 化之0RF2086多肽協(xié)同作用以引起針對腦膜炎雙球菌之血清群B的免疫應答。
[0246] 另一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對腦膜炎雙球菌之血清群C具特異性 之殺細菌性抗體的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效量的如上文所述之來自腦膜炎 雙球菌血清群B之分離的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見，例 如，實施例22。在一個實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:71中所示之氨基酸序列或選自 以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21， 其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在一個實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:71中所示之 氨基酸序列或選自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20 及SEQ ID N0:21，其中位置1之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。在另一實施方式 中，所述免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之綴合物：a)腦膜炎雙球菌血清群 A之莢膜糖之綴合物，b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物，c)腦膜炎雙球菌血清 群W135之莢膜糖之綴合物，及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。例示性免疫 原性組合物包括至少一種分離的非丙酮酸化且非脂化之A62多肽及a)腦膜炎雙球菌血清 群A之莢膜糖之綴合物，b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物，c)腦膜炎雙球菌血 清群W135之莢膜糖之綴合物，及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0247] 另一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對腦膜炎雙球菌之血清群Y具特異性 之殺細菌性抗體的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效量的如上文所述之來自腦膜炎 雙球菌血清群B之分離的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見，例 如，實施例22。在一個實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:71中所示之氨基酸序列或選自 以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21， 其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在一個實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:71中所示之 氨基酸序列或選自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、 SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20 及SEQ ID N0:21，其中位置I之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。在另一實施方式 中，所述免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之綴合物：a)腦膜炎雙球菌血清群 A之莢膜糖之綴合物，b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物，c)腦膜炎雙球菌血清 群W135之莢膜糖之綴合物，及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0248] 另一方面，本發(fā)明涉及一種激發(fā)哺乳動物之對腦膜炎雙球菌之血清群X具特異性 之殺細菌性抗體的方法。該方法包括給該哺乳動物施用有效量的如上文所述之來自腦膜炎 雙球菌血清群B之分離的非丙酮酸化且非脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見例 如實施例22。在一個實施方式中，該多肽包括SEQ ID NO: 71中所示之氨基酸序列或選自以 下序列的氨基酸序列：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21，其中 位置I之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在一個實施方式中，該多肽包括SEQ ID N0:71中所示之氨基 酸序列或選自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID N0:21，其中位置1之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。在另一實施方式中，免疫 原性組合物進一步包括至少一種選自以下之綴合物：a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之 綴合物，b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物，c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜 糖之綴合物，及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0249] 當給哺乳動物施用如上文所述包括四種非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽及 腦膜炎雙球菌血清群A、C、W135及Y中之每一者之莢膜糖之綴合物的例示性免疫原性組合 物時，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，相較于不存在莢膜糖之綴合物且包括0RF2086多肽之免疫原性 組合物，以及相較于不存在0RF2086多肽且包括腦膜炎雙球菌血清群A、C、W135及Y中之 每一者之莢膜糖之綴合物的免疫原性組合物，可引起至少針對腦膜炎雙球菌之血清群B、C 及Y之協(xié)同殺細菌性免疫應答。參見，例如，實施例22。因此，在一個實施方式中，所述免疫 原性組合物包括至少一種非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽，其與腦膜炎雙球菌血清群 A、C、W135及Y之莢膜糖之至少一種綴合物協(xié)同作用以引起針對腦膜炎雙球菌之免疫應答。 所引起之免疫應答可針對腦膜炎雙球菌之血清群B、C及Y中之至少一者。所述免疫原性組 合物可包括由來自奈瑟菌屬0RF2086之核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)、其多核苷酸或等效物作 為該免疫原性組合物中之唯一活性免疫原。或者，免疫原性組合物可進一步包括活性免疫 原，包括其它奈瑟菌屬免疫原性多肽，或一或多種其它微生物病原體（例如但不限于病毒、 朊病毒、細菌或真菌）之免疫活性蛋白或莢膜多糖。所述組合物可包含所選適應癥所需之 一或多種所需蛋白質(zhì)、片段或藥物化合物。
[0250] 本發(fā)明涵蓋任何多抗原或多價免疫原性組合物。舉例而言，免疫原性組合物可 包括兩種或兩種以上0RF2086蛋白之組合、0RF2086蛋白與一或多種Por A蛋白之組合、 0RF2086蛋白與腦膜炎雙球菌血清群A、C、Y及W135多糖和/或多糖綴合物之組合、0RF2086 蛋白與腦膜炎雙球菌及肺炎球菌（pneumococcus)的組合之組合，或上述任一者之組合，呈 適于所需施用，例如適于黏膜傳遞之形式。本領域技術(shù)人員將容易地調(diào)配此類多抗原或多 價免疫組合物。
[0251] 一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之 分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及選自以下之至少一種綴合物：a)腦膜炎雙 球菌血清群A之莢膜糖之綴合物，b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物，c)腦膜炎 雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物，及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0252] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之分離 的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽及該等綴合物中之至少兩者。在另一實施方式中， 該組合物包括該等綴合物中之至少三者。舉例而言，所述組合物可包括來自以下之糖：血清 群A及C ;血清群A及W135 ;血清群A及Y ;血清群C及W135 ;血清群W135及Y ;血清群A、 C及W135 ;血清群A、C及Y ;血清群A、W135及Y ;血清群C及W135及Y。優(yōu)選包括至少一 種血清群C糖之組合物（例如C及Y)。
[0253] 在另一實施方式中，所述免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之分離 的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽及四種綴合物，例如腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜 糖之綴合物；腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物；腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜 糖之綴合物；及腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
[0254] 在一優(yōu)選實施方式中，所述綴合物為莢膜糖與載體蛋白之綴合物。適合之載體蛋 白在此項技術(shù)中為已知的。優(yōu)選地，所述載體蛋白為細菌毒素，諸如白喉或破傷風毒素，或 其類毒素或突變體。最優(yōu)選地，所述載體蛋白為CRM197。舉例而言，在一個實施方式中，所述 組合物包括至少一種選自以下之綴合物：(a) (i)血清群A腦膜炎雙球菌之莢膜糖與（ii) CRM197之綴合物；(b) (i)血清群C腦膜炎雙球菌之莢膜糖與（ii)CRM197之綴合物；（c) (i)血 清群W135腦膜炎雙球菌之莢膜糖與（ii) CRM197之綴合物；及（d) (i)血清群Y腦膜炎雙球 菌之莢膜糖與（iDCRM197之綴合物。
[0255] 血清群A、C、W135及Y之莢膜糖是本領域已加以表征且為已知的。舉例而言，血清 群A腦膜炎雙球菌之莢膜糖為（a 1 - 6)連接型N-乙?；?D-甘露糖胺-1-磷酸鹽之均 聚物，其中在C3及C4位置經(jīng)部分0-乙?；?。C3位置之乙酰化可占70%至95%。用于純 化糖之條件可導致去0-乙?；ɡ缭趬A性條件下），但保留此C3位置之OAc為有用的。 在一些實施方式中，血清群A糖中至少50% (例如至少60%、70%、80%、90%、95%或大于 95%)之甘露糖胺殘基在C3位置經(jīng)0-乙酰化?？捎梅忾]基團置換乙?；苑乐顾猓?這些經(jīng)修飾之糖仍為本發(fā)明之含義內(nèi)的血清群A糖。
[0256] 血清群C莢膜糖為（α 2 - 9)連接型唾液酸（Ν-乙?；窠?jīng)胺糖酸）之均聚物。 大部分血清群C菌株在唾液酸殘基之C7和/或C8處具有0-乙?；恍┡R床分離物沒 有這些0-乙?；?。
[0257] 血清群W135糖為唾液酸-半乳糖二糖單元之聚合物。如同血清群C糖，其具有可 變之0-乙酰化，但在唾液酸7位及9位上經(jīng)0-乙酰化。結(jié)構(gòu)系寫為：一4) -D-NeupNAc (7/ 90Ac) - α - (2 - 6) -D-Gal- α - (1 -。
[0258] 血清群Y糖類似于血清群W135糖，除了二糖重復單元包括葡萄糖而非半乳糖。血 清群 Y 結(jié)構(gòu)系寫為：一4)-D_NeupNAc(7/90Ac)-a-(2 -6)-D-Glc_a-(l -。如同血清群 W135,其在唾液酸7位及9位上具有可變之0-乙?；?。
[0259] 根據(jù)本發(fā)明使用之糖可如上文所述經(jīng)0-乙酰化，例如，具有與在天然莢膜糖中所 見之〇-乙?；Ｊ较嗤末?乙?；Ｊ?，或其可在糖環(huán)之一或多個位置部分或完全地去 〇-乙酰化，或其相對于天然莢膜糖可經(jīng)高度〇-乙酰化。
[0260] 在一個實施方式中，所述免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之分離 的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及選自以下之至少一種綴合物：a)腦膜炎雙球菌 血清群A之莢膜糖之綴合物，b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物，c)腦膜炎雙球 菌血清群W135之莢膜糖之綴合物，及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物，其中該 非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽包括以下至少一者：B44、B09、A05、B22、A12、A22、A62、 B24、B16、B15及B03。在一個實施方式中，所述多肽包括選自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及 SEQ ID N0:75。在另一實施方式中，所述多肽包括選自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID N0:17、 SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:60及SEQ ID N0:20,其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。在另一 實施方式中，所述多肽包括選自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:60及SEQ ID N0:20,其中位置1之半胱氨酸經(jīng)不為Cys殘基之氨基酸取代。
[0261] 本發(fā)明亦涵蓋多免疫接種方案，其中可將任何適用于針對病原體之組合物組合于 本發(fā)明之組合物中或與本發(fā)明之組合物組合。舉例而言（不限于），可給患者施用本發(fā)明之 免疫原性組合物及另一用于針對人類乳頭狀瘤病毒（HPV)進行免疫接種之免疫組合物（諸 如HPV疫苗GARDASIL?)作為多免疫接種方案之一部分。本領域技術(shù)人員將能夠容易 地選擇連同本發(fā)明之免疫原性組合物一起使用之免疫原性組合物以達成開發(fā)及執(zhí)行多免 疫接種方案之目的。
[0262] 可使用0RF2086多肽、片段及等效物作為綴合物免疫原性組合物之一部分；其中 一或多種蛋白質(zhì)或多肽綴合于載體以產(chǎn)生針對多種血清型或腦膜炎雙球菌之血清型，尤其 針對腦膜炎雙球菌血清群（尤其為血清群B)和/或針對多種疾病具有免疫原性特性的組 合物。或者，可使用一種0RF2086多肽作為其它免疫原性多肽之載體蛋白。該等免疫原性 組合物之調(diào)配為本領域技術(shù)人員所熟知。
[0263] 本發(fā)明之免疫原性組合物優(yōu)選包括藥學可接受之賦形劑、稀釋劑和/或載劑。適 合之藥學可接受之賦形劑、載劑和/或稀釋劑包括任何及所有常規(guī)之溶劑、分散介質(zhì)、填充 齊?、固體載劑、水溶液、包覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑等。適合之藥學 可接受之賦形劑、稀釋劑和/或載劑包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、右旋糖、甘油、乙 醇等之一或多者以及其組合。
[0264] 藥學可接受之賦形劑、稀釋劑和/或載劑可進一步包括少量輔助物質(zhì)，諸如濕潤 劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其增強抗體之存放期或有效性。藥學可接受之賦形劑、稀釋 劑和/或載劑之制備及使用是本領域所熟知的。除非與活性成分不兼容，計劃將任何常規(guī) 介質(zhì)或試劑用于本發(fā)明之免疫原性組合物中。
[0265] 免疫原性組合物可非經(jīng)腸施用，例如藉由皮下注射或肌肉內(nèi)注射，以及經(jīng)口或鼻 內(nèi)施用。肌肉內(nèi)免疫接種之方法由Wolff等人，Biotechniques ;11 (4) :474-85, (1991)及 Sedegah等人，PNAS第91卷，第9866-9870頁，（1994)描述。其它施用方式使用例如（不 限于）口服配制品、肺部配制品、栓劑及經(jīng)皮施用。口服配制品包括，例如，常用之賦形劑， 諸如（不限于）醫(yī)藥級甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。優(yōu)選地， 肌肉內(nèi)施用免疫原性組合物。
[0266] 本發(fā)明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種其它"免疫調(diào)節(jié)劑"，其為 干擾或改變免疫系統(tǒng)的藥劑，從而可觀察到體液和/或細胞介導免疫上調(diào)或下調(diào)。在 一個特定實施方式中，優(yōu)選體液和/或細胞介導免疫上調(diào)。某些免疫調(diào)節(jié)劑之實例尤 其包括例如佐劑或細胞激素，或美國專利第5, 254, 339號中所述之ISCOMTRIX (CSL Limited, Parkville, Australia)〇
[0267] 可用于本發(fā)明之疫苗中之佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(tǒng)（Ribi Inc.，Hamilton, Mont.)、明研^、礦物凝膠（諸如氫氧化錯凝膠）、水包油乳液、油包水乳 液（諸如弗氏（Freund's)完全佐劑及不完全佐劑）、嵌段共聚物（CytRx, Atlanta Ga.)、 QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge Mass. )>SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.)> AMPHIGEN?佐劑、皂素 、Quil A或其它皂素流分、單磷?；|(zhì)A及阿夫立定 (Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑。適用于本發(fā)明疫苗中之水包油乳液之非限制性實例包括經(jīng)改 質(zhì)SEAM62及SEAM 1/2配制品。經(jīng)改質(zhì)SEAM62為含有5% (v/v)角鯊烯（Sigma)、l% (v/ ￥)§卩八]^@'85清潔劑（1〇131^1^(^&11七8)、0.7(%(￥八）|)〇丨>^〇1七&16?80清潔劑（1〇1 Surfactants)、〗』％ (v/v)乙醇、200yg/ml Quil A、100yg/ml 膽固醇及 0.5% (v/v)卵 磷脂之水包油乳液。經(jīng)改質(zhì)SEAM 1/2為包含以下之水包油乳液：5% (v/v)角鯊烯、I % (v/ V) SPAN? 85 清潔劑、0.7 % (v/v)聚山梨醇酯 80 清潔劑、2.5 % (v/v)乙醇、100 μ g/ml Quil A 及 50 μ g/ml 膽固醇。
[0268] 可包括在疫苗中之其它"免疫調(diào)節(jié)劑"包括，例如，一或多種白介素、干擾素或其它 已知細胞激素或趨化因子。在一個實施方式中，所述佐劑可為環(huán)糊精衍生物或聚陰離子性 聚合物，諸如美國專利第6, 165, 995號及第6, 610, 310號中所分別描述者。應了解，欲使用 之免疫調(diào)節(jié)劑和/或佐劑將視將接受疫苗或免疫原性組合物施用之個體、注射途徑及欲給 與之注射次數(shù)而定。
[0269] 在一些實施方式中，所述佐劑為皂素。在一些實施方式中，皂素濃度為1 μ g/ml至 250 μ g/ml ;5 μ g/ml 至 150 μ g/ml ;或 10 μ g/ml 至 100 μ g/ml。在一些實施方式中，阜素 濃度為約 I U g/ml ;約 5 μ g/ml ;約 10 μ g/ml ;約 20 μ g/ml ;約 30 μ g/ml ;約 40 μ g/ml ;約 50 μ g/ml ;約 60 μ g/ml ;約 70 μ g/ml ;約 80 μ g/ml ;約 90 μ g/ml ;約 100 μ g/ml ;約 110 μ g/ ml ;約 120 μ g/ml ;約 130 μ g/ml ;約 140 μ g/ml ;約 150 μ g/ml ;約 160 μ g/ml ;約 170 μ g/ ml ;約 180 μ g/ml ;約 190 μ g/ml ;約 200 μ g/ml ;約 210 μ g/ml ;約 220 μ g/ml ;約 230 μ g/ ml ;約 240 μ g/ml ;或約 250 μ g/ml。
[0270] 在某些優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明之蛋白質(zhì)用于口服施用之免疫原性組合物中， 該組合物包括黏膜佐劑且用于治療或預防人類宿主之腦膜炎雙球菌感染。該黏膜佐劑可為 霍亂毒素；然而，優(yōu)選地，除霍亂毒素以外的可根據(jù)本發(fā)明使用之黏膜佐劑包括霍亂全毒素 之無毒衍生物（其中A亞基是經(jīng)誘變的）、經(jīng)化學修飾之霍亂毒素或藉由修飾霍亂毒素氨 基酸序列所產(chǎn)生之相關(guān)蛋白質(zhì)。對于可尤其適用于制備本發(fā)明之免疫原性組合物的特定 霍亂毒素，參見如國際公開申請案WO 00/18434中所公開的突變體霍亂全毒素 E29H,該申 請案以全文引用的方式并入本文。可將這些佐劑添加至本發(fā)明多肽中或與本發(fā)明多肽綴 合。相同技術(shù)可應用于其它具有黏膜佐劑或傳遞特性之分子，諸如大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒 素（LT)。
[0271] 可使用具有黏膜佐劑或傳遞活性之其它化合物，諸如膽汁；聚陽離子，諸如 DEAE-葡聚糖及聚鳥氨酸；清潔劑，諸如十二烷基苯硫酸鈉；脂質(zhì)綴合材料；抗生素，諸如 鏈霉素；維生素 A ;及其它可改變黏膜表面之結(jié)構(gòu)或功能完整性的化合物。其它黏膜活 性化合物包括微生物結(jié)構(gòu)之衍生物，諸如MDP ;吖啶及西咪替丁。亦可使用如上文所述之 SHMUL0N?QS-21、MPL 及 IL-12。
[0272] 本發(fā)明之免疫原性組合物可以ISCOMS (免疫刺激復合物）、含有CTB之ISCOMSJg 質(zhì)體或密封于諸如丙烯酸酯或聚（DL-丙交酯-共-乙交酯）之化合物中形成具有適于吸 附之尺寸的微球體形式傳遞。本發(fā)明之蛋白質(zhì)亦可并入油性乳液中。
[0273] 給患者施用之免疫原性組合物之量（亦即劑量）可根據(jù)為本領域技術(shù)人員所知之 標準技術(shù)，在考慮諸如特定抗原、佐劑（若存在）、特定患者之年齡、性別、體重、物種、病狀 及投藥途徑之因素下來確定。
[0274] 舉例而言,用于青年人類患者之劑量可包括至少0. 1 μ g、l μ g、10y g或50μ g奈 瑟菌屬0RF2086蛋白質(zhì)，及至多80μ g、100y g、150y g或200μ g奈瑟菌屬0RF2086蛋白質(zhì)。 任何最小值與任何最大值可組合以確定適合范圍。
[0275] 佐劑
[0276] 如本文所述之免疫原性組合物在某些實施方式中亦包含一或多種佐劑。佐劑為在 連同免疫原或抗原一起施用時增強免疫應答之物質(zhì)。已經(jīng)顯示，多種細胞激素或淋巴因子 具有免疫調(diào)節(jié)活性，且因此適用作佐劑，所述細胞激素或淋巴因子包括（但不限于）白介素 1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見例如美國專利第 5, 723, 127 號）、13、14、15、16、17 及 18 (及其突變形式）；干擾素-α、干擾素-β及干擾素 -Y ;粒細胞-巨噬細胞群落刺激因 子（GM-CSF)(參見，例如，美國專利第5, 078, 996號及ATCC保藏號39900);巨噬細胞群落 刺激因子（M-CSF);粒細胞群落刺激因子（G-CSF);及腫瘤壞死因子α及β。
[0277] 適于與本文所述之免疫原性組合物一起使用之其它佐劑包括趨化因子，包括（不 限于）MCP-l、MIP-lα、MIP-lβ及RANTES ;黏附分子，諸如選擇素，例如L-選擇素、P-選擇 素及E-選擇素；黏蛋白樣分子，例如⑶34、GlyCAM-l及MadCAM-I ;整合素家族之成員，諸如 LFA-I、VLA-I、Mac-l及pl50. 95 ;免疫球蛋白超家族之成員，諸如PECAM、ICAM，例如ICAM-I、 ICAM-2及ICAM-3，CD2及LFA-3 ;共刺激分子，諸如B7-1、B7-2、CD40及CD40L ;生長因子，包 括血管生長因子、神經(jīng)生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、PDGF、BL-1及血管內(nèi) 皮生長因子；受體分子，包括 Fas、TNF 受體、Flt、Ap〇-l、p55、WSL-l、DR3、TRAMP、Ap〇-3、AIR、 LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2 及 DR6 ;及半胱天冬酶（Caspase) (ICE)。
[0278] 其它例示性佐劑包括（但不限于）氫氧化鋁；磷酸鋁；SHMUL0N?QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc.，F(xiàn)ramingham, Mass.) ;MPL?(3-〇-去醜化單憐醜基脂質(zhì) A ; Corixa, Hamilton, Mont.)、529 (氨基燒基葡糖胺憐酸鹽化合物，Corixa, Hamilton, Mont.)、 IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass. ) ; GM-CSF (Immunex Corp.，Seattle, Wash.) ;N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺（thr-MDP); N-乙?；?去甲基-胞壁酰基-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺（CGP 11637,稱為nor-MDP); N-乙?；邗；?L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(Γ -2' -二棕櫚酰 基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基-乙胺）（CGP 19835Α，稱為ΜΤΡ-ΡΕ);及霍亂毒素。在某 些優(yōu)選實施方式中，所述佐劑為QS-21。
[0279] 其它例示性佐劑包括霍亂毒素之無毒衍生物，包括其A亞基，和/或腦膜炎雙球 菌多肽與霍亂毒素或其B亞基（"CTB"）之綴合物或遺傳工程改造融合物、前類霍亂原 (procholeragenoid)、真菌多糖，包括裂裥菌素、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽（"MDP"）衍生物、 佛波醇酯、大腸桿菌之熱不穩(wěn)定毒素、嵌段聚合物或皂素。
[0280] 磷酸鋁已作為佐劑用于1期臨床試驗中，其濃度為每劑0. 125mg，比由美國聯(lián)邦 法規(guī)[610. 15(a)]規(guī)定之極限每劑0.85mg低得多。含鋁佐劑廣泛用于人類以在肌肉內(nèi) 或皮下施用時加強抗原之免疫應答。在一些實施方式中，所述免疫原性組合物中鋁之濃 度為 0· 125 μ g/ml 至 0· 5 μ g/ml ;0· 20 μ g/ml 至 0· 40 μ g/ml ;或 0· 20 μ g/ml 至 0· 30 μ g/ ml。在一些實施方式中，所述免疫原性組合物中鋁之濃度為約0. 125 μ g/ml ;約0. 15 μ g/ ml ;約 0· 175 μ g/ml ;約 0· 20 μ g/ml ;約 0· 225 μ g/ml ;約 0· 25 μ g/ml ;約 0· 275 μ g/ml ; 約 0· 30 μ g/ml ;約 0· 325 μ g/ml ;約 0· 35 μ g/ml ;約 0· 375 μ g/ml ;約 0· 40 μ g/ml ;約 0· 425 μ g/ml ;約 0· 45 μ g/ml ;約 0· 475 μ g/ml ;或約 0· 50 μ g/ml。
[0281] 在一優(yōu)選實施方式中，所述免疫原性組合物中鋁之濃度為0. 125mg/ml至0. 5mg/ ml ;0· 20mg/ml 至 0· 40mg/ml ;或 0· 20mg/ml 至 0· 30mg/ml。在一些實施方式中，所述免疫 原性組合物中錯之濃度為約〇· 125mg/ml ;約0· 15mg/ml ;約0· 175mg/ml ;約0· 20mg/ml ;約 0· 225mg/ml ;約 0· 25mg/ml ;約 0· 275mg/ml ;約 0· 30mg/ml ;約 0· 325mg/ml ;約 0· 35mg/ml ; 約 0· 375mg/ml ;約 0· 40mg/ml ;約 0· 425mg/ml ;約 0· 45mg/ml ;約 0· 475mg/ml ;或約 0· 50mg/ ml 〇
[0282] 適用于增強免疫應答之佐劑進一步包括（不限于）MPL?(3-0_去?；瘑瘟柞?基脂質(zhì)A，Corixa, Hamilton, MT),其描述于美國專利第4,912,094號中。合成脂質(zhì)A類 似物或氨基烷基葡萄糖胺磷酸鹽化合物（AGP)或其衍生物或類似物亦適用作佐劑，其可 自Corixa(Hamilton, MT)獲得且描述于美國專利第6, 113, 918號中。一種這樣的AGP為 2_[ (R) -3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脫氧-4-0-膦?；?3-0-[ (R) -3-十四酰氧基 十四酰基]-2- [ (R) -3-十四酰氧基十四?；?氨基]-b-D-批喃葡萄糖苷，其亦稱為529 (原 先稱作RC529)。此529佐劑系調(diào)配成水性形式（AF)或穩(wěn)定乳液（SE)。
[0283] 其它佐劑包括胞壁酰肽，諸如N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨?；?D-異谷氨酰 胺（thr-MDP)、N-乙?；?去甲基胞壁?；?L-丙氨酸-2- (Γ -2' -二棕櫚?；?sn-甘油 基-3-羥基磷酰氧基）-乙胺（MTP-PE);水包油乳液，諸如MF59 (美國專利第6, 299, 884號） (含有5%角鯊烯、0. 5%聚山梨醇酯80及0. 5% SPAN 85(任選地，含有各種量之MTP-PE)， 使用微流化床（諸如型號IlOY之微流化床（Microfluidics，Newton，MA))調(diào)配成次微米 顆粒），及SAF(含有10%角鯊烯、0. 4%聚山梨醇酯80、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121及 thr-MDP，微流體化成次微米乳液或渦旋產(chǎn)生較大粒度之乳液）；不完全弗氏佐劑（IFA); 鋁鹽（明礬），諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛菲金；阿夫立定；L121/角鯊烯；D-丙交 酯-聚乳酸交酯/糖苷；普朗尼克多元醇；殺死之博德氏桿菌（Bordetella);皂素，諸如 Stimulon? QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.)(描述于美國專利第 5, 057, 540 號中）、 ISCOMATRIX(CSL Limited，Parkville，Australia)(描述于美國專利第 5,254,339 號中） 及免疫刺激復合物（ISC0MATRIX);結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis);細菌脂 多糖；合成的多核苷酸，諸如含有CpG基序之寡核苷酸（例如美國專利第6,207, 646號）； IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria)，描述于歐洲專利第 1，296, 713 號及第 1，326, 634 號中；百日咳毒素（PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體（例如美國專利第7, 285, 281號、 第7, 332, 174號、第7, 361，355號及第7, 384, 640號）；或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素（LT) 或其突變體，特別是LT-K63、LT-R72 (例如美國專利第6, 149, 919號、第7, 115, 730號及第 7, 291，588 號）。
[0284] 產(chǎn)生非脂化之P2086抗原的方法
[0285] 一方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生非丙酮酸化且非脂化之0RF2086多肽的方法。該方 法包括使編碼0RF2086多肽之核苷酸序列表達，在該0RF2086多肽中，相較于相應之野生型 序列，N端半胱氨酸系經(jīng)刪除，且其中該核苷酸序列可操作地連接至能夠在細菌細胞中表達 之表達系統(tǒng)。藉由該方法產(chǎn)生之例示性多肽包括本文所述之任何多肽。舉例而言，優(yōu)選地， 所述多肽具有以下所示之氨基酸序列：SEQ ID NO: 12 ;SEQ ID NO: 13 ;SEQ ID NO: 14 ;SEQ ID NO: 15 ；SEQ ID NO: 16 ；SEQ ID NO: 17 ；SEQ ID NO: 18 ；SEQ ID NO: 19 ；SEQ ID NO:20 ；SEQ ID N0:21 ;SEQ ID N0:58;SEQ ID N0:70,其中相較于相應之野生型序列，位置I之半胱氨酸系 經(jīng)刪除。在另一優(yōu)選實施方式中，所述多肽具有SEQ ID N0:76中所示之氨基酸序列，其中 位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。其它例示性多肽包括具有選自以下之氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:62、SEQ IDN0:64、SEQIDN0:66、SEQIDN0:68、SEQIDN0:71及SEQIDN0:75。另一例示性多肽 包括具有氨基酸序列SEQ ID NO: 77之多肽。其它實例包括SEQ ID NO: 80 (B24)及SEQ ID NO:81 (B24)。該方法進一步包括純化該多肽。
[0286] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生可溶性非脂化之P2086抗原的方法，其 包含以下步驟：將0RF2086變體核酸序列克隆至無脂化控制序列之大腸桿菌表達載體中， 用0RF2086表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細菌，誘導表達及分離所表達之P2086蛋白。在一些實 施方式中，用IPTG誘導表達。
[0287] 在一些實施方式中，0RF2086變體之N端Cys之密碼子系經(jīng)刪除。這樣的密碼子之 實例包括TGC。在一些實施方式中，藉由點誘變使0RF2086變體之N端Cys之密碼子突變以 產(chǎn)生Ala、Gly或Val密碼子。在一些實施方式中，將Ser及Gly密碼子添加至0RF2086變體 之N端尾中以延伸與N端Cys緊鄰之下游處的Gly/Ser莖部。在一些實施方式中，Gly/Ser 莖部內(nèi)Gly及Ser殘基之總數(shù)為至少7、8、9、10、11或12。在一些實施方式中，N端Cys之 密碼子系經(jīng)刪除。在一些實施方式中，N端7個、8個、9個、10個、11個或12個殘基為Gly 或 Ser0
[0288] 在一些實施方式中，藉由點誘變將非脂化之0RF2086變體之N端尾之密碼子優(yōu) 化。在一些實施方式中，將非脂化之0RF2086變體之N端尾優(yōu)化以匹配B09變體之N端 尾。在一些實施方式中，藉由點誘變將0RF2086變體之N端尾之密碼子優(yōu)化，從而使得編碼 0RF2086變體之第五個氨基酸之密碼子與SEQ ID N0:8之核苷酸13至15 100%相同，且編 碼0RF2086變體之第十三個氨基酸之密碼子與SEQ ID N0:8之核苷酸37至39100%相同。 在一些實施方式中，將非脂化之0RF2086變體之N端尾優(yōu)化，以使得5'端45個核酸與SEQ ID NO:8之核酸1至45100%相同。在一些實施方式中，將非脂化之0RF2086變體之N端尾 優(yōu)化，以使得5'端42個核酸與SEQ ID N0:8之核酸4至45 100%相同。在一些實施方式 中，將非脂化之0RF2086變體之N端尾優(yōu)化，以使得5'端39個核酸與SEQ ID NO: 8之核酸4 至42 100%相同。在一些實施方式中，非脂化之P2086變體之N端尾相較于SEQ ID NO: 18 之氨基酸1至15包含至少一處氨基酸取代。在一些實施方式中，非脂化之P2086變體之N 端尾相較于SEQ ID NO: 18之氨基酸1至15包含兩處氨基酸取代。在一些實施方式中，非 脂化之P2086變體之N端尾相較于SEQ ID NO: 18之氨基酸2至15包含至少一處氨基酸取 代。在一些實施方式中，非脂化之P2086變體之N端尾相較于SEQ ID NO: 18之氨基酸2至 15包含兩處氨基酸取代。在一些實施方式中，所述氨基酸取代為保守氨基酸取代。
[0289] 在一些實施方式中，非脂化之變體之密碼子已經(jīng)優(yōu)化以使表達增加。密碼子優(yōu)化 是本領域已知的。參見例如 Sastalla 等人，Applied and Environmental Microbiology, 第 75 (7)卷：2099-2110(2009)及 Coleman 等人，Science,第 320 卷：1784(2008)。在一些 實施方式中，密碼子優(yōu)化包括將氨基酸序列之密碼子利用率與所選擇而包括和/或不包括 特定DNA序列之宿主生物體之密碼子頻率相匹配。在一些實施方式中，密碼子優(yōu)化進一步 包括最小化相應二級mRNA結(jié)構(gòu)以減少翻譯障礙。在一些實施方式中，N端尾已經(jīng)密碼子優(yōu) 化而包含SEQ ID N0:28、30、32及34中之任一者。在一些實施方式中，Gly/Ser莖部已經(jīng) 密碼子優(yōu)化而包含SEQ ID N0:28、30、32及34中之任一者。
[0290] 為了可更好地理解本發(fā)明，闡述以下實施例。這些實施例僅出于說明之目的而不 視作限制本發(fā)明范疇。
[0291] 免疫原性組合物配制品
[0292] 在某些實施方式中，本發(fā)明之免疫原性組合物進一步包含以下至少一者：佐劑、緩 沖劑、低溫保護劑、鹽、二價陽離子、非離子型清潔劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載劑。
[0293] 本發(fā)明之免疫原性組合物除復數(shù)種腦膜炎雙球菌蛋白質(zhì)抗原及莢膜多糖-蛋白 質(zhì)綴合物之外亦可進一步包含一或多種防腐劑。FDA要求多劑量（多劑量）小瓶中之生物 學產(chǎn)品含有防腐劑，僅有少數(shù)例外。含有防腐劑之疫苗產(chǎn)品包括含有以下之疫苗：芐索氯銨 (benzethonium chloride)(炭疽）、2_ 苯氧乙醇（DTaP、HepA、萊姆病（Lyme)、脊髓灰質(zhì)炎 (Polio)(非經(jīng)腸））、苯酚（肺炎球菌（Pneumo)、傷寒（非經(jīng)腸）、牛痘）及硫柳萊（DTaP、 01\了(1、!1印8、!1讓、流感、邛161^叩、？11611111 〇、狂犬?。Ｅ鷾视糜诳勺⑸渌幬镏栏瘎┌?， 例如，氯丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、芐索氯銨、氯化 苯甲烴銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
[0294] 本發(fā)明的配制品可進一步包含以下一或多者：緩沖劑、鹽、二價陽離子、非離子型 清潔劑、低溫保護劑（諸如糖）及抗氧化劑（諸如自由基清除劑或螯合劑），或其任何多重 組合。對任一種組分（例如螯合劑）之選擇可決定是否需要另一組分（例如清除劑）。所 調(diào)配的用于施用之最終組合物應為無菌和/或無熱原的。本領域技術(shù)人員可，根據(jù)多種因 素，諸如所需之特定儲存及投藥條件，憑經(jīng)驗確定這些及其它組分的那些組合用于納入含 有防腐劑之本發(fā)明免疫原性組合物中是最佳的。
[0295] 在某些實施方式中，與非經(jīng)腸施用相容之本發(fā)明配制品包含一或多種選自（但不 限于）以下之生理學上可接受之緩沖劑：Tris (三甲胺）、磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸 鹽、甘氨酸、組氨酸及丁二酸鹽。在某些實施方式中，將配制品緩沖至約6. 0至約9. 0,優(yōu)選 約6. 4至約7. 4之pH值范圍內(nèi)。
[0296] 在某些實施方式中，可能需要調(diào)節(jié)本發(fā)明之免疫原性組合物或配制品之pH值?？?使用本領域標準技術(shù)調(diào)節(jié)本發(fā)明之配制品之PH值。可將配制品之pH值調(diào)節(jié)至3. 0至8. 0。 在某些實施方式中，配制品之pH值可為，或可調(diào)節(jié)至3. 0至6. 0、4. 0至6. 0或5. 0至8. 0。 在其它實施方式中，配制品之pH值可為，或可調(diào)節(jié)至約3. 0、約3. 5、約4. 0、約4. 5、約5. 0、 約5. 5、約5. 8、約6. 0、約6. 5、約7. 0、約7. 5或約8. 0。在某些實施方式中，pH值可為，或 可調(diào)節(jié)至以下范圍內(nèi)：4· 5至7. 5,或4. 5至6. 5、5. 0至5. 4、5· 4至5. 5、5· 5至5. 6、5· 6至 5. 7、5. 7 至 5. 8、5. 8 至 5. 9、5. 9 至 6. 0、6. 0 至 6. 1、6. 1 至 6. 2、6. 2 至 6. 3、6. 3 至 6. 5、6. 5 至7. 0、7. 0至7. 5或7. 5至8. 0。在一特定實施方式中，配制品之pH值為約5. 8。
[0297] 在某些實施方式中，與非經(jīng)腸施用相容之本發(fā)明配制品包含一或多種二價陽離 子，包括（但不限于）MgCl 2、CaCl2及MnCl2，濃度在約0. ImM至約IOmM范圍內(nèi)，優(yōu)選至多約 5mM〇
[0298] 在某些實施方式中，與非經(jīng)腸施用相容之本發(fā)明配制品包含一或多種鹽，包括 (但不限于）氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉及硫酸鉀，所述鹽以在非經(jīng)腸施用時對于個體而言在 生理學上可接受之離子強度存在，且以在最終配制品中產(chǎn)生所選離子強度或同滲容摩的最 終濃度納入。配制品之最終離子強度或同滲重摩將由多種組分（例如，來自緩沖化合物及 其它非緩沖鹽之離子）決定。優(yōu)選之鹽，即NaCl在至多約250mM之范圍內(nèi)存在，其中選擇 鹽濃度以補充其它組分（例如糖），因此配制品之最終總同滲容摩與非經(jīng)腸施用（例如肌肉 內(nèi)或皮下注射）兼容且將促進免疫原性組合物配制品之免疫原性組分在各種溫度范圍內(nèi) 之長期穩(wěn)定性。無鹽配制品將耐受一或多種所選低溫保護劑之范圍增加以維持所需之最終 同滲容摩水平。
[0299] 在某些實施方式中，與非經(jīng)腸施用相容之本發(fā)明配制品包含一或多種選自（但不 限于）以下之低溫保護劑：二糖（例如，乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖）及多羥基烴（例如半 乳糖醇、甘油、甘露糖醇及山梨糖醇）。
[0300] 在某些實施方式中，配制品之同滲容摩在約200m0s/L至約800m0s/L范圍內(nèi)，其中 優(yōu)選范圍為約250m0s/L至約500m0s/L或約300m0s/L至約400m0s/L。無鹽配制品可含有， 例如，約5%至約25%蔗糖，且優(yōu)選含有約7%至約15%或約10%至約12%蔗糖?；蛘?，無 鹽配制品可含有例如約3%至約12%山梨糖醇，且優(yōu)選含有約4%至7%或約5%至約6% 山梨糖醇。若添加諸如氯化鈉之鹽，則相對減少蔗糖或山梨糖醇之有效范圍?？紤]這些及 其它這樣的同滲重摩及同滲容摩完全處于本領域技術(shù)范圍內(nèi)。
[0301] 在某些實施方式中，與非經(jīng)腸施用相容之本發(fā)明配制品包含一或多種自由基氧化 抑制劑和/或螯合劑。多種自由基清除劑及螯合劑在此項技術(shù)中為已知的且適用于本文所 述之配制品及使用方法。實例包括（但不限于）乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘 露糖醇、組氨酸、甘油、檸檬酸鈉、肌醇六磷酸、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、丁二酸 / 丁二酸鹽、蘋果酸/蘋果酸鹽、甲磺酸去鐵銨、EDDHA及DTPA，以及上述中的兩者或兩者以 上之各種組合。在某些實施方式中，可以添加有效增強配制品之長期穩(wěn)定性的濃度的至少 一種非還原性自由基清除劑。亦可以各種組合（諸如清除劑與二價陽離子）形式添加一或 多種自由基氧化抑制劑/螯合劑。螯合劑之選擇將決定是否需要添加清除劑。
[0302] 在某些實施方式中，與非經(jīng)腸施用相容之本發(fā)明配制品包含一或多種非離子型界 面活性劑，包括（但不限于）聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯_80(吐溫 80)、聚山梨醇酯-60 (吐溫60)、聚山梨醇酯-40 (吐溫40)及聚山梨醇酯-20 (吐溫20);聚 氧乙烯烷基醚，包括（但不限于）BRIJ 58、BRIJ 35以及其它者，諸如TRITON X-100 JRITON X-114、NP40、SPAN 85及普朗尼克系列之非離子型表面活性劑（例如普朗尼克121)，其中優(yōu) 選組分為約〇. 001 %至約2% (優(yōu)選至多約0. 25% )之濃度的聚山梨醇酯-80或約0. 001 % 至1% (優(yōu)選至多約0. 5% )之濃度的聚山梨醇酯-40。
[0303] 在某些實施方式中，本發(fā)明之配制品包含一或多種適用于非經(jīng)腸施用之其它穩(wěn)定 齊U，例如包含至少一個硫醇（-SH)基團之還原劑（例如半胱氨酸、N-乙?；腚装彼帷⑦€原 型谷胱甘肽、硫代乙醇酸鈉、硫代硫酸鹽、單硫代甘油或其混合物）。二者選一或任選地，可 進一步藉由自儲存容器中移除氧氣、將配制品遮光保護（例如藉由使用琥珀玻璃容器）來 使本發(fā)明之含防腐劑之免疫原性組合物配制品穩(wěn)定。
[0304] 本發(fā)明之含防腐劑之免疫原性組合物配制品可包含一或多種藥學可接受之稀釋 齊?、載劑或賦形劑，所述賦形劑包括本身不誘導免疫應答之任何賦形劑。適合之賦形劑包括 (但不限于）大分子（諸如蛋白質(zhì)、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物）、蔗 糖（Paoletti等人，2001，Vaccine, 19:2118)、海藻糖、乳糖及脂質(zhì)聚集物（諸如油滴或脂質(zhì) 體）。這些該等稀釋劑、賦形劑和/或載劑為本領域技術(shù)人員所熟知。藥學可接受之賦形 劑論述于例如 Gennaro, 2000, Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，ISBN:0683306472 中。
[0305] 本發(fā)明之組合物可經(jīng)凍干或呈水性形式，即溶液或懸濁液。有利地，液體配制品可 自其包裝形式直接施用且因此對于注射而言為理想的，不需要如本發(fā)明之凍干組合物所需 之另外在水性介質(zhì)中進行復水。
[0306] 可藉由非經(jīng)腸施用（肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)施用或施用至組織之間 質(zhì)間隙）；或藉由經(jīng)直腸、經(jīng)口、經(jīng)陰道、局部、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼部、經(jīng)耳、肺部或其它黏膜施用 來向個體直接傳遞本發(fā)明之免疫原性組合物。在一優(yōu)選實施方式中，非經(jīng)腸施用系藉由肌 肉內(nèi)注射例如于個體之大腿或上臂來達成。注射可經(jīng)由針（例如皮下注射針）來達成,但 或者可使用無針注射。典型肌肉內(nèi)劑量為〇.5mL。本發(fā)明之組合物可以制備成各種形式，例 如，用于注射之液體溶液或懸濁液。在某些實施方式中，組合物可制備成用于肺部施用（例 如于吸入器中）之粉末或噴霧劑。在其它實施方式中，所述組合物可制備成栓劑或子宮托， 或用于經(jīng)鼻、經(jīng)耳或眼部施用，例如制備成噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末。
[0307] 特定免疫原性組合物之組分之最佳量可藉由涉及觀測個體之適當免疫應答之標 準研究來確定。在最初疫苗接種后，個體可接受一次或多次時間間隔足夠長之追加免疫接 種。
[0308] 包裝及劑型
[0309] 本發(fā)明之免疫原性組合物可包裝成單位劑量或多劑量形式（例如2劑、4劑或4劑 以上）。對于多劑量形式，相較于預裝藥品之注射器，通常優(yōu)選，但不必須是小瓶。適合之 多劑量形式包括（但不限于）：每個容器2至10次劑量，每劑0. 1至2mL。在某些實施方式 中，所述劑量為〇. 5mL劑量。參見，例如，國際專利申請案W02007/127668，其以引用方式并 入本文中。
[0310] 組合物可存在于小瓶或其它適合之儲存容器中，或可存在于預裝藥品之傳遞裝置 中，例如單組分或多組分注射器，所述注射器可提供有針或未提供針。注射器通常但不必須 含有單一劑量之本發(fā)明之含防腐劑免疫原性組合物，亦設想多劑量預裝藥品之注射器。同 樣，小瓶可包括單一劑量，或者可包括多個劑量。
[0311] 可常規(guī)地確立有效之劑量體積，但用于注射之典型劑量之組合物的體積為0. 5mL。 在某些實施方式中，所述劑量經(jīng)調(diào)配以給人類個體進行施用。在某些實施方式中，劑量經(jīng)調(diào) 配以給成人、青少年、青年、幼童或嬰兒（亦即至多一歲大）人類個體施用且在優(yōu)選實施方 式中可藉由注射施用。
[0312] 本發(fā)明之液體免疫原性組合物亦適用于復水以凍干形式存在之其它免疫原性組 合物。在免疫原性組合物用于該臨時復水時，本發(fā)明提供一種試劑盒，該試劑盒具有兩個或 兩個以上小瓶、兩個或兩個以上已填充注射器或小瓶及已填充注射器各一或多個，其中在 注射前使用注射器之內(nèi)容物復水小瓶之內(nèi)容物，或反之亦然。
[0313] 或者，可例如使用本領域熟知之多種用于冷凍干燥之方法中之一者將本發(fā)明之免 疫原性組合物凍干并復水，所述方法形成干燥之形狀規(guī)則（例如球形）之顆粒，諸如微丸 或微球體，可藉由改變用于制備所述顆粒之精確方法來選擇及控制之其顆粒特征，諸如平 均直徑。所述免疫原性組合物可進一步包含佐劑，任選地，該佐劑用單獨的、干燥的且形狀 規(guī)則（例如球形）之顆粒（諸如微丸或微球體）制備或含于所述顆粒。在這樣的實施方 式中，本發(fā)明進一步提供一種免疫原性組合物試劑盒，其包含第一組分，該第一組分包括穩(wěn) 定化之干燥免疫原性組合物，以及任選地，進一步包含本發(fā)明之一或多種防腐劑；及第二組 分，該第二組分包含用于復水第一組分之無菌水性溶液。在某些實施方式中，所述水性溶液 包含一或多種防腐劑，且任選地，可包含至少一種佐劑（參見例如W02009/109550(以引用 方式并入本文中））。
[0314] 在另一實施方式中，多劑量形式之容器系選自（但不限于）由以下容器的一或多 者：一般實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、發(fā)酵罐、生物反應器、管、管道、袋、罐、小瓶、小 瓶扣合物（例如橡膠塞、螺旋蓋）、安瓿、注射器、雙腔室或多腔室注射器、注射器塞、注射器 活塞、橡膠扣合物、塑料扣合物、玻璃扣合物、藥筒（cartridge)及拋棄式筆等。本發(fā)明之容 器不受生產(chǎn)材料限制，且包括諸如玻璃、金屬（例如鋼、不銹鋼、鋁等）及聚合物（例如熱 塑性塑料、彈性體、熱塑性彈性體）之材料。在一特定實施方式中，該形式之容器為具有丁 基橡膠塞之5mL Schott 1型玻璃小瓶。本領域技術(shù)人員將了解，上述形式絕非詳盡清單， 而僅用作在可用于本發(fā)明之形式種類方面對本領域技術(shù)人員的指導。預期用于本發(fā)明中 之其它形式可見于來自實驗室設備供貨商及生產(chǎn)商（諸如United States Plastic Corp. (Lima, OH)、VWR)之公開目錄中。 實施例
[0315] 實施例1 :實驗程序
[0316] 血清殺細菌分析
[0317] 用吸附于AlPO4之rLP2086或rP2086 (A+B)蛋白質(zhì)對食蟹獼猴（Cynomolgus macaques) (η = 5只/組）進行經(jīng)肌肉內(nèi)免疫接種。食蟹獼猴為非人類靈長類動物之一個 實例。在第〇周、第4周及第24周對動物進行疫苗接種，且在第0周、第4周、第6周及第 26周測定0RF2086特異性IgG及功能性抗體效價。測定針對rLP2086A及rLP2086B之血清 0RF2086特異性IgG效價。
[0318] 藉由針對腦膜炎雙球菌菌株之血清殺細菌分析（SBA)研究功能性抗體效價，所述 腦膜炎雙球菌菌株表達具有與疫苗中所含之序列同源或異源之序列的LP2086。
[0319] 使用SBA用人類補體測定用0RF2086疫苗進行免疫接種之獼猴或兔中之血清殺細 菌性抗體。將兔免疫血清或獼猴免疫血清熱失活以移除固有補體活性，并隨后在96孔微量 滴定盤中于含Ca 2+及Mg2+之Dulbecco' sDulbecco's PBS(D-PBS)中1:2連續(xù)稀釋以測試 針對腦膜炎雙球菌菌株之血清殺細菌活性。使分析中使用之細菌在補充有Kellogg's補充 劑之GC培養(yǎng)基（GCK)中生長，并藉由在650nm下之光密度進行監(jiān)測。在0.50-0. 55之最終 OD65tl下收獲細菌用于分析，在D-PBS中稀釋且將1000-3000CFU添加至具有20 %人類補體 之分析混合物中。
[0320] 使用不具有可檢測殺細菌活性之人類血清作為外源補體來源。測試補體來源對于 各單個測試菌株之適合性。只有當在未添加免疫血清下對照組中存活之細菌數(shù)>75%時才 使用補體來源。需要十種獨特之補體來源來進行此研究中所述之SBA。
[0321] 在37°C、5 % CO2下溫育30分鐘之后，將D-PBS添加至反應混合物中且將等分試樣 轉(zhuǎn)移至填充有50% GCK培養(yǎng)基之微量過濾盤中。過濾微量過濾盤，在37°C、5% CO2下溫育 隔夜且對微菌落進行染色且定量。血清殺細菌效價系定義為相較于在無免疫血清下對照孔 中之CFU，使CFU減少50%之血清稀釋度之內(nèi)插倒數(shù)。SBA效價系定義為在37°C下溫育30 分鐘之后使細菌計數(shù)減少50 %之測試血清稀釋度之內(nèi)插倒數(shù)。若0RF2086免疫血清之SBA 效價為相應免疫前血清之4倍或大于4倍，則確定對利用0RF2086免疫血清之殺傷作用具 敏感性。在起始稀釋度下針對分析菌株呈陰性之血清的效價系指定為分析之檢測極限的一 半（亦即4)。
[0322] 實施例2 :克隆及表達非脂化之0RF2086變體
[0323] 最初藉由自基因組DNA進行PCR擴增來獲得對應于來自腦膜炎雙球菌 菌株M98250771 (A05)之殘基27至286的成熟P2086氨基酸序列。具有序列 TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG(SEQ ID N0:22)之正向引物與5'端序列退火且含有用于克 隆之 NdeI 位點。具有序列 CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(SEQ ID N0:23)之反向引物與 基因之3'端退火且含有終止密碼子TAG，后面是限制性位點BamHI。首先將799bp擴增片 段克隆至中間載體PCR2. l(Invitrogen, Carlesbac, CA)中。用NdeI及BamHI裂解此質(zhì)粒， 且將其連接至表達載體pET9a (Novagen，Madison, WI)中，該表達載體已經(jīng)NdeI及BamHI裂 解。所得載體pLA100(其包括SEQ ID N0:54)表達無 N端半胱氨酸之來自菌株M98250771 之成熟的亞家族A05P2086(參見SEQ ID NO: 13,其中位置1之N端Cys系經(jīng)刪除；或SEQ ID N0:55)，該N端半胱氨酸應存在于脂化之蛋白質(zhì)中。使用BLR(DE3)大腸桿菌宿主菌株 [F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcmA(srl-recA) 306:: TnlO (TetR) (DE3)] (Novagen)使 --ΒΡ 表達。
[0324] 使用相同克隆步驟來制備Β02、Β03、Β09、Β22、Β24、Β44、Α04、Α12及Α22之N端 Cys刪除型變體。亦藉由此相同方法，使用亦包括Cys密碼子（例如SEQ ID NO: 1-11之第 一個密碼子）之正向引物來制備含有N端Cys之變體?；诒疚奶峁┲蛄?，技術(shù)人員將 能夠設計用于這些變體中之每一者的正向引物及反向引物。舉例而言，使用以下引物擴增 B44非脂化之變體，繼而使用NdeI及BlpI將其克隆至pET9a中。
[0325] 表 1
[0326]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的多肽，其包含與SEQ ID NO: 71具有至少95%相同性之氨基酸序列，其中 該序列前二十個氨基酸殘基不包含半胱氨酸。
2. 如權(quán)利要求1之分離的多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO: 71之位置1至184之氨基 酸序列。
3. 如權(quán)利要求1之分離的多肽，其中該多肽包含來自SEQ ID NO: 71之位置185至254 之氨基酸序列的至少6個連續(xù)氨基酸。
4. 如權(quán)利要求1之分離的多肽，其中該多肽系非丙酮酸化的。
5. 如權(quán)利要求1之分離的多肽，其中該多肽系非脂化的。
6. 如權(quán)利要求1之分離的多肽，其中該多肽具有免疫原性。
7. 如權(quán)利要求1之分離的多肽，其中該氨基酸序列由SEQ ID N0:71所示之序列組成。
8. -種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求1至7中任一項之多肽。
9. 如權(quán)利要求8之免疫原性組合物，其進一步包含A12多肽。
10. 如權(quán)利要求8之免疫原性組合物，其進一步包含A05多肽。
11. 如權(quán)利要求8之免疫原性組合物，其進一步包含B09多肽。
12. 如權(quán)利要求8之免疫原性組合物，其進一步包含B44多肽。
13. 如權(quán)利要求8之免疫原性組合物，其進一步包含A12、B09及B44多肽。
14. 如權(quán)利要求8之免疫原性組合物，其進一步包含A05、A12、B09及B44多肽。
15. 如權(quán)利要求9至14中任一項之免疫原性組合物，其中每一多肽系非脂化的。
16. 如權(quán)利要求9至14中任一項之免疫原性組合物，其中每一多肽系非丙酮酸化的。
17. -種分離的核酸序列，其編碼由SEQ ID N0:71所示之氨基酸序列組成的分離的多 肽。
18. 如權(quán)利要求17之分離的核酸序列，其中該核酸序列包含SEQ ID N0:72。
19. 一種免疫原性組合物，其包含來自腦膜炎雙球菌（Neisseria Meningitidis)血清 群B的分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及至少一種選自以下之綴合物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及 d) 腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
20. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該組合物包含至少兩種選自以下之綴合 物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及 d) 腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
21. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該組合物包含至少三種選自以下之綴合 物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物；及 d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
22. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該組合物包含腦膜炎雙球菌血清群A之莢 膜糖之綴合物；腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物；腦膜炎雙球菌血清群W135之莢 膜糖之綴合物；及腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
23. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為亞家族A多肽。
24. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為亞家族B多肽。
25. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之A05。
26. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之A12。
27. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之A22。
28. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B01。
29. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B03。
30. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B09。
31. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B15。
32. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B16。
33. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B22。
34. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B24。
35. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之B44。
36. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽為非丙酮酸化且非脂化之A62。
37. 如權(quán)利要求19之免疫原性組合物，其中該多肽包含選自以下序列的氨基酸序列： SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、 SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID N0:80、SEQ ID NO:81及 SEQ ID NO:75。
38. -種誘導哺乳動物中針對腦膜炎雙球菌的免疫應答的方法，其包括給所述哺乳動 物施用有效量的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含來自腦膜炎雙球菌血清群B之分 離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及至少一種選自以下之綴合物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物，及 d) 腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
39. -種激發(fā)哺乳動物中針對腦膜炎雙球菌血清群C的殺細菌性抗體的方法，其包括 給所述哺乳動物施用有效量的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含來自腦膜炎雙球菌 血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽。
40. 如權(quán)利要求39之方法，其中該多肽由SEQ ID NO:71所示之氨基酸序列或選自以下 序列的氨基酸序列組成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21， 其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。
41. 如權(quán)利要求39之的方法，其中該免疫原性組合物進一步包含至少一種選自以下之 綴合物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， C)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物，及 d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
42. -種激發(fā)哺乳動物中針對腦膜炎雙球菌血清群Y之殺細菌性抗體的方法，其包括 給所述哺乳動物施用有效量的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含來自腦膜炎雙球菌 血清群B之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽。
43. 如權(quán)利要求42之方法，其中該多肽由SEQ ID N0:71所示之氨基酸序列或選自以下 序列的氨基酸序列組成：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20 及 SEQ ID NO:21， 其中位置1之半胱氨酸系經(jīng)刪除。
44. 如權(quán)利要求42之方法，其中該免疫原性組合物進一步包含至少一種選自以下之綴 合物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物，及 d) 腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
45. -種激發(fā)哺乳動物中針對腦膜炎雙球菌之殺細菌性抗體的方法，其包括給所述哺 乳動物施用有效量的免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含來自腦膜炎雙球菌血清群B 之分離的非脂化且非丙酮酸化之0RF2086多肽，及至少一種選自以下之綴合物： a) 腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜糖之綴合物， b) 腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜糖之綴合物， c) 腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜糖之綴合物，及 d) 腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜糖之綴合物。
46. -種分離的多肽，其包含與SEQ ID N0:71具有至少95%相同性之氨基酸序列。
47. 如權(quán)利要求46之多肽，其中該序列包含SEQ ID N0:71。
48. 如權(quán)利要求46之多肽，其中該多肽系非脂化的。
49. 如權(quán)利要求46之多肽，其中該多肽系非丙酮酸化的。
50. 如權(quán)利要求46之多肽，其中該多肽系非脂化且非丙酮酸化的。
51. 如權(quán)利要求46之多肽，其中該多肽具有免疫原性。
【文檔編號】A61K39/095GK104334187SQ201380021485
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月9日
【發(fā)明者】A·S·安德森, S·K·霍伊塞思, K·U·揚森, J·K·莫蘭, M·E·魯彭 申請人:輝瑞公司