包括腦膜炎球菌fHBP序列的雜交多肽的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明專利申請是國際申請?zhí)枮镻CT/IB2010/002260,國際申請日為2010年8 月27日，進入中國國家階段的申請?zhí)枮?201080047951. 4"，發(fā)明名稱為"包括腦膜炎球菌 fHBP序列的雜交多肽"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2009年8月27日提交的美國臨時申請?zhí)?1/237, 576的益處，其完整 內(nèi)容通過引用納入本文用于所有目的。
技術(shù)領域
[0003] 本發(fā)明屬于免疫領域，具體地說，是針對由諸如腦膜炎奈瑟球菌 (N. meningitidis，腦膜炎球菌）的奈瑟球菌（Neisseria)屬致病性細菌導致的疾病的免 疫。
【背景技術(shù)】
[0004] 腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)是一種革蘭氏陰性包膜細菌病原體。 雖然存在針對血清群A、C、W135和Y的多糖和偶聯(lián)疫苗，但是該方法無法應用于血清群B， 因為莢膜多糖是一種多聚唾液酸的聚合物，是人類的一種自身抗原。為了產(chǎn)生針對血清群 B的疫苗，使用了外膜囊泡（0MV)。這些疫苗會引起血清殺菌抗體應答和抵抗疾病，但是無 法誘導菌株間的交叉保護作用[1]。一些研究者因此著重于用于疫苗的特定腦膜炎球菌抗 原[2]。
[0005]-種這樣的抗原是腦膜炎球菌H因子結(jié)合蛋白（fHBP)，也稱作'741'蛋白[參考 文獻 3 中的 SEQ ID 2535 & 2536;本文的 SEQ ID 1], 'NMB1870'，'GNA1870' [參考文獻 4-6,在參考文獻2之后]，'P2086'，'LP2086'或'0RF2086'[7-9]。該脂蛋白在全部腦膜 炎球菌血清群中都表達，在許多菌株中都有發(fā)現(xiàn)。fHBP序列被分成三個家族[4](本文稱作 家族I，II & III)，對一特定家族產(chǎn)生的血清在同一家族中具有殺菌性，但對表達其它家族 之一的菌株無活性，即存在家族內(nèi)，而非家族間的交叉保護。
[0006] 因此，為了實現(xiàn)使用fHBP的交叉菌株保護，使用了多于一種家族。為了避免表達 和純化獨立蛋白的需要，已提出將不同家族表達成雜合蛋白[10-12]，在一條多肽鏈中包括 兩或三個家族。文獻13和14描述了基于誘變的修飾fHBP序列，以提高其對家族I、II和 III的覆蓋的方法。文獻15描述了經(jīng)修飾提高其家族間覆蓋的fHBP的各種其它形式。
[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供fHBP具有的家族特異性保護的進一步和改良的方法， 和使用這些方法提供針對腦膜炎球菌病和/或感染，特別是針對B血清群的免疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 全長fHBP在菌株MC58中具有以下氨基酸序列（SEQ ID N0:1) :MNRTAFCCLSLTTAL ILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKV SRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRA TYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIF GGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
[0009] 成熟的脂蛋白缺乏SEQ ID NO: 1的前19個氨基酸，fHBP的AG形式缺少前26個 氨基酸。
[0010] MC58序列（SEQ ID N0:1)屬于fHBP家族I。用MC58序列引發(fā)的抗體具有針對 MC58菌株的高度殺菌活性，但是對于表達家族II或III fHBP的菌株的活性低得多。在一 些實施方式中，本發(fā)明涉及修飾形式的fHBP，其中修飾作用改善了該蛋白引發(fā)家族間殺菌 抗體的能力。在其他實施方式中本發(fā)明涉及融合蛋白，其中fHBP的改良形式與第二氨基酸 序列，例如另一種腦膜炎球菌免疫原或另一種fHBP(包括修飾的fHBP)融合。
[0011] 因此，本發(fā)明提供了一種多肽，其含有氨基酸序列SEQ ID N0:77或SEQ ID N0:78。 這些氨基酸序列從MC58序列與Val-27匹配的殘基開始，但包括下游位點的各種氨基酸修 飾。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種多肽，包含第一免疫原性氨基酸序列和第二免疫原性氨基酸 序列，其中第一氨基酸序列選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77和78。兩種優(yōu)選的第一免疫原性氨基酸序列是3￡0 1〇勵 20和23。在一些實施方式中，第一和第二氨基酸序列可以是相同的；在其它實施方式中，它 們彼此不同。合適的第二免疫原性氨基酸序列在下文更詳細描述，包括但不限于：(a)非腦 膜炎球菌抗原；(b)腦膜炎球菌非fHBP抗原；（c)野生型腦膜炎球菌fHBP抗原；和（d)修 飾的腦膜炎球菌fHBP抗原，其可以與第一免疫原性氨基酸序列相同或不同。第一和第二序 列可以任何順序從N端到C端排列。
[0013] 因此，本發(fā)明提供了一種多肽，其所含氨基酸序列選自SEQIDN0:99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137 和 138。
[0014] 這些不同的多肽在給予宿主動物后有誘導殺菌性抗腦膜炎球菌抗體的能力，在優(yōu) 選實施方式中可以誘導對三種fHBP家族I到III中每一種的菌株具有殺菌性的抗體。關(guān) 于殺菌反應的其它信息在下文中給出。
[0015] 第二免疫原性氨基酸序列
[0016] 在一些實施方式中，本發(fā)明的多肽包括第二免疫原性氨基酸序列?？墒褂酶鞣N這 類第二序列。
[0017] 第二免疫原性氨基酸序列可以包含非腦膜炎球菌抗原。這優(yōu)選來自非腦膜炎球菌 病原體，例如細菌或病毒。例如，第二序列可以包含免疫原性肺炎球菌氨基酸序列或免疫原 性肝炎病毒氨基酸序列。
[0018] 第二免疫原性氨基酸序列除了 fHBP抗原外還可包含腦膜炎球菌抗原。例如，第二 序列可包含腦膜炎球菌抗原287、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App、936或0mp85的序列。這些第 二序列的其它細節(jié)如下。包括這種第二免疫原性序列的多肽序列的例子是SEQ ID N0:102、 124、125、126、127、128 和 129。
[0019] 第二免疫原性氨基酸序列可包含野生型或修飾的fHBP序列。該第二氨基酸序列 在作為本發(fā)明多肽的一部分給予對象時可優(yōu)選引發(fā)抗體反應，該反應包括與具有氨基酸序 列SEQ ID NO: 1、2或3之一的野生型腦膜炎球菌蛋白結(jié)合的抗體。例如，第二氨基酸序列 可包含以下任一：
[0020]-選自SEQ ID N0:1、2和3的序列（野生型fHBP序列）。
[0021] -選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77和78的序列（修飾的fHBP序列）。在一些實施方式中，第二免疫原性序 列與第一免疫原性序列相同。
[0022] -一條氨基酸序列，其與 SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78 任一有至少 x%序列相同性。
[0023] x 的值是至少 80,例如 82、84、86、88、90、92、94、95、96、97、98、99 或以上。
[0024] 包括這種fHBP序列作為第二免疫原性序列的多肽的例子是SEQ ID N0:99、100、 101、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、130、131、132、133、134、135、136、137 和 138。
[0025] 第一和第二免疫原性氨基酸序列可直接通過肽鍵連接，例如（i)第一免疫原性氨 基酸序列的C末端氨基酸在第二免疫原性氨基酸序列N末端氨基酸直接上游，或（ii)第二 免疫原性氨基酸序列的C末端氨基酸在第一免疫原性氨基酸序列N末端氨基酸直接上游。 然而在其它實施方式中，第一和第二免疫原性氨基酸序列由接頭氨基酸序列分隔，但仍然 形成一條翻譯的多肽鏈。這種接頭氨基酸序列-L-一般較短（如20個或更少的氨基酸，即 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽 序列，聚-甘氨酸接頭（即包含Glyn，其中n = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高），組氨酸標簽 (即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高，例如SEQ ID N0:95).本領域技術(shù)人員顯然 了解其它合適的接頭氨基酸序列。有用的接頭是GSGGGG(SEQ ID N0:81)或GSGSGGGG(SEQ ID NO :12)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位點形成，因而有助于克隆和操作，（617)4四肽是常 用的多聚甘氨酸接頭。其它合適的接頭是ASGGGS(SEQ ID N0:93,例如由SEQ ID N0:94編 碼）或 Leu-Glu 二肽。
[0026] 可存在一種以上這樣的第二序列，從而在多肽中提供第三、第四、第五等免疫原性 序列。這些多肽包括那些含第一免疫原性氨基酸序列、第二免疫原性氨基酸序列和第三免 疫原性氨基酸序列的多肽，其中：第一和第二氨基酸序列如上定義；第三氨基酸序列選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77 和 78。第一和第三序列可以彼此相同或不同；第二序列可以與第一或第三序列相同，或與它們 都不相同。包括第一、第二和第三序列的多肽的例子是SEQ ID N0:99、100、101、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126 和 127。
[0027] 一組有用的多肽包含（i)獨立選自 SEQ ID N0 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77和78的兩條氨基酸序列，和（11)一種腦膜炎球 菌非fHBP抗原。這些多肽的例子包括SEQ ID NO: 124、125、126、127、140、141和142。部分 (i)的兩條氨基酸序列可以相同或不同。非fHBP抗原可以在部分⑴的兩條氨基酸序列， 部分（i)的兩條氨基酸序列的C末端，或部分（i)的兩條氨基酸序列的N末端之間。
[0028] 非一 fHBP腦膜炎球菌抗原
[0029] 本發(fā)明的組合物可包含287抗原。287抗原作為基因NMB2132包括在腦膜炎球菌B 血清群菌株MC58[16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI:7227388;本文的SEQ ID N0:83)。迄今已發(fā)表了來自許多菌株的287抗原序列。例如，參考文獻17的圖5和15以 及文獻18的實施例13和圖21提供了 287的等位基因形式（文中的SEQ ID 3179-3184)。 也已報道了 287抗原的各種免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選287抗原包含某氨基酸序列， 該序列：（a)與SEQ ID N0:83具有50%或更高相同性（例如60% ,65% ,70% ,75% ,80% ，85% ,90%，91 % ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99. 5%或以上）；和/或 (b)包含SEQ ID N0:83至少' n'個連續(xù)氨基酸的片段，其中' n'是7或更多（例如8, 10, 1 2, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 或更多）。（b)的優(yōu)選片 段包含來自SEQ ID N0:83的表位。本發(fā)明最有用的287抗原可在給予對象后引起抗體，其 能與氨基酸序列SEQ ID N0:83組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的有利287抗原 可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0030] 本發(fā)明的組合物可包含NadA抗原。NadA抗原作為基因NMB1994包括在腦膜炎球 菌B血清群菌株MC58 [16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI: 7227256;本文的 SEQ ID N0:84)。迄今已發(fā)表了來自許多菌株的NadA抗原序列，詳細描述了該蛋白作為奈 瑟菌粘附素的活性。還報導了 NadA的各種免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選NadA抗原包 含某氨基酸序列，該序列：（a)與SEQ ID N0:84具有50 %或更高相同性（例如60%，65%， 70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99. 5%或 以上）；和/或（b)包含SEQ ID N0:84至少'n'個連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7或更多 (例如 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 或更多）。 (b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:84的表位。本發(fā)明最有用的NadA抗原可在給予對象 后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID N0:84組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的 有利NadA抗原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。SEQ ID N0 :6是這樣一個 片段。
[0031] 本發(fā)明的組合物可包含NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括在腦膜炎球 菌B血清群菌株MC58[16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI:7225888 ;本文的SEQ IDN0:85)。先前參考文獻19和20提到該抗原。之后已發(fā)表了來自許多菌株的NspA抗原 序列。還報導了許多NspA的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選NspA抗原包含某氨基酸序 列，該序列：（a)與SEQIDN0:85具有50 %或更高相同性（例如60%，65%，70%，75%，80 % ,85% ,90% ,91% ,92% ,93% ,94% ,95% ,96% ,97% ,98% ,99% ,99. 5%或以上）；和/或 (b)包含SEQIDN0:85至少'n'個連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7或更多（例如8, 10, 1 2, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 或更多）。（b)的優(yōu)選片 段包含來自SEQ ID N0:85的表位。本發(fā)明最有用的NspA抗原可在給予對象后引起抗體， 其能與氨基酸序列SEQ ID NO: 85組成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的有利NspA抗 原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。
[0032] 本發(fā)明的組合物可包含腦膜炎球菌HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668 包括在腦膜炎球菌B血清群菌株MC58 [16]的已發(fā)表基因組序列中（本文的SEQ ID N0:86)。 本發(fā)明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些 實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID N0:86具有至少i%序列相同性 的氨基酸序列，其中i值是50、60、70、80、90、95、99或以上。在其它實施方式中，根據(jù)本發(fā) 明使用的HmbR序列可包含SEQ ID N0:86的至少j個連續(xù)氨基酸的片段，其中j值是7、8、 10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或以上。在其它實施 方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含一氨基酸序列，其（i)與SEQ ID N0:86具有至 少i%序列相同性，和/或（ii)包含SEQ ID N0:86至少j個連續(xù)氨基酸的片段。j個氨基 酸的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:86的表位。這些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基 酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結(jié)合的氨基酸，因為與這些表位結(jié)合的抗體能夠阻 斷細菌與宿主血凝素結(jié)合的能力。HmbR的拓撲學及其關(guān)鍵功能性殘基如參考文獻21所述。 本發(fā)明最有用的HmbR抗原可在給予對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID N0:86組 成的腦膜炎球菌多肽結(jié)合。本發(fā)明使用的有利HmbR抗原可在給予對象后引發(fā)殺菌性抗腦 膜炎球菌抗體。
[0033] 本發(fā)明的組合物可包含NhhA抗原。NhhA抗原作為基因NMB0992包括在腦膜炎球 菌B血清群菌株MC58[16]的已發(fā)表基因組序列中（GenBank登錄號GI:7226232;本文的 SEQ ID N0:87)。自從例如參考文獻17和