微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]γ -內(nèi)酰胺酶(γ -1actamses，EC 3.5.2.-)是催化酰胺類(lèi)化合物酰胺鍵水解的一種新型酰胺酶。(+) γ -內(nèi)酰胺酶能夠高效率動(dòng)力學(xué)拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的(-)j-內(nèi)酰胺。光學(xué)純的(-)j-內(nèi)酰胺是制備抗病毒藥物的手性中間體，是抗艾滋病藥物(-)阿巴卡韋和(-)卡巴韋的合成原料，也是抗流感藥物帕拉米韋的合成原料。此外，γ -內(nèi)酰胺酶催化外消旋體γ -內(nèi)酰胺還可獲得不同構(gòu)型的γ-氨基丁酸類(lèi)似物(GABA)。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性[I]。人們?cè)诎l(fā)現(xiàn)(+) γ -內(nèi)酰胺酶之前，一般采用不對(duì)稱(chēng)合成的方法制備光學(xué)純的(-)γ -內(nèi)酰胺，此方法的缺點(diǎn)是原料昂貴、工藝繁瑣、生產(chǎn)成本高、造成環(huán)境污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[2]。運(yùn)用γ -內(nèi)酰胺酶進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)(-)γ -內(nèi)酰胺，具有反應(yīng)條件溫和、工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶的研宄處于γ-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌種的選育和產(chǎn)酶條件優(yōu)化[3?5]、酶學(xué)性質(zhì)以及相關(guān)基因克隆階段[6?8]，且主要集中于中溫γ-內(nèi)酰胺酶，目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的相關(guān)研宄報(bào)道，微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶具有廣闊的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。
[0003]參考文獻(xiàn):
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法，該方法是將能產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶菌種先活化，再經(jīng)過(guò)低溫馴化，最后于10?16°C下液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫γ-內(nèi)酰胺酶經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法具體包括以下步驟:
[0013](I)將能產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種先活化，再逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C —25°C —22°C —20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，當(dāng)菌種在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)即馴化結(jié)束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基組成為:酵母膏0.2?5.0g, N-乙酰-L-苯丙氨酸
1.0 ?10.0g，NH4Cl 2.0 ?15.0g，Na2HPO4 0.1 ?1.0g，NaH2PO4 0.1 ?1.0g，MgSO4 0.05 ?0.5g，瓊脂粉20g，自來(lái)水1.0L, pH為6.0?8.0，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0014]所述的能產(chǎn)生Y -內(nèi)酰胺酶菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號(hào):1.219或1.758或1.1830 ；
[0015](2)按常規(guī)方法將步驟⑴中低溫馴化后的γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10?16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；所述的液體種子培養(yǎng)基:酵母膏 20.0 ?25.0g，蛋白胨 10.0 ?20g，NaCl 10.0 ?15.0g, MgSO4 0.05 ?0.5g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來(lái)水 1.0L，pH 為 6.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0016](3)將液體二級(jí)種子按發(fā)酵液體積的3?9%接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10?16°C培養(yǎng)72?144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶結(jié)束；所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏10.0?25.0g，蛋白胨2.0?20.0g,乙酰胺5.0?20g，Tween80 0.1?
0.4g，(NH4)2SO4 1.0 ?1.5g，KH2PO4 1.4 ?2.0g, MgSO4 0.1 ?0.4g，CaCl2 0.2 ?0.3g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來(lái)水 1.0L，pH 為 5.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0017](4)將步驟(3)的發(fā)酵液在4000?8000rpm離心收集菌體，超聲破碎，收集到的上清液即為粗酶液；
[0018](5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將步驟(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0019]進(jìn)一步的，步驟(I)產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種的活化培養(yǎng)基為:酵母膏20.0g，蛋白胨 10.0g, NaCll0.0g，瓊脂 20.0g,自來(lái)水 1.0L, ρΗ7.4，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌30mino
[0020]本發(fā)明中能產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶菌種初期活化和生長(zhǎng)條件按中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)提供的說(shuō)明進(jìn)行。菌種先活化、再經(jīng)過(guò)逐級(jí)低溫馴化后發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶時(shí)按本發(fā)明產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)，低溫馴化后的菌種在4°c環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10?25vt%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可以長(zhǎng)期保藏。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0022](I)本發(fā)明生產(chǎn)的低溫γ -內(nèi)酰胺酶經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理并不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)，尤其是在低溫下還具有高酶活力及高催化效率；提高了生產(chǎn)效率，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量；
[0023](2)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)化了加工工藝，縮短加工時(shí)間并從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備的環(huán)節(jié)，省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，降低了生產(chǎn)成本，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；
[0024](3)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫Y -內(nèi)酰胺酶主要應(yīng)用于拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的㈠γ -內(nèi)酰胺，低溫γ -內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用可進(jìn)一步提高原料的利用率及轉(zhuǎn)化率，而且該酶制劑在應(yīng)用中操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低，具有更廣闊的工業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值與市場(chǎng)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1
[0027](I)培養(yǎng)基制備
[0028]①菌種活化培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g, NaCll0.0g，瓊脂20.0g,自來(lái)水
1.0L, pH7.4，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0029]②菌種低溫馴化培養(yǎng)基:酵母膏0.2g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0g, NH4Cl 2.0g,Na2HPCM 0.lg, NaH2PCM 0.lg, MgSO4 0.05g，瓊脂粉 20g，自來(lái)水 1.0L, pH 值為 6.0，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0030]③液體種子培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g, MgSO4 0.05g ；ZnSO4.7H20 2.4mg，自來(lái)水 1.0L, pH6.0，于 103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0031]④液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏10.0g，蛋白胨2.0g，乙酰胺5.0g，Tween80 0.lg,(NH4)2SO4 1.0g, KH2PO4 1.4g，MgSO4 0.lg, CaCl2 0.2g，ZnSO4.7H20 2.4mg，自來(lái)水 1.0L, pH值 5.0，121 °C，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0032](2)將產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMC