專利名稱：豬瘟病毒(csfv)e2抗原原核高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建及csfve2抗原大規(guī)模生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟病毒(CSFV)E2抗原核高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建，并且提供了CSFV E2抗原大規(guī)模生產(chǎn)工藝，屬于豬瘟病毒基因工程
背景技術(shù)：
關(guān)于豬瘟病毒(CSFV)E2基因在大腸桿菌中的表達，至今，只有我們實驗室在大腸桿菌中進行了CSFV全長E2基因的表達，該結(jié)果請見(1)畜牧獸醫(yī)學(xué)報，30(2)146-152，1999。但其表達水平特別低，僅能用高度敏感的方法才能檢測到，沒有實用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在豬瘟病毒(CSFV)E2抗原核高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建，并且提供了其在大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)工藝，提高CSFV E2在大腸桿菌表達量，為大量生產(chǎn)CSFV E2論斷抗原提供一可靠的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下1、豬瘟病毒(CSFV)E2基因在大腸桿菌中的高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建通過計算機分析設(shè)計了CSFV E2基因的4條寡聚核苷酸突變引物，以重組PCR技術(shù)改造了E2基因5′端0.36kb的基因序列，然后將其與E2基因3′端的序列相連接，得到了改造好的全長E2基因，并將該基因克隆至pET-28a(+)中，得到表達全長E2基因的原核表達質(zhì)粒pETE2。具體步驟如下(1)根據(jù)CSFV石門株E2基因的核苷酸序列和用計算機對E2基因的分析結(jié)果設(shè)計以下4條突變引物MP1GGAATTCATGCGCTTAGCCTGCAAGGAAGATTACCGTTACGCAATCTCATCAACCAATGAGATTGGGTTACTCGMP2TGCCAggTACCggCgACTGACCACATTAAGTGCMP3AGTcGccGGTAccTGGCATCATTGCATAAGGGMP4CGGAATTCAaATTGGGCAGACAAGGTAG(2)重組PCR克隆mE2以上述4條寡聚核苷酸為引物，質(zhì)粒pHCE2為模板，以重組PCR技術(shù)改造了E2基因5′端0.36kb的基因序列，然后將其與E2基因3′端的序列相連接，得到了改造好的全長E2基因，并將該基因克隆至pET-28a(+)中，得到表達全長E2基因的原核表達質(zhì)粒pETE2。
(3)mE2重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建用Bam HI、Hind III同時分別酶切pBME2和pET-28a(+)，用Agarose Gel ExtractionKit(B.M)回收mE2，最后將mE2插入到pET-28a(+)的Bam HI、Hind III兩位點之間，構(gòu)建成表達質(zhì)粒pETE2。
(4)全長E2基因重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建以Sac I和Xhol I雙酶切pETME2回收大片段，同時以Sac I和Xhol I雙酶切和pcDSW，回收得到780pb的片段，將2片段以T4DNA連接酶相連接，得到表達全長E2基因的原核表達質(zhì)粒pETE2。
2.豬瘟病毒(CSFV)E2基因原核表達質(zhì)粒pETE2在大腸桿菌中的高效表達E2基因，大量生產(chǎn)出CSFV E2診斷抗原。步驟包括將pETE2轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS，挑取單個BL21(DE3)plysS的pETE2轉(zhuǎn)化菌，將它們接種至適量的含30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～1.0，4℃冰箱過夜，第2天將培養(yǎng)物用LB洗滌一遍，然后將它們分別接種至新鮮的含30μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～1.0，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2.5～5小時。同時培養(yǎng)、誘導(dǎo)含pET-28b(+)受體菌。將經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物于4℃ 5000RPM離心10min，收集細(xì)菌，加入1/5原培養(yǎng)物體積的冰預(yù)冷的50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA(pH8.0)，洗滌菌體一次，離心收集菌體重懸于1/10，原培養(yǎng)物體積的冰預(yù)冷的10mmol/L TrisHCl(pH8.0)中，置4℃?zhèn)溆?。?0ul菌液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明pETE2轉(zhuǎn)化菌可表達分子量為40.43kD的E2蛋白，用雙波長飛點掃描儀，對上述SDS-PAGE凝膠電泳的蛋白帶進行掃描，掃描結(jié)果表明E2的表達量在30％-45％之間。
本發(fā)明的積極效果在于將重組蛋白純化后，以CSFV陰陽性血清進行檢測，該重組蛋白可與陽性血清發(fā)生明顯的反應(yīng)，而不與陰性血清發(fā)生反應(yīng)。以此純化的重組蛋白建立了檢測豬瘟病毒抗體的間接ELISA方法，該方法可用于豬瘟的輔助診斷和豬瘟疫苗接種后的免疫監(jiān)測。
具體實施例方式實施例1根據(jù)CSFV石門株E2基因的核苷酸序列和用計算機對E2基因的分析結(jié)果設(shè)計以下4條寡聚核苷酸突變引物MP1GGAATTCATGCGCTTAGCCTGCAAGGAAGATTACCGTTACGCAATCTCATCAACCAATGAGATTGGGTTACTCGMP2TGCCAggTACCggCgACTGACCACATTAAGTGCMP3AGTcGccGGTAccTGGCATCATTGCATAAGGGMP4CGGAATTCAaATTGGGCAGACAAGGTAG以pHCE2為模板，MP1、MP2和MP3、MP4分別擴增mE2的5’端(mP12)和3’端(mP34)。循環(huán)參數(shù)為95℃ 50sec，52℃ 50sec，72℃20sec，25個循環(huán)，2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。用Agarose GelExtraction Kit(B.M)分別回收PCR產(chǎn)物mP12和mP34。然后，以回收的mP12和mP34等摩爾數(shù)的混合物為模板，以MP1和MP4為引物，擴增mE2。擴增條件為以下兩個程序程序195℃ 50sec，40℃ 50sec，72℃ 25sec，5個循環(huán)程序295℃ 50sec，52℃ 50sec，72℃ 25sec，10個循環(huán)如上鑒定和回收PCR產(chǎn)物mE2。用EcoRI、BamHI同時分別酶切mE2和pBluescript II KS(+)，然后，將兩者以T4連接酶連接，將mE2克隆到pBluescript II KS(+)中構(gòu)建成中間質(zhì)粒pBME2。
用Bam HI、Hind III同時分別酶切pBME2和pET-28a(+)，用Agarose Gel ExtractionKit(B.M)回收mE2，最后將mE2插入到pET-28a(+)的Bam HI、Hind III兩位點之間，構(gòu)建成表達質(zhì)粒pETME2。
以Sac I和Xhol I雙酶切pETME2回收大片段，同時以Sac I和Xhol I雙酶切和pcDSW，回收得到780pb的片段，將2片段以T4DNA連接酶相連接，得到表達全長E2基因的原核表達質(zhì)粒pETE2。
實施例2 CSFV E2抗原的生產(chǎn)將pETE2轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS，挑取單個BL21(DE3)plysS的pETE2轉(zhuǎn)化菌，將它們接種至10ml的含30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～1.0，4℃冰箱過夜，第2天將培養(yǎng)物用LB洗滌一遍，然后將其接種至1000ml新鮮的含30μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。將經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物于4℃ 5000 RPM離心10min，收集細(xì)菌，加入200ml冰預(yù)冷的50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA(pH8.0)，洗滌菌體一次，離心收集菌體重懸于100ml的冰預(yù)冷的10mmol/L Tris HCl(pH8.0)中，置4℃?zhèn)溆?。?0ul菌液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明pETE2轉(zhuǎn)化菌可表達分子量為40.43kD的E2蛋白，用雙波長飛點掃描儀(日本島津，CS9000)，對上述SDS-PAGE凝膠電泳的蛋白帶進行掃描，掃描結(jié)果表明E2的表達量為菌體總蛋白的45％。
實施例3 CSFV E2抗原的生產(chǎn)將pETE2轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS，挑取單個BL21(DE3)plysS的pETE2轉(zhuǎn)化菌，將它們接種至5ml的含30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6～1.0，4℃冰箱過夜，第2天將培養(yǎng)物用LB洗滌一遍，然后將其接種至500ml新鮮的含30μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.7，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。將經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物于4℃5000 RPM離心10min，收集細(xì)菌，加入100ml冰預(yù)冷的50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA(pH8.0)，洗滌菌體一次，離心收集菌體重懸于50ml的冰預(yù)冷的10mmol/L Tris HCl(pH8.0)中，置4℃?zhèn)溆?。?0ul菌液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明pETE2轉(zhuǎn)化菌可表達分子量為40.43kD的E2蛋白，用雙波長飛點掃描儀(日本島津，CS9000)，對上述SDS-PAGE凝膠電泳的蛋白帶進行掃描，掃描結(jié)果表明E2的表達量為菌體總蛋白的38.5％。
實施例4 CSFV E2抗原的生產(chǎn)將pETE2轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS，挑取單個BL21(DE3)plysS的pETE2轉(zhuǎn)化菌，將它們接種至5ml的含30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6，4℃冰箱過夜，第2天將培養(yǎng)物用LB洗滌一遍，然后將其接種至500ml新鮮的含30μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到1.0，加IPTG至終濃度為0.1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。將經(jīng)過誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物于4℃ 5000 RPM離心10min，收集細(xì)菌，加入100ml冰預(yù)冷的50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA(pH8.0)，洗滌菌體一次，離心收集菌體重懸于50ml的冰預(yù)冷的10mmol/L Tris HCl(pH8.0)中，置4℃?zhèn)溆谩Ｈ?0μl菌液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明pETE2轉(zhuǎn)化菌可表達分子量為40.43kD的E2蛋白，用雙波長飛點掃描儀(日本島津，CS9000)，對上述SDS-PAGE凝膠電泳的蛋白帶進行掃描，掃描結(jié)果表明E2的表達量為菌體總蛋白的30％。
權(quán)利要求
1.一種豬瘟病毒(CSFV)E2基因在大腸桿菌中的高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建，其特征在于4條寡聚核苷酸突變引物為MP1GGAATTCATGCGCTTAGCCTGCAAGGAAGATTACCGTTACGCAATCTCATCAACCAATGAGATTGGGTTACTCGMP2TGCCAggTACCggCgACTGACCACATTAAGTGCMP3AGTcGccGGTAccTGGCATCATTGCATAAGGGMP4CGGAATTCAaATTGGGCAGACAAGGTAG
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于以上述4條寡聚核苷酸為引物，質(zhì)粒pHCE2為模板，以重組PCR技術(shù)改造了E2基因5′端0.36kb的基因序列，然后將其與E2基因3′端的序列相連接，得到了改造好的全長E2基因，并將該基因克隆至pET-28a(+)中，得到表達全長E2基因的原核表達質(zhì)粒pETE2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的豬瘟病毒(CSFV)E2基因原核表達質(zhì)粒，該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中的高效表達E2基因，大量生產(chǎn)出CSFV E2診斷抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開一種豬瘟病毒(CSFV)E2抗原原核高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建及CSFV E2抗原大規(guī)模生產(chǎn)工藝,CSFV E2基因的4條寡聚核苷酸突變引物,以重組PCR技術(shù)改造了E2基因5′端0.36kb的基因序列,然后將其與E2基因3′端的序列相連接,得到全長E2基因,并將該基因克隆至pET－28a(+)中,得到表達全長E2基因的原核表達質(zhì)粒pETE2。將pETE2轉(zhuǎn)入至受體菌BL21(DE3)plySs中,在IPTG的誘導(dǎo)下,轉(zhuǎn)化菌均可高效表達目的基因,表達量在30%－45%之間。這是CSFV全長E2基因首次在E.coli中的高效表達和大量生產(chǎn)。
文檔編號A61K39/12GK1373224SQ02109350
公開日2002年10月9日 申請日期2002年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者余興龍, 涂長春, 張茂林 申請人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所