利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法，包括以下步驟：構(gòu)建含關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體；對骨骼肌生長相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和鋪板；配制啟動子重組子/脂質(zhì)體的混合物，對步驟2）獲得的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)Σ襟E3）獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。本發(fā)明具有靈敏度高、檢測速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)，使用的pGL3-Basic報(bào)告基因，因其無啟動子和增強(qiáng)子，可通過熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)來檢測插入啟動子的啟動活性，并且比較啟動子的強(qiáng)弱，進(jìn)而初步確定核心啟動子區(qū)域。
【專利說明】利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛辦/基因核心啟
動子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛MyoD /基因核心啟動子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]/的全稱為myogenic differentiation I，其中文名稱為生肌決定因子，是骨骼肌生長發(fā)育過程中重要的正調(diào)控基因，在肌形成肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，MyoD /起著總開關(guān)的作用，可以結(jié)合到肌細(xì)胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結(jié)蛋白等基因啟動子區(qū)發(fā)揮重要調(diào)控作用，促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活。MyoD /介導(dǎo)的肌分化機(jī)制作為研究細(xì)胞分化的最佳模型，已成為當(dāng)前眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)，尤為重要。目前，國內(nèi)外對該基因的表達(dá)調(diào)控在小鼠、雞和豬的肌細(xì)胞生成機(jī)理等方面的相關(guān)研究較多，在牛上已有一些研究，包括遺傳變異及功能研究等，但主要集中在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平，/基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。因此，基因啟動子的研究具有廣闊的研究前景，以期為轉(zhuǎn)基因牛的培育和牛肉品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。生肌決定因子I的主要功能包括:(I)促使靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(2)能把許多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并可促進(jìn)成肌細(xì)胞進(jìn)一步融和、分化為成熟的肌纖維。
[0003]pGL3-Basic是一類常用的報(bào)告基因，因其無啟動子和增強(qiáng)子，可通過熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)來檢測插入片段的啟動活性，并且比較啟動子的強(qiáng)弱和骨骼肌特異性，進(jìn)而初步確定核心啟動子區(qū)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]技術(shù)要求
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛I基因核心啟動子的方法，它具有靈敏度高、檢測速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛/基因核心啟動子的方法，包括以下步驟:
步驟I)、構(gòu)建含關(guān)嶺牛MyoD I基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體；
步驟2)、對骨骼肌生長相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和鋪板；
步驟3)、配制啟動子重組子/脂質(zhì)體的混合物，對步驟2)獲得的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
步驟4)、通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)Σ襟E3)獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。
[0006]步驟4)中所述的雙熒光素酶報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。
[0007]所述的雙熒光素酶活性檢測所采用的工作液是通過promega試劑盒配制獲得。
[0008]步驟I)中所采用的引物為8對，引物PO的上游引物的序列為:5 ' -ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物PO的下游引物的序列為:5 ' -GAAACCCAGCCGCATCTA-3 '；引物Pl的上游引物的序列為:5 ' - ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物Pl的下游引物的序列為:5 '-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3';引物 P2 的上游引物的序列為:5' - GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物P2的下游引物的序列為:5 ' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3 ';引物P3的上游引物的序列為:5 ' - GATATGGAGCTGCTGTCGC-3 '，引物P3的下游引物的序列為:5 ^ - AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3 ';引物P4的上游引物的序列為:5 ^ -GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物 P4 的下游引物的序列為:5' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3'；引物P5的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGATTCGGTAGATC-3 '，引物P5的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3 ';引物P6的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3 '，引物P6的下游引物的序列為:5 ' - AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3 ';引物P7的上游引物的序列為:5 '-TTAGGCTACTACGGGATAAA-3 '，引物 P7 的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC_3' o
[0009]有益效果
(I)本發(fā)明提供的方法具有靈敏度高、檢測速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。
[0010](2)本發(fā)明使用的pGL3-Basic報(bào)告基因，因其無啟動子和增強(qiáng)子，可通過熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)來檢測插入啟動子的啟動活性，并且比較啟動子的強(qiáng)弱，進(jìn)而初步確定核心啟動子區(qū)域。
【專利附圖】

【附圖說明】·
[0011]圖1為本發(fā)明所使用的技術(shù)路線；
圖2為構(gòu)建構(gòu)建重組子pUCm-T-1^c^ I pro載體方法示意圖；
圖3為克隆的啟動子片段；
圖4為酶切鑒定重組子pUCm-T-loi? I pro載體圖；
圖5為構(gòu)建pGL3-Basic-loj I pro真核表達(dá)載體示意圖；
圖6為酶切鑒定重組子pGL3-1(F0i? 1-pro載體圖；
圖7啟動子轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞雙熒光素酶活性檢測圖；
圖8為最終確定的關(guān)嶺牛/基因核心啟動子區(qū)域；
圖9、圖10為圖2的放大圖；
圖11、圖12為圖5的放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明的實(shí)施例:利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛/基因核心啟動子的方法，包括以下步驟:步驟1，含關(guān)嶺牛/基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體的構(gòu)建:構(gòu)建重組子T載體方法示意圖見圖2，克隆的啟動子片段見圖3，酶切T載體鑒定見圖4，構(gòu)建pGL3-BasiC-MyoD I pro真核表達(dá)載體見圖5,重組子pGL3-1(rc^ 1-pro載體鑒定見圖6。
[0014]步驟1.1，對/基因全長啟動子和亞克隆片段進(jìn)行克隆酶切及純化；
【權(quán)利要求】
1.一種利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟I)、構(gòu)建含關(guān)嶺牛MyoD I基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體； 步驟2)、對骨骼肌生長相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和鋪板； 步驟3)、配制啟動子重組子/脂質(zhì)體的混合物，對步驟2)獲得的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染； 步驟4)、通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)Σ襟E3)獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:步驟4)中所述的雙熒光素酶報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:所述的雙熒光素酶活性檢測所采用的工作液是通過promega試劑盒配制獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙熒光素酶報(bào)告基因確定關(guān)嶺牛/基因核心啟動子的方法，其特征在于:步驟I)中所采用的引物為8對，引物PO的上游引物的序列為:5 ^ -ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物PO的下游引物的序列為:5 ' -GAAACCCAGCCGCATCTA-3 ,;引物Pl的上游引物的序列為:5 ' - ACCTCCCGACATCATACATT-3 '，引物Pl的下游引物的序列為:5 '-GGTTTGGGTTGCTAGACG-3';引物 P2 的上游引物的序列為:5' - GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物P2的下游引物的序列 為:5 ' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3 ';引物P3的上游引物的序列為:5 ' - GATATGGAGCTGCTGTCGC-3 '，引物P3的下游引物的序列為:5 ^ - AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3 ';引物P4的上游引物的序列為:5 ^ -GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3'，引物 P4 的下游引物的序列為:5' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3'；引物P5的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGATTCGGTAGATC-3 '，引物P5的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC-3 ';引物P6的上游引物的序列為:5 ' - CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3 '，引物P6的下游引物的序列為:5 ' - AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3 ';引物P7的上游引物的序列為:5 '-TTAGGCTACTACGGGATAAA-3 '，引物 P7 的下游引物的序列為:5 ' - CTCCCCACCCCTACTTTC_3' ο
【文檔編號】C12Q1/68GK103571941SQ201310341205
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】許厚強(qiáng), 李飛, 陳偉, 陳祥, 趙佳福 申請人:貴州大學(xué)