一種同時定量測定天麻中多種酚類成分含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥藥材的檢測領(lǐng)域，具體涉及中藥藥材天麻的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天麻又名赤箭、定風(fēng)草、獨(dú)搖芝，為蘭科天麻屬植物天麻（GastrodiaelataB1.) 的干燥塊莖。兩千年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，有平肝息風(fēng)、通絡(luò)止痛的功效，有 "治風(fēng)之神藥"之稱。主治頭痛眩暈、肢體麻木、癒痛抽搖等癥。天麻素是天麻的主要活性成 分，2010版中國藥典中W天麻素的含量控制天麻藥材的質(zhì)量，其含量測定方法為高效液相 色譜法，用十八烷基基娃焼鍵合硅膠為固定相，W己臘-0.05%磯酸溶液（3 : 97)為流動 相，檢測波長220nm。近年來研究表明，天麻活性成分除了天麻素W外，還存在對居基苯甲 醇、parishinB、pa;rishinC和parishin等多種酪類成分。如王河等人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)parishin 類成分對腦缺血再灌注損傷、N-甲基-D- 口冬氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷W及閉合性腦外 傷具有一定的保護(hù)作用（天麻派立辛提取物在制備腦保護(hù)藥物中的應(yīng)用，中國專利申請?zhí)?201210230669.0)。因此，對天麻中多種酪類同時測定有望更全面控制天麻質(zhì)量。而目前 文獻(xiàn)或?qū)＠姆椒▋H能實(shí)現(xiàn)對天麻中1~4種酪類成分或總天麻素的含量進(jìn)行測定（劉 玉紅，藥物分析雜志，2010, 30(1) :30-32)(劉玉紅，中成藥，2012, 34(1) :182-184)(劉智， 中國藥學(xué)雜志，2012,40巧）=380-383)，難W客觀真實(shí)的反映天麻在體內(nèi)發(fā)揮藥效作用的全 部活性成分，且方法靈敏度低。另外，對于同時測定天麻中的多種酪類成分未見報道。因 此需要一種操作簡單、快速、靈敏度高的方法同時測定天麻中的多種酪類成分?；赪上 原因，本發(fā)明開發(fā)了一種同時對天麻中天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、parishinC和 parishin等多種酪類成分的高效液相色譜-英光檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供天麻中多種酪類成分的含量測定方法，所述的測定方法利 用高效液相色譜-英光檢測方法可同時對天麻中天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、 parishinC和parishin含量進(jìn)行測定，并開展了線性關(guān)系考察，穩(wěn)定性試驗(yàn)，精密度試驗(yàn)， 重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收試驗(yàn)對方法進(jìn)行驗(yàn)證，證明本分析方法準(zhǔn)確，可靠。所述方法簡單、 快速、靈敏，可為天麻的質(zhì)量評價提供依據(jù)。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：
[0005] -種同時定量測定天麻中多種酪類成分的含量測定方法，主要包括W下Η個步 驟，其特征在于：
[0006] 1)對照標(biāo)準(zhǔn)品及供試待測品溶液的制備：將天麻酪類對照標(biāo)準(zhǔn)品及待測天麻提 取物分別溶于體積濃度為0-8%的甲醇或己臘的水溶液中，制備對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液和待 測供試品溶液；
[0007] 2) W高效液相色譜-英光檢測方法為手段分別進(jìn)行對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液和待測 供試品溶液成分的定量分析；
[0008] 通過對一系列不同質(zhì)量濃度的天麻酪類化合物的對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行分析， 獲得對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液中各天麻酪類化合物的保留時間及各天麻酪類化合物不同質(zhì)量 濃度對應(yīng)的峰面積；
[0009] 通過對待測供試品溶液的分析，獲得待測天麻提取物中天麻酪類化合物的保留時 間及對應(yīng)的峰面積；
[0010] 3)外標(biāo)法測定天麻中酪類成分的含量；
[0011] 通過對一系列不同質(zhì)量濃度的天麻酪類化合物的對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行分析， W天麻酪類化合物的已知質(zhì)量濃度和對應(yīng)的峰面積作為橫縱坐標(biāo)，建立各個已知天麻酪類 化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0012] W對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液中各天麻酪類化合物的保留時間為基準(zhǔn)，對待測天麻提取 物中天麻酪類化合物進(jìn)行定性，將定性后的待測天麻提取物中天麻酪類化合物的峰面積代 入其對應(yīng)天麻酪類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線中，對其進(jìn)行定量。
[0013] 步驟1)中所述天麻提取物的制備方法為溶劑提取法，其中優(yōu)選己醇-水提取，所 述的提取方法可為回流提取、超聲提取、微波輔助提取中的任意一種，優(yōu)選制備方法為；天 麻藥材用5-10倍的體積濃度70%己醇-水回流提取2~3次，提取液合并濃縮，用適量水分 散，1-2倍體積的己酸己醋萃取2-4次，得到的水層合并濃縮，即得。W8%甲醇-水為溶劑 制備天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、pa;rishinC和parishin等對照品混合溶液和制備 天麻提取物供試品溶液，其中所述天麻酪類成分主要包括天麻素、對居基苯甲醇、parishin B>p曰rishinC和P曰rishin。
[0014] 步驟2)中所述方法的色譜條件為；C18液相色譜柱；流動相為甲醇或己臘（A)-體 積分?jǐn)?shù)0. 1~0. 5%酸水溶液度）；梯度程序洗脫；柱溫；40~6(TC;流速；0. 25~0. 35ml/ min;激發(fā)波長215皿~235皿，發(fā)射波長295~335皿；進(jìn)樣量1~20μ1 ;其中優(yōu)選條件為 流動相為甲醇-酸水溶液，酸優(yōu)選甲酸，其體積分?jǐn)?shù)為0. 5%。柱溫為5(TC，流速為0. 35ml/ min,進(jìn)樣量為1μ1。激發(fā)波長為225皿，發(fā)射波長為310皿。
[0015] 步驟3)中配制濃度為5, 25, 50, 250, 500, 2500ng/ml的天麻素、對居基苯甲醇、 parishinB、parishinC和parishin的混合對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。
[0016] 已知天麻含有天麻素、對居基苯甲醇、對居基苯甲醒、parishin類成分，尤其是 parishinB、pa;rishinC和parishin在色譜圖中清晰可見，峰面積較大，可將parishinB、 parishinC和parishin作為指標(biāo)成分用于天麻的質(zhì)量控制。采用本發(fā)明的含量測定方法 對天麻中具有代表性的五個成分進(jìn)行測定，使天麻的成分更加明確、質(zhì)量控制更加嚴(yán)格，為 天麻的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)。
[0017] 本發(fā)明所述的含量測定方法具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1)本發(fā)明采用高效液相色譜-英光檢測方法，在激發(fā)波長225nm，發(fā)射波長310nm 下可一次性對天麻藥材或提取物中的天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、parishinC和 parishin等多種酪類成分進(jìn)行同時含量測定。提高了檢測效率。該方法還未見文獻(xiàn)報道。
[0019] 2)本發(fā)明采用高效液相色譜-英光檢測的手段，與常用的高效液相-紫外檢測方 法相比，靈敏度可由ug/ml提高到ng/ml，提高了 1000倍。
[0020] 3)該方法靈敏度高、精密度好、分析時間短，可用于天麻藥材、天麻提取物中酪類 成分的快速、靈敏測定。
【附圖說明】
[0021] 圖 1 天麻素、對居基苯甲醇、parishin EkparishinC和pa;rishin200-290nm全激 發(fā)波長吸收圖。
[0022] 圖2天麻素、對居基苯甲醇、parishin EkparishinC和pa;rishin280-500nm全發(fā) 射波長吸收圖。
[0023] 圖3流動相從上到下依次為：己臘-水、己臘-0. 5 %甲酸水、甲醇-水、 甲醇-0. 5 %甲酸水，柱溫50 °C，流速0. 35ml/min，色譜柱為AgilentZ0RBAX SB-C18(3. 0X100mm，1.8um)的色譜圖。
[0024]圖4柱溫從上到下依次為4(TC，5(TC，6(TC，流動相為甲醇-0. 5 %甲酸水，流速 0. 35ml/min，色譜柱為AgilentZ0RBAXSB-C18(3. 0X100mm，1.8um)的色譜圖。
[00巧]圖5流速從上到下依次為0. 25ml/min，0. 30ml/min，0. 35ml/min，流動相為甲 醇-0. 5% 甲酸水，柱溫 50°C，色譜柱為AgilentZ0RBAXSB-C18(3. 0X100mm，1.8um)的色 譜圖。
[0026] 圖6天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、parishinC和parishin的混合對照品 及天麻提取物的色譜圖，其中圖6A從左到右分別為天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、 P曰rishin C和P曰rishin。
【具體實(shí)施方式】
[0027]W下實(shí)施例中使用的儀器與試藥：
[0028]Agilentl200型高效液相色譜系統(tǒng)，配備G1367C自動進(jìn)樣器系統(tǒng)、G1316B 型柱溫箱、G1365C型可變波長紫外檢測器及G1321可變波長英光檢測器（美國 Agilent公司）；BSA-224S電子天平（德國Sartorius);色譜柱AgilentZ0RBAX SB-C18 (3. 0X100mm, 1. 8μm)。
[0029] 天麻素對照品、對居基苯甲醇對照品、parishinB對照品、parishinC對照品和 parishin對照品；W上對照品均來自本實(shí)驗(yàn)室分離，純度>98%，符合定量要求。
[0030] 天麻提取物的制備方法為溶劑提取法，其中優(yōu)選己醇-水提取，所述的提取方法 可為回流提取、超聲提取、微波輔助提取中的任意一種，優(yōu)選制備方法為；天麻藥材用5-10 倍的體積濃度70 %己醇-水回流提取2~3次，提取液合并濃縮，用適量水分散，1-2倍體 積的己酸己醋萃取2-4次，得到的水層合并濃縮，即得。
[0031] 甲醇（色譜純），水為去離子水，其余均為分析純。
[0032] 實(shí)施例1激發(fā)波長、發(fā)射波長及色譜條件的優(yōu)化
[0033] 激發(fā)-發(fā)射全波長掃描的篩選
[0034] 分別取天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、pa;rishinC和parishin對照品適量， 精密稱定，用8%甲醇-水溶解并稀釋成濃度為Img/ml的對照品儲備溶液。
[003引精密吸取一定量的5種對照品儲備溶液，加8%甲醇-水稀釋成濃度為10化g/ml的混合對照品溶液供條件優(yōu)化分析；
[0036]對濃度為lOOng/ml的天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、parishinC和parishin對照品混合溶液進(jìn)行全激發(fā)波長（200~290nm)掃描，發(fā)現(xiàn)送五個成分在225皿 處有最大吸收，如圖1所示。在確定激發(fā)波長下，對濃度為l(K)ng/ml的天麻素、對居基苯甲 醇、parishinB、pa;rishinC和parishin對照品混合溶液進(jìn)行全發(fā)射波長（280~500nm) 掃描，發(fā)現(xiàn)送五個成分在310nm處有最大吸收，如圖2所示。
[0037] 考察了己臘-水、己臘-0. 5%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0. 5%甲酸水等流動相系 統(tǒng)，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)試驗(yàn)比較，最終確定W甲醇-0. 5%甲酸水梯度洗脫完成W上五個成 分的含量測定。
[0038]考察了 40°c、5(rc、6(rc不同柱溫，結(jié)果如圖 4 所示；W及 0. 25、0. 3、0. 35ml/min 不同流速對各成分分離的影響，結(jié)果如圖5所示；發(fā)現(xiàn)在50°C、流速為0. 35ml/min時分離 效果最佳。
[0039] 實(shí)施例2天麻提取物中天麻素、對居基苯甲醇、parishinB、parishinC和 parishin的含量檢測
[0040] 色譜條件
[0041]色譜柱為AgilentZ0RBAXSB-C18(3.OXlOOmm, 1.8um),流動相為甲醇 (A)-0. 5%甲酸溶液度），洗脫