專利名稱：一種檢測血清對氧磷酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對氧磷酶活性的檢測方法。 技術(shù)背景
對氧磷酶(paraoxonases， PONs)是一個蛋白家族，由P0N1， P0N2， P0N3共三個成員 組成。其編碼基因位于7號染色體的長臂。P0N1和P0N3在肝臟中合成后分泌到血液中， 并與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合形成復合體。P0N2在人體肝，腦，腎及睪丸等組織中廣泛表 達，但不存在于血液中。
P0N1基因產(chǎn)物，也叫血清對氧磷酶，是這個多基因家族中發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的成 員。最初研究P0N1時，發(fā)現(xiàn)它能水解有機磷殺蟲劑 一對氧磷，對氧磷酶(E.C.3.1.8. 1) 的名字由此而來。隨后，人們又發(fā)現(xiàn)了它有水解芳香酯酶的活性，但對氧磷酶的名稱一直 沿用至今。人血清P0N1基因全長為33kb，由9個外顯子和8個內(nèi)含子構(gòu)成，其cDNA共 1065nt。 P0N1由355個氨基酸組成，純化的人血清P0N1是一個約43kD的糖蛋白，等電 點為5.1。目前發(fā)現(xiàn)在P0N1基因存在多態(tài)性現(xiàn)象。其中包括啟動子區(qū)的4個多態(tài)性位點 (-107C〉T,-162A〉G,-824G〉A(chǔ),-907G〉C)，能影響基因的表達和血清中該酶的活性。同時在 基因的編碼區(qū)也存在多態(tài)現(xiàn)象。分別是位于其編碼產(chǎn)物的第55位(55L/M)和第192位 (192Q/R)氨基酸。55L/M可能影響P0N1和HDL結(jié)合過程，192Q/R對P0N1的底物特異性 和水解活力產(chǎn)生影響。在正常人群中，血清P0N1的活力相差可達10-40倍，在單個基因 型中，P0N1蛋白水平的差異也可高達13倍。由于血清中P0N3的對氧磷酶活力較低，目 前所稱得血清對氧磷酶一般指的是P0N1.
P0N1是一種廣譜的非專一性酯酶。同時具有有機磷酯酶、芳香酯酶和內(nèi)酯酶活性。 可以水解異丙嘧磷、毒死蜱、對氧磷等有機磷殺蟲劑，甚至能分解某些神經(jīng)毒劑如沙林、 梭曼。研究表明，P0N1的在血清中的活性不僅可以提示個體抵抗有機磷毒劑能力的強弱， 而且其活力還與動脈粥樣硬化、冠心病2型糖尿病、高血壓、肝炎、阿爾茨海默病等的發(fā) 展有一定的相關(guān)性，因此，建立對氧磷酶活性的測定方法不僅有利于這些疾病的監(jiān)測，也 有利于疾病發(fā)病機制的深入研究。
目前國內(nèi)外對對氧磷酶的活性檢測主要是檢測其對氧磷酶和芳香酯酶的活性，最常用 的底物是對氧磷和乙酸苯酯。但兩種方法各有利弊，以乙酸苯酯為底物，反應(yīng)的檢測波長 在270nm，在該波段干擾物質(zhì)較多，不利于檢測的自動化。以對氧磷為底物進行檢測雖然能 夠在自動生化分析儀上進行，但對氧磷為劇毒物質(zhì)，購買和儲存都比較困難。而且工作者 在相關(guān)的檢測中必須做好防護以預防中毒。BryanF等人曾經(jīng)用對硝基苯乙酸乙酯為底物 測定肝細胞中P0N1的活性。該方法測定的原理是以對硝基苯乙酸乙酯為底物，在P0N1 芳香酯酶的作用下水解生成對硝基苯酚和乙酸。通過在405nm條件下測定對硝基苯酚的含 量來確定P0N1活力的大小。該方法可以在可見光波長范圍檢測結(jié)果，而對硝基苯乙酸乙 酯本身又無毒性，可以克服以上兩種測定方法制缺點，但由于其測定過程干擾物質(zhì)依然比 較多，且測定的靈敏度要比以乙酸苯酯為底物差，所以其應(yīng)用受到很大限制。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上篩選方案存在的弊端，本發(fā)明提供了一種操作簡單，反應(yīng)直觀，不依賴于儀 器，所用底物對人體無毒的快速測定血清對氧磷酶活性的新方法。 技術(shù)原理
該方法是在BryanF等的測定方法基礎(chǔ)上改進而來的。對硝基苯乙酸乙酯在對氧磷酶 的作用下生成硝基苯酚和乙酸，通過添加一種基于PH值變化的顏色指示劑溴百里香酚蘭 (其指示范圍為6—8，當PH-6時呈黃色，W^8時呈藍色，當PH值在兩者之間時，顯示不同的顏色變化，可以指示乙酸生成量的多少，從而間接指示對氧磷酶的活性)。而且指示劑 的添加使該檢測底物復合物的有效波長擴大到620nm,減少了檢測過程的干擾。
對硝基苯乙酸乙酯 - 對硝基酚+乙酸(反應(yīng)原理)
對氧磷酶
檢測方法
反應(yīng)體系中加入一定量的血清，對硝基苯乙酸乙酯(5mM),氯化鈣(20Min), tris-Hcl(O. lM,ra為7.7),37。C反應(yīng)一定時間后用0. 1M EDTA中止反應(yīng)。最后在該反映體 系中上添加O. 01%的溴百里香酚蘭，在620mn的可見光條件下測定光吸收值。 應(yīng)用舉例
1、 定量測定血清對氧磷酶的活性 人體內(nèi)血清對氧磷酶的活性在有10-40倍的個體差異，血清對氧磷酶的活性不同，個體
對有機磷毒劑的耐受能力也有很大差異，而且研究表明，其活性的高低與動脈粥樣硬化、 冠心病、糖尿病等的發(fā)病幾率都有一定的相關(guān)性。我們實驗證明，以對硝基苯乙酸乙酯為 底物的的測定方法雖然沒有乙酸苯酯靈敏度高，但人個體之間的血清對氧磷酶活性的差異 用該方法可以準確測定。(可以檢測100倍差別的血清對氧磷酶活性)該方法在普通的可 見分光光度計即可測定。
2、 定性評價人血清對氧磷酶高低 溴百里香酚蘭是一種對PH值非常敏感的顏色指示劑。通過反應(yīng)顏色的變化可以粗略的
觀察個體的血清對氧磷酶含量是否偏高。(對氧磷酶活性較低時，顯示為深藍色；對氧磷 酶活性偏高時，顯示為淺黃色；當活性處于中間時，呈現(xiàn)一系列深淺不同的顏色變化)
3、 用于對氧磷酶的高通量篩選 在篩選高產(chǎn)對氧磷酶基因工程菌時，該顏色反應(yīng)可以做為高通量篩選的耙點。
技術(shù)優(yōu)點
該方法操作簡便，在可見光分光光度計下即可完成，節(jié)約成本，而且該底物對人體無 害，容易獲得，在620nm條件下干擾物質(zhì)較少。靈敏的顏色反應(yīng)不僅可以在科研方面進行 高活力對氧磷酶的高通量篩選，而且更方便臨床上血清對氧磷酶的測定。更重要的是，我 們可以利用該原理進行血清對氧磷酶快速檢驗試紙條的研制，有望使病人可以不依賴儀器 可以進行的粗略自檢，便于病人在治療過程中更方便的了解自身病情的進展情況。
權(quán)利要求
1.一種新型的檢測血清對氧磷酶的方法，本發(fā)明的特征在于反應(yīng)體系中加入一定量的血清，對硝基苯乙酸乙酯(5mM)，氯化鈣(20Mm)，tris-Hcl(0.1M，PH為7.7)，37℃反應(yīng)一定時間后用0.1M EDTA中止反應(yīng)。最后在該反應(yīng)體系中上添加0.01％的溴百里香酚蘭，在620nm的可見光條件下測定光吸收值。
2. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的檢測血清對氧磷酶的方法。其關(guān)鍵特征在于在檢測體系中添加了顏色指示劑溴百里香酚蘭，其濃度范圍在0%— 30%之間。
3. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的檢測血清對氧磷酶的方法。本檢測方法中所用的緩沖液不限于Tris-Hcl緩沖液，可以是任何種類的PH值在6—8之間的緩沖液。
4. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的檢測血清對氧磷酶的方法的應(yīng)用。可用于編碼不同活性的血清對氧磷酶基因的高通量篩選。
5. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的檢測血清對氧磷酶的方法的應(yīng)用?？捎糜诙繖z測血清對氧磷酶的活性。
6. 按照權(quán)利要求l中所述的新型的檢測血清對氧磷酶的方法的應(yīng)用。可用于血清對氧磷酶活性的臨床快速檢測
7. 按照權(quán)利要求1中所述的新型的檢測血清對氧磷酶的方法的應(yīng)用。利用該原理進行血清對氧磷酶快速檢驗試紙條或快速檢測試劑盒的研制和應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及血清對氧磷酶活性的檢測方法。具體內(nèi)容是通過在測定血清對氧磷酶活性的反應(yīng)體系中添加一種特殊的顏色指示劑，反應(yīng)產(chǎn)物與顏色指示劑結(jié)合形成復合物之后使測定的吸光值范圍由405nm提高到620nm，降低了測定過程中其他物質(zhì)的干擾，而且該反應(yīng)有明顯的顏色變化譜，可以通過顏色變化來快速反映血清中對氧磷酶含量的高低。該方法簡便，靈敏，底物對人體無害，容易獲得，還可用于不同活性對氧磷酶的高通量篩選。
文檔編號G01N21/77GK101650312SQ20081023087
公開日2010年2月17日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者張建云, 谷立坤 申請人:河南工程學院