專利名稱：一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及
腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片及其制備方法。
種蛋白芯片及其制備方法，特別是一種胸
背景技術(shù)：
對胸腹水中癌細(xì)胞進(jìn)行病理診斷是長期困擾病理學(xué)家的一個(gè)難題，特別是當(dāng)胸腹水中間皮細(xì)胞增生明顯時(shí)，在形態(tài)上常常與分化良好的癌細(xì)胞非常相似，極易混淆，給病理診斷帶來了很大的困難，即使是具有豐富臨床經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家也有可能出現(xiàn)誤診，這也是目前國際細(xì)胞病理學(xué)界的一個(gè)難題。 對于胸腹水中間皮細(xì)胞與癌細(xì)胞的鑒別，以往最為有效的解決方法是通過免疫組化染色區(qū)分間皮細(xì)胞和癌細(xì)胞。目前公知的檢測鑒別方法有兩種一種是直接在細(xì)胞涂片上進(jìn)行免疫組化染色，但是這種方法存在以下缺點(diǎn)，首先是由于細(xì)胞涂片不象組織切片那樣具有可復(fù)制性，每一張細(xì)胞涂片上面的細(xì)胞成分及分布都不盡相同，因此不能保證每一張涂片上都有癌細(xì)胞，其次由于涂片范圍廣泛，抗體需要量較大，費(fèi)用昂貴；再一種方法是細(xì)胞石蠟包埋法，即將胸腹水細(xì)胞離心收集后用瓊脂糖或蛋青等包埋，然后制成石蠟塊，利用石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，進(jìn)而對癌細(xì)胞及間皮細(xì)胞進(jìn)行鑒別診斷，雖然這種方法診斷率較高，但其鑒別診斷的過程復(fù)雜，耗時(shí)較長，且同樣存在免疫組化費(fèi)用昂貴的問題。正因如此，目前這兩種方法均未獲得病理醫(yī)師的普遍認(rèn)可，故也未能在臨床病理工作中得到推廣使用。 專利號(hào)為03111532. 2的申請文本曾披露了一種名稱為《自動(dòng)捕獲、識(shí)別細(xì)胞生物芯片及其制備方法》的生物芯片技術(shù)，這種生物芯片雖然能夠檢測并自動(dòng)捕獲胸腹水中的癌細(xì)胞，在一定程度上具有鑒別胸腹水癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞的作用，但是其芯片制備技術(shù)要求較高，芯片上的點(diǎn)樣蛋白穩(wěn)定性差，易于降解，運(yùn)輸、保存條件要求較高，而且點(diǎn)樣蛋白一旦降解、失效，使用時(shí)便再也無法檢測到胸腹水中的癌細(xì)胞，因此應(yīng)用受到限制，難以在臨床病理診斷中推廣使用。 正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，目前本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種穩(wěn)定性好、高通量、省時(shí)、價(jià)廉的胸腹水癌細(xì)胞檢測方法，以滿足臨床病理診斷工作的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠快速準(zhǔn)確地對胸腹水中的癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞進(jìn)行鑒別診斷的胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片及其制備方法，以解決目前胸腹水癌細(xì)胞病理診斷存在的難題。 本發(fā)明制品的技術(shù)方案是這樣的該胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片具有一個(gè)作為固體基質(zhì)的玻片，在玻片表面不同位置處通過點(diǎn)陣方式結(jié)合分布有由多種類型膠體金標(biāo)
記的抗腫瘤抗原特異性抗體。其中，結(jié)合在玻片上的抗腫瘤抗原特異性抗體包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA19-9)、糖類抗原(CA125)、上皮特異性抗原(ESA)和/或上皮膜抗原抗體(EMA)等；所說的玻片為醛基化處理的玻片。 用于制備該快速檢測蛋白芯片的方法包括下述的制備步驟 a、采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金取0.01X的HAuCl4(四氯金酸)水溶液100ml，加熱煮沸后，加入1%枸櫞酸三鈉(Na3C6H507 *2H20)水溶液0. 75 3ml，加熱煮沸30分鐘，制備出10 50nm粒徑大小的膠體金顆粒； b、膠體金標(biāo)記抗體將待標(biāo)記蛋白質(zhì)置入透析袋內(nèi)后直接放入雙蒸餾水中透析，然后fC離心60分鐘，取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至lmg/ml即可用于標(biāo)記；通過光電比色法確定標(biāo)記蛋白最適穩(wěn)定量為30 60ii g/ml，調(diào)節(jié)金溶膠pH至6. 0 9. O，在金溶膠中加入最適穩(wěn)定量的蛋白質(zhì)溶液，離心后將沉淀物溶于PEG2000緩沖液中，制成膠體金標(biāo)記抗體； c、在已準(zhǔn)備好的醛基玻片上點(diǎn)樣，點(diǎn)的大小為100 300um，兩點(diǎn)之間間隔5
30mm，點(diǎn)好的芯片經(jīng)水化烘干后用PBS(磷酸緩沖液)沖洗，再用1 %的BSA (封閉液)封閉
1小時(shí)，再用PBS沖洗，吹干后即制得胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片。 臨床應(yīng)用中，胸腹水脫落細(xì)胞懸液與芯片共孵育后，胸腹水中癌細(xì)胞會(huì)與芯片中
相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，通過顯微鏡即可以觀察到結(jié)合的癌細(xì)胞，從而達(dá)到快速檢測、診斷癌
性胸腹水的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)越性在于作為一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測
蛋白芯片，它能夠快速、準(zhǔn)確地對胸腹水中癌細(xì)胞與間皮細(xì)胞進(jìn)行鑒別診斷，同時(shí)因?yàn)榈鞍?br> 是由膠體金標(biāo)記，因此相比于以往的蛋白芯片，本蛋白芯片具有蛋白結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、
不易降解，適合室溫運(yùn)輸和保存以及高通量、省時(shí)、價(jià)廉等特點(diǎn)，同時(shí)因?yàn)槟z體金顆粒在普
通光學(xué)顯微鏡下可見，因此通過觀察膠體金顆?？梢源_定標(biāo)記蛋白的存在，具有自身對照作用。
具體實(shí)施例方式
醛基化玻片制作胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片的實(shí)施例 1、采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金取0. 01%的HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸后，攪動(dòng)下加入1%的枸櫞酸三鈉水溶液1. 25 2. 5ml，加熱煮沸30分鐘，制備出10 50nm粒徑大小的膠體金顆粒； 2、膠體金標(biāo)記抗體將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)置入透析袋內(nèi)后直接放入雙蒸餾水中透析，然后在溫度為4t:的條件離心60分鐘，取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至lmg/ml即可用于標(biāo)記；通過光電比色法確定標(biāo)記蛋白最適穩(wěn)定量為40 50ii g/ml，調(diào)節(jié)金溶膠pH至7. 5 8. 5，在金溶膠中加入最適穩(wěn)定量的蛋白質(zhì)溶液，離心60分鐘，離心后將沉淀物溶于PEG2000緩沖液中，制成膠體金標(biāo)記抗體； 3、在已準(zhǔn)備好的醛基玻片上點(diǎn)樣，點(diǎn)的大小為100 300um，兩點(diǎn)之間間隔5 30mm，點(diǎn)好的芯片經(jīng)水化烘干后用PBS沖洗，再用1 %的BSA封閉1小時(shí)，繼而再用PBS沖洗，吹干后即制得胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片。
本發(fā)明的使用方法包括以下步驟 (1)細(xì)胞收集3000轉(zhuǎn)/分鐘離心胸腹水脫落細(xì)胞5分鐘，然后收集細(xì)胞，用PBS
洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X 107/L并重懸細(xì)胞； (2)細(xì)胞孵育將細(xì)胞懸液滴在芯片上，37t:濕盒中孵育30分鐘；
(3)用PBS洗滌芯片3次，洗去未結(jié)合細(xì)胞；
(4)固定細(xì)胞10%福爾馬林固定細(xì)胞5分鐘；
(5)顯微鏡觀察HE染色，鏡下觀察癌細(xì)胞形態(tài)。
權(quán)利要求
一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片，其特征在于具有一個(gè)作為固體基質(zhì)的玻片，在玻片表面不同位置處通過點(diǎn)陣方式結(jié)合分布有由多種類型膠體金標(biāo)記的抗腫瘤抗原特異性抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片，其特征在于所說的抗腫 瘤抗原特異性抗體為癌胚抗原、糖類抗原、糖類抗原、上皮特異性抗原和/或上皮膜抗原抗 體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片，其特征在于所說的玻片為 醛基化處理的玻片。
4. 一種用于制備權(quán)利要求1所述的胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片的方法，其特征在于包括下述的制備步驟a、 采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金取O. 01X的HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸后， 加入1%枸櫞酸三鈉水溶液0. 75 3ml，加熱煮沸30min，制備出10 50nm粒徑大小的膠 體金顆粒；b、 膠體金標(biāo)記抗體將待標(biāo)記蛋白質(zhì)置入透析袋內(nèi)后直接放入雙蒸餾水中透析，然后 4t:離心60分鐘，取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至lmg/ml即可用于標(biāo)記；通過光電比色法確定 標(biāo)記蛋白最適穩(wěn)定量為30 60ii g/ml，調(diào)節(jié)金溶膠pH至6. 0 9. O，在金溶膠中加入最適 穩(wěn)定量的蛋白質(zhì)溶液，離心后將沉淀物溶于PEG2000緩沖液中，制成膠體金標(biāo)記抗體；c、 在已準(zhǔn)備好的玻片上點(diǎn)樣，點(diǎn)的大小為100 300um，兩點(diǎn)之間間隔5 30mm，點(diǎn)好 的芯片經(jīng)水化烘干后用PBS沖洗，再用1X的BSA封閉1小時(shí)，PBS沖洗，吹干后即制得胸腹 水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胸腹水癌細(xì)胞快速檢測蛋白芯片及其制備方法。所說的芯片具有一個(gè)固體基質(zhì)玻片，在玻片表面不同位置處通過點(diǎn)陣方式結(jié)合分布有由多種類型膠體金標(biāo)記的抗腫瘤抗原特異性抗體；其制備方法包括采用枸櫞酸三鈉還原法制備膠體金、膠體金標(biāo)記抗體及在已準(zhǔn)備好的醛基玻片上點(diǎn)樣等步驟。臨床應(yīng)用中，胸腹水脫落細(xì)胞懸液與芯片共孵育后，胸腹水中癌細(xì)胞會(huì)與芯片中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，通過顯微鏡即可以觀察到結(jié)合的癌細(xì)胞，從而達(dá)到快速檢測、診斷癌性胸腹水的目的。產(chǎn)品具有蛋白結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、不易降解，適合室溫運(yùn)輸和保存以及高通量、省時(shí)、價(jià)廉等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/552GK101726592SQ200810231658
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日
發(fā)明者張?jiān)搅? 李文生, 王岐山, 郭黨學(xué) 申請人:陜西省人民醫(yī)院