專利名稱：：硫酸酯化多糖中硫酸基的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種硫酸酯化多糖(SPS)中硫酸基的測定方法，屬于化學(xué)分析方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：含有硫酸集團的糖復(fù)合物(glycoconjugates)，如糖蛋白(glycoprotein),肽聚糖(p印tidoglycans)、蛋白聚糖(proteoglycan)以及硫酸酯化多糖(sulfatedpolysaccharides,SPS)是一大類重要的生物活性物質(zhì)。具有抗凝血、活血化瘀、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒、增強細胞免疫和體液免疫功能、抗衰老、對機體細胞的保護等作用。該類多糖的重要特征就是含有硫酸基，為多糖大分子鏈中單糖殘基的某一羥基被硫酸基所取代。許多生物活性功能除與多糖結(jié)構(gòu)、水溶性、分子量大小等有關(guān)外，與硫酸基的含量有著直接的聯(lián)系。如藻酸硫酸化后具有抗凝血作用，含硫量為5.15°/。，具有強的類似肝素的阻凝作用；當(dāng)硫量達17%，呈現(xiàn)顯著的抗凝血作用；硫酸鹽陰離子對硫酸酯化多糖抑制HIV是必須的離子結(jié)構(gòu)，其抑制作用不僅與濃度呈量效關(guān)系，而且與分子中硫酸基含量有關(guān)，含量越高，其抗HIV的作用越強，顯然硫酸基在抑制HIV的生長過程中起了重要作用。目前多糖中硫酸基常用的測定方法有灰分法、鹽酸水解一硫酸鋇法、硫酸鋇濁度法、聯(lián)苯胺法等。在這些方法中前兩種屬常量分析，后兩種為微量分析。如硫酸鋇濁度法，稱樣量為13mg，還要經(jīng)水解等一系列樣品處理，其絕對誤差和相對誤差大在所難免。而灰分法和鹽酸水解一硫酸鋇重量法報道敘述不具體、不規(guī)范，且兩種方法測定結(jié)果相差甚遠。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種可靠的硫酸酯化多糖(SPS)中硫酸基的測定方法，對硫酸酯化多糖及相關(guān)食品、功能食品、藥品中硫酸基的測定方法進行統(tǒng)一、規(guī)范操作程序，使其分析方法具有可比性。上述目的是這樣實現(xiàn)的硫酸酯化多糖(SPS)中硫酸基含量的測定方法，測定歩驟如下1)稱取待測樣品0.10.4克(精確至0.0001克)，置于20ml帶蓋玻璃瓶中，用少許去離子水潤濕，加入摩爾濃度為0.51.8mol/L的HC1溶液518ml，擰緊瓶蓋，在旋渦混合器上充分混勻，在超級微量恒溫器上，于5010(TC下加熱水解112小時，在水解過程中，間歇有規(guī)律地?fù)u動小瓶。2)取出玻璃瓶并冷卻至室溫，以慢速定性濾紙過濾，用去離子水洗滌殘渣至無SO/—(以2mol/LBaCl2溶液檢驗，濾液收集約200ml)，攪拌下徐徐加入2mol/LBaCl2溶液5ml，并加入2mol/LH冊3溶液5ml，溫和加熱30分鐘，取下靜置4小時。3)用慢速定量濾紙過濾；再用去離子水洗至無Cr(P/。AgN03溶液檢驗)，將濾紙及沉淀物轉(zhuǎn)移至已在65085(TC恒重并稱重的瓷坩堝中，置于電爐上灰化，注意不能讓其燃燒，然后轉(zhuǎn)移到馬福爐中于400'C加熱1小時，65085(TC加熱1小時；取出室溫冷卻5分鐘，放入裝有CaCl2的干燥器中，冷至室溫，稱量記錄；再在65085(TC加熱0.5小時，冷卻，稱量記錄；重復(fù)上述操作，直至二次稱量相差不大于0.0002克。4)然后計算SO/一的含量。本方法測定結(jié)果可靠，精密度、準(zhǔn)確度好，而且所用設(shè)備儀器簡單，試劑易購，適用于一般實驗室質(zhì)量控制，仲裁分析，以及含硫酸酯化多糖的食品、保健食品、藥品中硫酸基常量分析。具體實施例方式硫酸酯化多糖(SPS)中硫酸基的測定方法，下面通過舉例作進一步詳細說明。實施例1:稱取待測樣品0.2克(精至0.0001克)，置于20ml帶蓋玻璃瓶中，以少許去離子水潤濕，加入摩爾濃度為lmol/L的HC1溶液10ml，擰緊瓶蓋，在旋渦混合器上充分混勻，在超級微量恒溫器上，于5(TC下加熱水解4小時。在水解過程中，間歇有規(guī)律地?fù)u動小瓶。取出玻璃瓶并冷卻至室溫。以慢速定性濾紙過濾，用去離子水洗滌殘渣至無SO/—(以2mol/LBaCV溶液檢驗，濾液收集約200ml)。攪拌下徐徐加入2mol/LBaCl2溶液5ml，并加入2raol/LHN03溶液5ml，溫和加熱30分鐘，取下靜置4小時。用慢速定量濾紙過濾；用去離子水洗至無C1—(1%AgN03溶液檢驗)。將濾紙及沉淀物轉(zhuǎn)移至已在650。C恒重并稱重的瓷坩堝中，置于電爐上灰化，注意不能讓其燃燒！然后轉(zhuǎn)移到馬福爐中于400。C加熱1小時，65(TC加熱1小時。取出室溫冷卻5分鐘，放入裝有CaCL的干燥器中，冷至室溫，稱量記錄。再在650。C加熱0.5小時，冷卻，稱量記錄。重復(fù)上述操作，直至二次稱量相差不大于0.0002克。實施例2:稱取待測樣品0.25克(精至0.0001克)，置于20ml帶蓋玻璃瓶中，以少許去離子水潤濕，加入摩爾濃度為lmol/L的HCl溶液15ml，擰緊瓶蓋，在旋渦混合器上充分混勻，在超級微量恒溫器上，于IOO'C下加熱水解2小時。在水解過程中，間歇有規(guī)律地?fù)u動小瓶。取出玻璃瓶并冷卻至室溫。以慢速定性濾紙過濾，用去離子水洗滌殘渣至無SO廣(以2mol/LBaCl2溶液檢驗，濾液收集約200ml)。攪拌下徐徐加入2mol/LBaCL溶液5ml，并加入2mol/LHN0:i溶液5ml，溫和加熱1小時，取下靜置4小時。用慢速定量濾紙過濾；用去離子水洗至無C1—(1%AgNO:,溶液檢驗)。將濾紙及沉淀物轉(zhuǎn)移至己在85(TC恒重并稱重的瓷坩堝中，置于電爐上灰化，注意不能讓其燃燒！然后轉(zhuǎn)移到馬福爐中于40(TC加熱1小時，85(TC加熱1小時。取出室溫冷卻5分鐘，放入裝有CaCl2的干燥器中，冷至室溫，稱量記錄。再在85(TC加熱0.5小時，冷卻，稱量記錄。重復(fù)上述操作，直至二次稱量相差不大于0.0002克。實施例3:稱取待測樣品0.3克(精至0.0001克)，置于20ml帶蓋玻璃瓶中，以少許去離子水潤濕，加入摩爾濃度為1.8mol/L的HC1溶液18ml，擰緊瓶蓋，在旋渦混合器上充分混勻，在超級微量恒溫器上，于75i:下加熱水解4小時。在水解過程中，間歇有規(guī)律地?fù)u動小瓶。取出玻璃瓶并冷卻至室溫。以慢速定性濾紙過濾，用去離子水洗滌殘渣至無S042—(以2raol/LBaCl2溶液檢驗，濾液收集約200ml)。攪拌下徐徐加入2mol/LBaCl2溶液5ml，并加入2mol/L麗03溶液5ml，溫和加熱30分鐘，取下靜置4小時。用慢速定量濾紙過濾；用去離子水洗至無C1—(1%AgN(V溶液檢驗)。將濾紙及沉淀物轉(zhuǎn)移至已在85(TC恒重并稱重的瓷坩堝中，置于電爐上灰化，注意不能讓其燃燒！然后轉(zhuǎn)移到馬福爐中于40(TC加熱1小時，85(TC加熱1小時。取出室溫冷卻5分鐘，放入裝有CaCl2的干燥器中，冷至室溫，稱量記錄。再在85(TC加熱0.5小時，冷卻，稱量記錄。重復(fù)上述操作，直至二次稱量相差不大于0.0002克。上述實施案例中，按下式計算S0/—的含量S0/—%="/;2『嫌Xx100G式中0.4112—將BaS04質(zhì)量換算為S0,質(zhì)量的換算因子；WB，一BaSO,質(zhì)量，g;G—樣品質(zhì)量，g;S0,%—100克樣品中SO/—的質(zhì)量份數(shù)，即百分含量。注如果G為分析基質(zhì)量，則為分析基含量；根據(jù)分析基水份可換算成干基含量。附表l-7為本發(fā)明的測定實例，不再一一舉例。表l水解時間對測定結(jié)果的影響表2水解鹽酸濃度對SO,測定結(jié)果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3鹽酸的用量對SO卩—測定結(jié)果的影響表4樣品稱量對測定結(jié)果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表5硫酸基測定的重復(fù)性表6硫酸基添加回收結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種硫酸酯化多糖中硫酸基含量的測定方法，其特征在于測定步驟如下1)稱取待測樣品0.1～0.4克，精確至0.0001克，置于20m1帶蓋玻璃瓶中，用去離子水潤濕，加入摩爾濃度為0.5～1.8mol/L的HCl溶液5～18ml，擰緊瓶蓋，在旋渦混合器上充分混勻，在超級微量恒溫器上，于50～100℃下加熱水解1～12小時，在水解過程中，間歇有規(guī)律地?fù)u動小瓶；2)取出玻璃瓶并冷卻至室溫，以慢速定性濾紙過濾，用去離子水洗滌殘渣至無SO42-，以2mol/LBaCl2溶液檢驗，濾液收集約200ml，攪拌下徐徐加入2mol/LBaCl2溶液5ml，并加入2mol/LHNO3溶液5ml，溫和加熱30分鐘，取下靜置4小時；3)用慢速定量濾紙過濾；再用去離子水洗至無Cl-，用1％AgNO3溶液檢驗，將濾紙及沉淀物轉(zhuǎn)移至已在650～850℃恒重并稱重的瓷坩堝中，置于電爐上灰化并不能讓其燃燒，然后轉(zhuǎn)移到馬福爐中于400℃加熱1小時，650～850℃加熱1小時；取出室溫冷卻5分鐘，放入裝有CaCl2的干燥器中，冷至室溫，稱量記錄；再在650～850℃加熱0.5小時，冷卻，稱量記錄；重復(fù)上述操作，直至二次稱量相差不大于0.0002克；4)然后計算SO42-的含量。全文摘要本發(fā)明公開了一種硫酸酯化多糖中硫酸基含量的測定方法。該法包括將含硫酸基團的糖復(fù)合物與氯化氫濃度為0.5～1.8mol/L水溶液在超級微量恒溫器上進行水解反應(yīng)1～12小時。反應(yīng)完后用慢速定性濾紙過濾，濾液中加入BaCl₂溶液和HNO₃溶液，溫和加熱30分鐘，取下靜置4小時。用慢速定量濾紙過濾，將濾紙及沉淀物轉(zhuǎn)移至恒重的瓷坩堝中，置于電爐上灰化，然后轉(zhuǎn)移到馬福爐中于400℃加熱1小時，再于650～850℃加熱至恒重。根據(jù)公式計算SO₄^2-的含量?？勺鳛閷嶒炇屹|(zhì)量控制，仲裁分析，以及含硫酸酯化多糖的食品、保健食品、藥品中硫酸基的分析方法。文檔編號G01N5/00GK101393205SQ20081023349公開日2009年3月25日申請日期2008年10月28日優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日發(fā)明者靜何,劉建珍,張惠芬,張水花,戴偉鋒,李寶才,畢艷艷,誼秦,角仕云,昆黃申請人:昆明理工大學(xué)