一種過(guò)表達(dá)c2orf68基因質(zhì)粒構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能過(guò)表達(dá)cJ?〇r/你基因表達(dá)的真核重 組質(zhì)粒，以及利用該重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒研宄你功能提供了良好工具，也為研宄人肝癌、 人結(jié)直腸癌及其它惡性腫瘤中你基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細(xì)胞癌（hepatoceLLuLar carcinoma, HCC)，簡(jiǎn)稱(chēng)人肝癌，在世界范圍內(nèi)是第五 位最常見(jiàn)的癌癥，也是死亡率最高的癌癥之一。在我國(guó)每年因人肝癌死亡的人數(shù)超過(guò)30 萬(wàn)，僅次于肺癌，位居我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第二位。結(jié)直腸腺癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤 之一，近年來(lái)，其發(fā)病率逐年攀升，占所有惡性腫瘤的第二位。在歐洲，結(jié)直腸腺癌占惡性腫 瘤相關(guān)致死病因的第二位。在中國(guó)的一些大城市，結(jié)直腸癌的發(fā)病率也達(dá)到所有惡性腫瘤 發(fā)病率的2到5位。由于大多數(shù)惡性腫瘤具有特殊的生物學(xué)特性，早期診斷困難，易于發(fā)生 轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，所以遠(yuǎn)期治療效果不佳。惡性腫瘤的早期發(fā)生的分子機(jī)制尚未完 全闡明，因此深入了解癌癥發(fā)生的分子機(jī)理，對(duì)于研宄開(kāi)發(fā)癌癥早期診斷治療有重要作用。
[0003] 基因工程，又稱(chēng)為基因重組技術(shù)，是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來(lái)的在體外對(duì)DNA 進(jìn)行操作的一門(mén)技術(shù)，廣泛用于疾病基礎(chǔ)研宄、基因治療、基因免疫、基因疫苗等。其三要素 分別為：酶、目的基因、載體。而真核表達(dá)載體是基因工程中用于構(gòu)建真核基因表達(dá)系統(tǒng)的 一種載體，近幾十年來(lái)，各國(guó)學(xué)者圍繞真核表達(dá)載體進(jìn)行了各種疾病、基因等相關(guān)研宄，在 基因工程方面做了大量工作，為醫(yī)學(xué)科學(xué)研宄開(kāi)辟了嶄新途徑?；蚓幋a的蛋白 C20RF68中，含一個(gè)126個(gè)氨基酸的UPR)561結(jié)構(gòu)域，屬于UPR)561蛋白家族。迄今為止， 尚無(wú)任何關(guān)于UPR)561蛋白家族的功能報(bào)道。
[0004] 因此，本發(fā)明運(yùn)用基因重組技術(shù)，針對(duì)你基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體 pcDNA3. l(+)-cJ?or/a9,并將其轉(zhuǎn)染低表達(dá)或不表達(dá)dor/例的肝癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤 細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染堪因的細(xì)胞株，為研宄能提供了良好工具，亦為進(jìn) 一步研宄你基因在肝癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為 研宄人肝癌、人結(jié)直腸癌及其它惡性腫瘤中你基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的真核重組質(zhì)粒及其制備方法，并證明所述重組質(zhì) 粒為你功能研宄提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具，也為研宄人肝癌、人結(jié)直腸癌等及其它惡 性腫瘤中基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。
[0006] 人你基因已在GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)ΝΜ_001013649· 3,定位于2ρ11· 2,全長(zhǎng) 4283bp，編碼166個(gè)氨基酸，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :1所述。人基因 的組織表達(dá)譜分析顯示：該基因在人結(jié)直腸癌等胃腸腫瘤中均有表達(dá)。本發(fā)明所述的真核 重組質(zhì)粒，由序列表SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列中的CY- 與真核載體構(gòu) 建而成，所述CY- 段是起始密碼子下游73bp~573bp的核苷酸序列。
[0007] 本發(fā)明所述的真核重組質(zhì)粒，其制備方法依次包括以下的步驟： (1) 通過(guò)半巢式PCR合成人的CY- 基因片段； (2) 將上述獲得的核苷酸片段與真核質(zhì)粒連接，該插入片段的酶切位點(diǎn)分別為Xho I 和EcoR I，再將所述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出正確插 入的真核重組質(zhì)粒的克??； (3) 使用堿裂解法抽提真核重組質(zhì)粒，利用限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜分析所建的真核重 組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析。
[0008] (4)將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721人肝癌細(xì)胞、及LoVo人結(jié)直腸癌細(xì)胞， 觀(guān)察細(xì)胞生物學(xué)特性。
[0009] (5)實(shí)驗(yàn)表明，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人肝癌及人結(jié)直腸癌細(xì)胞，重組質(zhì)粒作用 于人基因可導(dǎo)致結(jié)人肝癌細(xì)胞的增殖，因此，本發(fā)明有助于研宄基因功 能，并且為研宄你基因在人肝癌及人結(jié)直腸癌中發(fā)病的作用提供了有用分子生物學(xué) 工具。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為本發(fā)明真核重組載體PCDNA3. 1 (+)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0011] 圖2為本發(fā)明真核重組載體pcDNA3. I (+)+cthm的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0012] 圖3為本發(fā)明真核重組載體pcDNA3. 1⑴的酶切鑒定圖譜。
[0013] 圖4為本發(fā)明真核重組載體pcDNA3. 1⑴+GY〃的測(cè)序圖譜。
[0014] 圖5為本發(fā)明真核重組載體pcDNA3. I (+)+GY_ e2°rf68的人肝癌細(xì)胞SMMC7721照片。
[0015] 圖6為本發(fā)明真核重組載體pcDNA3. I (+)+CTi2°rf68的人結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo照片 圖7為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中人c2orf68基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
[0016] 圖8為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中人內(nèi)參gapdh基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
[0017] 圖9為轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的人肝癌細(xì)胞株SMMC7721+CTi2° rf68，轉(zhuǎn)染空載體的陰性 對(duì)照組SMMC7721_ Ne，未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的空白對(duì)照組SMMC7721基因表達(dá)的柱狀圖。
[0018] 圖10為轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株L〇V〇+^2°rf68，轉(zhuǎn)染空載體的陰性 對(duì)照組L 0V0^e，未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的空白對(duì)照組LoVo基因表達(dá)的柱狀圖。
[0019] 圖 11 為 SDS-PAGE 顯示 SMMC772 l+CY-c2〇rf68、SMMC772 Γ NC，SMMC7721 及 LoVo+CY-c2OTf68 、LoV〇- ncS LoVo細(xì)胞株中C20RF68蛋白在電泳條帶圖。
[0020] 圖 12為C20RF68蛋白在SMMC7721+CY-c2〇rf68、SMMC772r NC，SMMC7721&LoVo+CY-c2orf68 、LoVo_ ncS LoVo細(xì)胞株中表達(dá)水平柱狀圖。
[0021] 圖13為轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的人肝癌細(xì)胞株SMMC7721+wm，轉(zhuǎn)染空載體的陰性 對(duì)照組SMMC772r Ne，未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的空白對(duì)照組SMMC7721細(xì)胞的增殖圖。
[0022] 圖14為轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo+CTm，轉(zhuǎn)染空載體的陰性 對(duì)照組L0V 0^e，未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的空白對(duì)照組LoVo細(xì)胞的增殖圖。
[0023] 圖15為轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的人肝癌細(xì)胞株SMMC7721+ 轉(zhuǎn)染空載體的陰性 對(duì)照組SMMC7721_ Ne，未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的空白對(duì)照組SMMC7721細(xì)胞的流式凋亡檢測(cè)圖。
[0024] 圖16為轉(zhuǎn)染真核重組質(zhì)粒的人肝癌細(xì)胞株SMMC7721+ 轉(zhuǎn)染空載體