專(zhuān)利名稱(chēng)：：三聚體可溶抗體與其產(chǎn)生及使用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有膠原蛋白支架區(qū)的抗體，并且特別涉及一種三聚體可溶抗體。
背景技術(shù)：
：基于蛋白質(zhì)的結(jié)合試劑(protein-basedbindingreagent)在治療或診斷應(yīng)用上具有多種用途。抗體就是個(gè)極佳的范例，許多單克隆抗體(monoclonalantibodies,mAbs)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)mAbs)已經(jīng)成功地用來(lái)治療癌癥、感染性疾病與炎'l"生疾病(inflammatorydiseases)(Adamsetal.，NatBiotechnol.2005Sep;23(9):l147-57.)?？贵w的親合力是試劑成功與否的關(guān)鍵因素。具有高親合力的抗體可與天然的配體(ligand)為了目標(biāo)受體(targetedreceptor)有效地竟?fàn)幰詼p少劑量、毒性與花費(fèi)?？乖Y(jié)合部位(antigenbindingsite)的多聚化(multimerization)已被證實(shí)是增加抗體對(duì)抗原結(jié)合的整體強(qiáng)度的有效方式，其中將抗體對(duì)抗原結(jié)合的整體強(qiáng)度定義為抗體親合力(antibodyavidity)(功能性親和力(functionalaffinity))(Milleretal"JImmunol170:4854-4861，2003;Rheinneckeretal.，JImmunol157:2989-2997,1996;Shopes，JImmunol148:2918-2922,1992;Shufordetal.,Science252:724-727,1991;Wolffetal.，JImmunol148:2469-2474,1992)。由于免疫球蛋白G(immnoglobinQIgG)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)IgG)分子結(jié)構(gòu)的二價(jià)(bivalent)的本質(zhì)，不能用來(lái)同時(shí)結(jié)合多于兩個(gè)以上不同的抗原。因此需要多價(jià)(multi-valent)或多重特異性(multi-specific)蛋白質(zhì)結(jié)合試劑。在一些實(shí)例中，為了減少刺激細(xì)胞分裂副作用(mitogenicityside-effect),必須藉由設(shè)計(jì)Fc區(qū)域來(lái)避免效應(yīng)子功能(effectorfunction),例如抗體依賴(lài)型細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)以及斗卜體依賴(lài)型細(xì)刀包毒性作用(complementdependentcytotoxicity,CDC)。例如，鼠科動(dòng)物抗-人類(lèi)CD3單克隆抗體(正純種系(Orthoclone)OKT3,莫羅單抗-CD3(Muromonab-CD3))是以人類(lèi)T細(xì)胞上的T-細(xì)胞受體/CD3復(fù)合物(T-cellreceptor(TCR)/CD3complex)為標(biāo)靶的強(qiáng)而有力的免疫抑制劑，已有二十年的時(shí)間。其用來(lái)預(yù)防或治療器官同種異體移植排斥(allograftrejection)(Cosimietal.,NEnglJMed305:308-314，1981;Group,NEnglJMed313:337-342，1985;Kungetal.,Science206:347-349，1979)。然而使用這種治療的一個(gè)主要缺點(diǎn)是細(xì)胞因子(cytokine),例如TNF-a、IL-2與IFN-y的全身性釋放，其導(dǎo)致一系列有害的促有絲分裂作用(mitogeniceffects),包括感冒樣癥狀(flu-likesymptoms)、呼吸窘迫(respiratorydistress)、神經(jīng)癥狀(neurologicalsymptoms)與急性腎小管壞死(acutetubularnecrosis)(Abramowiczetal.,Transplantation47:606-608,1989;Chatenoudetal"NEnglJMed320:1420-1421,1989;Goldmanetal.,Transplantation50:158-159，1990;Toussaintetal.，Transplantation48:524-526，1989)。因?yàn)镺KT3與其它抗-CD3mAbs的促有絲分裂作用依賴(lài)于通過(guò)與帶有Fc受體的細(xì)胞(FcR-positivecell)(例如單核細(xì)胞(monocyte))的大量的TCR/CD3交聯(lián)(cross-linking)，因此最近有許多研究都希望藉由改變與FcR的結(jié)合，發(fā)展抗-CD3抗體的非促有絲分裂作用型(nonmitogenicforms)。由以上說(shuō)明可知，目前亟需一種具有高親合力、低促有絲分裂作用和體內(nèi)高穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)結(jié)合試劑。膠原蛋白是存在于哺乳動(dòng)物中最充足的蛋白質(zhì)。其為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellularmatrixprotein)，包括一個(gè)或多個(gè)三重螺旋區(qū)(月交原蛋白區(qū))，具有三個(gè)一組重復(fù)的序列甘氨酸(Gly)-X-Y，其中X與Y通常為脯氨酸(proline)(氨基酸密碼為P或Pro)與羥脯氨酸(hydroxyproline)(氨基酸密碼為O或Hyp)。這種三個(gè)一組的存在形式允許三個(gè)膠原蛋白多肽鏈(a-鏈)折疊成一個(gè)三重螺旋構(gòu)造。許多具有膠原蛋白三重螺旋區(qū)域(collagenousdomain)的膠原蛋白樣蛋白存在于人類(lèi)血清中，在保護(hù)防止其它感染性生物上扮演先天性免疫系統(tǒng)(innateimmunesystem)的角色。這些包括補(bǔ)體蛋白質(zhì)Clq、巨嗟細(xì)胞受體(macrophagereceptor)、月交凝素家力矣蛋白質(zhì)-甘露并唐結(jié)合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)、纖維膠凝蛋白(ficolin)、表面活性蛋白質(zhì)(surfactantprotein)A與D(SP-A與SP-D)。而這些"防御膠原蛋白"共同的結(jié)構(gòu)特征為多蛋白質(zhì)單位，具有在C端的目標(biāo)結(jié)合區(qū)。因此多聚化(multimerization)顯著增加這些防御膠原蛋白分子的結(jié)合區(qū)的功能性親合力。通過(guò)使用同源或異源三聚體化區(qū)融合至膠原蛋白區(qū)以驅(qū)使膠原蛋白的三重結(jié)構(gòu)形成，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了包含膠原蛋白區(qū)的異源融合蛋白質(zhì)的三聚體化。三聚體化區(qū)的例子包括原膠原蛋白(procollagen)的C前肽(propeptide)、凝集素家族蛋白質(zhì)的巻曲螺旋頸區(qū)(coiled-coilneckdomain)、FasL的C端部分與噬菌體T4fibritin折疊區(qū)(Franketal.,(2001)JMolBiol308:1081-1089;Holleretal.,(2003)MolCellBiol23:1428-1440;Noppeetal.,(1994)FEBSLett344:191-195)。纖維狀膠原蛋白(I、II、III、IV、V與XI型)與凝集素家族蛋白質(zhì)的三聚體配裝分別藉由其大的球狀C端區(qū)(C前肽，約250個(gè)氨基酸)與C端巻曲螺旋頸區(qū)(約35個(gè)氨基酸)，且以類(lèi)似拉鏈的方式(zipper-likefashion),人C端至N端產(chǎn)生膠原蛋白區(qū)的延伸(Bachingeretal.，(1980)EurJBiochem106:619:632;Hakanssonetal"(1999)Structure7:255-264;HakanssonandReid,(2000)ProteinSci9:1607-1617;ProckopandKivirikko,(1995)AnnuRevBiochem64:403-434;Sheriffetal.,(1994)NatStructBiol1:789-794;WeisandDrickamer，(1994)Structure2:1227-1240)。Gly-Pro-Hyp序列是膠原蛋白中最穩(wěn)定的序列，一般情況下三個(gè)為一組，并且肽(Gly-Pro-Hyp)K)可自身結(jié)合成高度穩(wěn)定的三重螺旋結(jié)構(gòu)(ChopraandA麵thanaraya腿，(1982)ProcNatlAcadSciUSA79:7180-7184;Engeletal.,(1977)Biopolymers16:601-622',Sakakibaraetal"(1973)BiochimBiophysAeta303:198-202;Yangetal"(1997)JBiolChem272:28837-28840)。與化學(xué)合成的(Gly-Pro-Hyp)1G肽相比，在生理環(huán)境下(Gly-Pro-Pro)!o肽不會(huì)自身配裝成穩(wěn)定的三重螺旋結(jié)構(gòu)(Engeletal.,(1977)Bi叩olymers16:601-622)。為了獲得熱穩(wěn)定(Gly-Pro-Pro)K)三重螺旋體，有兩種方法已被描述。第一，在20。C下，藉由體外第III型膠原蛋白的C端或N端鄰接的膠原蛋白樣肽的二硫^l定的氧化還原改組(redoxshuffling)制程獲得鏈內(nèi)二硫鍵結(jié)合的(Gly-Pro-Pro;ho三重螺旋體(Boudkoetal.;(2002)JMolBiol317:459-470;Franketal.,(2003)JBiolChem278:7747-7750)。第二，將衍生自噬菌體T4fibritin的穩(wěn)定異源三聚體化折疊區(qū)融合至(Gly-Pro-Pro)1D肽的C端以驅(qū)使在缺乏脯氨酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase,P4H)的大腸桿菌(五.co/Z)表達(dá)系統(tǒng)中的三聚體化與正確折疊(Franketal.,(2001)JMolBiol308:1081-1089)。許多研究已對(duì)G-X-Y重復(fù)序列進(jìn)行了熔點(diǎn)與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(Franketal.，(2001);Persikovetal.，(2000)Biochemistry39,14960-14967;Persikovetal.,(2004)ProteinSci.13:893-902;andMohsetal.,(2007)JBiol.Chem.282:29757-29765)。4艮據(jù)這些研究，可預(yù)8測(cè)多種重復(fù)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。上述的方法在使用上有其限制，因?yàn)槠淇赡懿恢С之愒炊嚯牡娜垠w化與折疊，且其可能引入與免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的異源抗原片段，而此異源抗原片段會(huì)嚴(yán)重限制潛在的治療應(yīng)用。因此目前所需的是一種體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)，其具有形成熱穩(wěn)定三重螺旋結(jié)構(gòu)的能力，而此熱穩(wěn)定三重螺旋結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)三聚體融合蛋白的形成，以及需要使這種三聚體化多肽在體外與體內(nèi)皆可使用。具有功能性三重螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白與含羥脯氨酸的肽的重組表達(dá)需要特定的翻譯后酶，特別是脯氨酸-4-羥化酶(ProckopandKivirikko,(1995)AnnuRevBiochem64:403-434)。一般藉由脯氨酸-4-羥化酶將位于膠原蛋白的Gly-X-Y區(qū)Y位置的脯氨酸轉(zhuǎn)錄后修飾成4-羥脯氨酸以穩(wěn)定膠原蛋白的三重螺旋結(jié)構(gòu)。在缺乏脯氨酸羥基化的情況下。膠原蛋白所必須的三重螺旋結(jié)構(gòu)在生理溫度下為熱不穩(wěn)定(BergandProckop,(1973)BiochemBiophysResCommun.52:115-120;Rosenbloom.etal.,(1973)ArchBiochemBiophys158:478-484)。原核細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生任何脯氨酸-4-羥化酶活性。酵母與昆蟲(chóng)細(xì)胞所具有的酶活性對(duì)于達(dá)到表達(dá)重組的膠原蛋白而言并不充足，除非同時(shí)引入外源性脯氨酸-4-羥化酶的基因以形成活化的a2p2四聚體。非纖維狀具有中斷的三重螺旋的原纖維伴隨性膠原蛋白(fibril-associatedcollagenw池interruptedtriple-helices,FACIT)(IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI與XXII型)為膠原蛋白家族中的亞組(subgroup)。它的存在是為了連接纖維狀膠原蛋白與其它基質(zhì)成分或細(xì)胞(ShawandOlsen,(1991)TrendsBiochemSci16:191-194)。在非纖維狀具有中斷的三重螺旋的原纖維伴隨性膠原蛋白中，由四個(gè)氨基酸分開(kāi)的保守的半胱氨酸位于C端膠原蛋白(C-terminalcollagenous,COLl)與非膠原蛋白(noncollagenous,NC1)區(qū)的接合點(diǎn)，且其負(fù)責(zé)三個(gè)聚集的膠原蛋白鏈的鏈內(nèi)二硫鍵鍵合(Mazzoranaetal.,(2001)JBiolChem276:27989-27998)。包括末端C端膠原蛋白與非膠原蛋白區(qū)的XII與XXI型迷你膠原蛋白(minicollagen)與人類(lèi)脯氨酸-4-羥化酶的基因的兩個(gè)亞單位一起分別被共表達(dá)于經(jīng)桿狀病毒(baculovirus)感染的甘藍(lán)尺蠖(7Hc/70//ww'am')與果蠅(Z)rayo//n7a)S2昆蟲(chóng)細(xì)胞中(Mazzoranaetal.,(2001)JBiolChem276:27989-27998;Lietal.，(2005)BiochemBiophysResCommun336:375-385)。第XII與XXI型迷你膠原蛋白三重螺旋的折疊優(yōu)先于二硫鍵連接的形成。在第XXI型迷你膠原蛋白中不充足的幾脯氨酸化將導(dǎo)致鏈內(nèi)二硫鍵連接的二聚體與鏈間二硫鍵連接的單體的產(chǎn)生(Lietal.，(2005)BiochemBiophysResCommun336:375:385)。Mazzorana等已顯示包含雞膠原蛋白XII完整的NCI區(qū)與COL1區(qū)的僅5個(gè)末端G-X-Y重復(fù)序列的構(gòu)建體不可形成三聚體。COL1的5個(gè)額外的C端G-X-Y重復(fù)序列的存在使三聚體可以形成。Mazzorana所使用的構(gòu)建體包括作為標(biāo)記的人類(lèi)c-myc蛋白質(zhì)的片段。就其本身而i侖，Mazzorana并未提出具有這些序列的三聚體化對(duì)于附加分子(attachedmolecule)的折疊或功能的影響，或者高分子量附加分子(諸如蛋白質(zhì)分子)對(duì)于自身三聚體化的影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明揭露與三聚體抗體有關(guān)的組合物、方法與試劑盒。此抗體具有高親合力、低有絲分裂的作用(mitogeniceffects)與高體內(nèi)穩(wěn)定性等特性。并且，此抗體可為多價(jià)或多重特異性(multi-specific)。本發(fā)明揭露由三條多肽所組成的三聚體可溶抗體。其中，每條多肽包括由至少10個(gè)G-X-Y氨基酸重復(fù)序列所組成的膠原蛋白支架區(qū)(G為甘氨酸，X與Y則可為任何氨基酸)；此10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列的組成可為G-P-P或G-P-O,且至少6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列可由G-P-O所構(gòu)成(P為脯氨酸，而O為羥脯氨酸)。除了膠原蛋白支架區(qū)，上述多肽還包含抗體區(qū)。所述三條多肽的膠原蛋白樣支架區(qū)可交互作用而形成三聚體可溶抗體，此三聚體可溶抗體以至少107M-1(以平衡結(jié)合常數(shù)(equilibriumassociationconstant)KA表示)的親合力，特異性結(jié)合至配體。本發(fā)明也包括一種三聚體可溶抗體，其包括三條多肽，其中各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，包括至少10個(gè)G-X-Y氨基酸重復(fù)序列(其中G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸)；在一實(shí)施例中，至少6個(gè)Y是由羥脯氨酸所構(gòu)成。除了膠原蛋白支架區(qū)，上述多肽還包含抗體區(qū)。所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)可交互作用而形成三聚體可溶抗體，此三聚體可溶抗體以至少10卩M"的親合力，特異性結(jié)合至配體。本發(fā)明也包括一種三聚體可溶抗體，其包括三條多肽，其中各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，由至少6、7或8個(gè)G-P-0氨基酸重復(fù)序列所構(gòu)成。除了膠原蛋白支架區(qū)，上述多肽還包含抗體區(qū)。所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)可交互作用而形成三聚體可溶抗體，此三聚體可溶抗體以至少107M"的親合力，特異性結(jié)合至配體。在某些實(shí)施例中，該三聚體可溶抗體以至少10SM"或1(^M"的親合力，特異性結(jié)合至配體。在某些實(shí)施例中，可與該三聚體可溶抗體相結(jié)合的配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體、人類(lèi)CD3、人類(lèi)HER2/neu、或人類(lèi)TNF-a。三聚體可溶抗體更可包含標(biāo)記多肽的編碼序列。在一優(yōu)選實(shí)施例中，此標(biāo)記多肽為熒光酶多肽。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，標(biāo)記多肽為綠色熒光多肽。在一實(shí)施例中，膠原蛋白樣區(qū)包括(G-P-P/0)u)的序列。在一實(shí)施例中，各多肽包括少于13個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，各多肽包括少于20個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，各多肽包括少于30個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，各多肽包括少于50個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，各多肽不包括膠原蛋白NC1區(qū)。在一實(shí)施例中，各多肽不包括二硫鍵結(jié)(disulfideknot)。在一實(shí)施例中，各多肽不包括噬菌體T4fibritin4斤疊區(qū)。在一實(shí)施例中，各多肽的分子量小于42kD。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體的分子量小于130kD。在一實(shí)施例中，1/3以上的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，1/2以上的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，2/3以上的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，3/4以上的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-0。在一實(shí)施例中，所有的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，膠原蛋白樣區(qū)包括由(G-P-P/0)sGKPGKP(G-P-P/0)6構(gòu)成的序列。本發(fā)明包括可制造出三聚體可溶抗體的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步包括用以表達(dá)該三聚體可溶抗體的載體，當(dāng)該載體被引入宿主細(xì)胞時(shí)，可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該三聚體可溶抗體。本發(fā)明也包括宿主細(xì)胞，其包含可表達(dá)上述三聚體可溶抗體的載體。本發(fā)明包括產(chǎn)生三聚體抗體的方法與試劑盒，其中該方法或試劑盒包含將可表達(dá)膠原蛋白支架區(qū)的核酸序列，讀框融合(in-framefiision)至可表達(dá)抗體區(qū)的核酸序列，其中該膠原蛋白支架區(qū)包括10-30個(gè)G-X-Y氨基酸重復(fù)序歹寸(G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸)，且至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P。讀框融合兩段核酸序列后，利用細(xì)胞將該融合序列所對(duì)應(yīng)的多肽表達(dá)出來(lái)，其中在該多肽鏈中至少有6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列(G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸)的Y位置是被羥脯氨酸化的。上述三條多肽，其經(jīng)羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)，可交互反應(yīng)而形成三聚體可溶抗體，此抗體可以至少10"M"的親合力，特異性結(jié)合至配體。本發(fā)明揭露一種調(diào)節(jié)(即抑制或提高)配體的生物活性的方法與試劑盒，包括將三聚體可溶抗體與該配體一起培養(yǎng)，而該三聚體可溶抗體包括三條多肽，其中各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，包括至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列(G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸)，其中至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列可為G-P-P或G-P-O,且至少6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列可為G-P-0(P為脯氨酸，O為羥脯氨酸)；除了膠原蛋白支架區(qū)，上述多肽還包含抗體區(qū)。所述三條多肽的羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)，可互相作用而形成三聚體可溶抗體，此三聚體可溶抗體以至少1(^M"的親合力，特異性結(jié)合至配體。藉由該三聚體可溶抗體與該配體的相互結(jié)合，可抑制該配體的生物活性。本發(fā)明包括一種檢測(cè)配體的方法與試劑盒，包括l)將三聚體可溶抗體與配體一起培養(yǎng)，其中該三聚體可溶抗體由三條多肽所構(gòu)成，且各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，由至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列(G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸)所構(gòu)成，其中至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O,且至少6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-0(P為脯氨酸，O為羥脯氨酸)，除了膠原蛋白支架區(qū)，上述多肽還包含抗體區(qū)，所述三條多肽的羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)，可交互作用而形成三聚體可溶抗體，此三聚體可溶抗體可以至少107M"的親合力，特異性結(jié)合至配體；以及2)4企測(cè)該三聚體可溶抗體對(duì)該配體的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，三聚體可溶抗體包括熒光素酶多肽或綠色熒光多肽。為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉優(yōu)選實(shí)施例，并配合所附圖示，作詳細(xì)說(shuō)明如下圖l顯示蛋白質(zhì)復(fù)合物，其具有自身配裝三重螺旋膠原蛋白支架區(qū)，例如源自人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI型或膠原蛋白樣區(qū)的(GPP)u),以及異源區(qū)。圖2A與2B分別為(A)三聚體膠原蛋白支架抗體(CSA),其包括源自O(shè)KT3(抗CD3)、528(抗EGFR)或erb(抗EGFR)的氨基端scFv，其分別讀框融合至人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI型，跟隨著組氨酸標(biāo)記。虛線(xiàn)鏈內(nèi)二硫鍵；(B)蛋白質(zhì)復(fù)合物的Western印跡的結(jié)果圖。OKT3mC21包括源自O(shè)KT3IgG的氨基端抗CD3、人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI型多肽，跟隨著組氨酸標(biāo)記；OKT3mC21fd包括源自O(shè)KT3IgG的氨基端抗CD3、人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI型多肽，跟隨著T4fibrtin折疊區(qū)與組氨酸標(biāo)記。將培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞的培養(yǎng)基在非還原環(huán)境下于SDS-PAGE上進(jìn)行電泳之后，并以對(duì)膠原蛋白XXI型C端的單克隆抗體，3E2,進(jìn)行免疫印跡。T:鏈內(nèi)二硫鍵連接的三聚體；Mt:包含分子間二硫鍵連接的三聚體的單體。圖3顯示雙重特異性的三聚體膠原蛋白支架抗體，包括氨基端OKT3單鏈抗體(OKT3一scFv)、人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI型，跟隨著C端528單鏈抗體(528—scFv)。圖4A(a-e)與4B(a-c)為不同形式的抗體的圖式(A)三聚體膠原蛋白支架抗體scFv-Col(a)包括氨基端scFv、人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP),。與膠原蛋白XXI型的羧基端NC1區(qū)；scFv-GPP10(b)包括氨基端scFv與膠原蛋白樣區(qū)GSP(GPP)10GPS;Col-scFv(c)包括氨基端二硫鍵結(jié)(TCPPCPRSIP)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP)H),跟隨著源自膠原蛋白XXI型的NC1區(qū)的羧基端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)與scFv;BiscFv-Col(d)包括氨基端scFv1、人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP)!o，跟隨著羧基端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)與scFv2;scFv-Col-Lue(e)包括氨基端scFv、人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP),o，跟隨著羧基端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)與焚光酶；(B)從左至右(a)免疫球蛋白G(IgG)，(b)嵌合(scFv-Fc)與(c)單鏈抗體(scFv,灰色區(qū)域)。虛線(xiàn)鏈內(nèi)二硫鍵。圖5A-B顯示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，各種抗體分子的純化與結(jié)構(gòu)特征。(A)顯示的抗體于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被穩(wěn)定地表達(dá)，且藉由柱層析將其從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境下(第1-5泳道)與還原環(huán)境下，而在還原環(huán)境下樣本于70。C下以50mMDTT處理10分鐘(第6-10泳道)。(B)藉由兩個(gè)三聚體分子的鏈內(nèi)二硫鍵合形成erb_scFv-Col六聚體。將純化的erb—scFv-Col(1mg/ml)于37。C下，缺乏(第1泳道)或存在(第3泳道)IOmMDTT的情形下培養(yǎng)1小時(shí)。將經(jīng)DTT處理的樣本進(jìn)一步與50mMN-乙基順丁烯二酰亞胺(N-ethyl-maleimide)于室溫反應(yīng)30分鐘(第2泳道)。將育有相同蛋白質(zhì)量的樣本于7%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳以醋酸鈉作為電泳緩沖液。將凝膠以考馬斯藍(lán)進(jìn)行染色。"M"為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。圖6A-B顯示erb—scFv-Col的三聚體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。(A)將于包含2M尿素的50mMTris-HCl(pH8)中的純化erb—scFv-Col在室溫下以缺乏(第1-3泳道)或存在(第4-9泳道)10mMTEPC進(jìn)行處理。在室溫下以50mMN-乙基順丁烯二酰亞胺烷基化還原的樣本。所有具有相同蛋白質(zhì)量的樣本在指定溫度下熱處理10分鐘，之后立即加入SDS加樣緩沖溶液。在非還原環(huán)境下，將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。將凝膠以考馬斯藍(lán)進(jìn)行染色。(B)在于(a)中的不同溫度下定量還原/烷基化的erb—scFv-Col三聚體的水平(第4_9條)。使用密度計(jì)(densitometer)來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)條帶的密度進(jìn)行定量。在各溫度點(diǎn)的三聚體或單體的總量標(biāo)準(zhǔn)化(normalized)為100。圖7顯示在酸水解后erb一scFv-Col的苯氨基硫曱?；?phenylthiocarbamyl，PITC)氨基酸衍生物的HPLC洗提量變曲線(xiàn)。在酸水解后，erb—scFv-Col的苯氨基硫曱?；苌被岜环蛛x于逆相C18硅柱且在254nm檢測(cè)到PTC色基(chromophores)。羥脯氨酸衍生物的波峰位置以箭號(hào)指示。圖8A-C顯示EGFR的細(xì)胞外區(qū)與erb—scFv-Col(A)、erb—scFv-Fc(B)或erb—scFv(C)之間互相作用的表面等離振子共振分析。各抗體于指定濃度被注入且流動(dòng)于在涂布有固定化的EGFR細(xì)胞外區(qū)的芯片上，以10iil/分鐘的流速。圖9顯示OKT3置換分析。將人類(lèi)CD3(+)T細(xì)胞與連續(xù)稀釋的OKT3—scFv-Col或OKT3IgG—起培養(yǎng)1小時(shí)。加入飽和量的OKT3-FITC額外培養(yǎng)1小時(shí)。清洗細(xì)胞并將其固定；藉由流式細(xì)胞技術(shù)將OKT3-FITC進(jìn)行定量。當(dāng)藉由加入無(wú)先前阻礙的抗體的OKT3-FITC來(lái)測(cè)量時(shí)，以最大熒光的百分比抑制來(lái)表達(dá)數(shù)值。圖10A-B顯示膠原蛋白支架抗體分子的穩(wěn)定性。(A)于人類(lèi)血清中各種形式的erb抗體的穩(wěn)定性。藉由培養(yǎng)在37°C下人類(lèi)血清中來(lái)測(cè)定erb—scFv-Col、erb—scFc-Fv或erb—scFv的穩(wěn)定性。使用抗c-mycmAb藉由ELISA來(lái)測(cè)定在各種時(shí)間培養(yǎng)后所保留的活化抗EGFR的量。(B)于小鼠中的erb_scFv-Col的藥物動(dòng)力學(xué)。以2mg/Kg的erb—scFv-Col對(duì)雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注14射。在不同時(shí)間點(diǎn)取出血液樣本，使用結(jié)合HRP的兔抗c-myc抗體藉由ELISA來(lái)測(cè)定erb—scFv-Col于血漿中的水平。在各時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果為取自于三只動(dòng)物的平均，而誤差棒(errorbar)則代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖11A-BOKT3衍生膠原蛋白支架抗體為非有絲分裂的，具有有效免疫抑制活性。(A)T細(xì)胞增殖對(duì)OKT3IgG與OKT3—scFv-Col的反應(yīng)。從三位健康正常的捐獻(xiàn)者收集人類(lèi)外周血單核細(xì)胞，且將其單獨(dú)于連續(xù)對(duì)數(shù)稀釋的OKT3IgG或OKT3—scFv-Col培養(yǎng)72小時(shí)，加上10|iMBrdU再額外培養(yǎng)8小時(shí)。藉由BrdU-ELISA使用化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)免疫分析來(lái)測(cè)量細(xì)胞增殖以定量在DNA合成期間的BrdU合并。各點(diǎn)以三個(gè)捐獻(xiàn)者的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。(B)藉由OKT3IgG與OKT3—scFv-Col抑制混合淋巴球反應(yīng)。將反應(yīng)者外周血單核細(xì)胞與絲裂霉素C處理的刺激者在不同濃度的OKT3IgG(實(shí)心圓)與OKT3—scFv-Col(空心圓)存在的情況下共培養(yǎng)五天，再加上BrdU額外處理16小時(shí)。以BrdU-ELISA測(cè)量細(xì)胞增殖。將反應(yīng)者外周血單核細(xì)胞與絲裂霉素C處理的刺激者在缺乏抗體存在的情況下共培養(yǎng)五天，分別以實(shí)心方框與實(shí)心三角表示。在缺乏抗體的條件下，未處理刺激者PBMC的細(xì)胞增殖以空心方框表示。圖12A-F顯示藉由OKT3IgG與OKT3—scFv-Col誘發(fā)的細(xì)胞因子釋放。自健康正常的捐獻(xiàn)者收集人類(lèi)外周血單核細(xì)胞，并且單獨(dú)與連續(xù)對(duì)數(shù)稀釋的OKT3IgG(實(shí)心圓)或OKT3—scFv-Col(空心圓)一起培養(yǎng)。于細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液中，IL-2與其它細(xì)胞因子的濃度分別在24與72小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)以ELISA測(cè)量。各點(diǎn)以三個(gè)捐獻(xiàn)者的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。圖13A-B顯示Col-erb—scFv的純化。(A)膠原蛋白支架抗體，Col-erb—scFv的圖式，Col-erb—scFv包括氨基端二硫鍵結(jié)(TCPPCPRSIP)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP),o,被C端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)源自XXI型膠原蛋白的NC1區(qū)以及erb一scFv(抗EGFR)跟隨著。(B)Col-erb—scFv的純化。藉由柱層析從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化于小鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)重組的Col-erb_scFv。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境下(第1泳道)與還原環(huán)境下，而在還原環(huán)境下樣本于7(TC下以50mMDTT處理10分鐘(第2泳道)。以Imperial蛋白質(zhì)染色溶液(PierceBiotechnology,Inc.)對(duì)凝月交進(jìn)行染色。圖14A-C顯示膠原蛋白支架抗體的膠原蛋白支架肽，包括(GPP)u)藉由其15自身可驅(qū)動(dòng)熱穩(wěn)定非共價(jià)鍵合三聚體融合蛋白質(zhì)的形成。(A)膠原蛋白支架抗體，erb—scFv-GPP10的圖式，erb—scFv-GPP10包括氨基端erb—scFv(抗EGFR)以及膠原蛋白樣區(qū)GSP(GPP)k)GSP。(B)erb—scFv-GPPK)的三聚體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定。將于包含2M尿素的50mMTris-HCl(pH8)中的純化erb—scFv-GPP,o在室溫下以缺乏(第1-3泳道)或存在(第4-9泳道)IOmMTEPC進(jìn)行處理。所有具有相同蛋白質(zhì)量的樣本在指定溫度下以熱處理IO分鐘，之后立即加入SDS加樣緩沖溶液。在非還原環(huán)境下，將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。將凝膠以Imperial蛋白質(zhì)染色溶液(PierceBiotechnology,Inc.)進(jìn)行染色。(C)藉由ELISA測(cè)定erb_scFv-GPP1(^tEGFR-ECD的結(jié)合。將96孔微量測(cè)試板用1|ug/mlEGFR-ECD涂布，之后與各種濃度純化的erb_scFv-GPP1Q與HRP連結(jié)抗c-myc抗體一起培養(yǎng)。于450nm測(cè)量吸收。圖15A-C顯示763—scFv-Col的純化與特征。(A)膠原蛋白支架抗體，763一scFv-Col的圖式，763—scFv-Col包括氨基端763—scFv(抗EGFR)、突變的人類(lèi)IgG鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP;ho,被XXI型膠原蛋白的C端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)跟隨著。(B)藉由柱層析從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化于小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)重組的763—scFv-Col。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境下(第1泳道)與還原環(huán)境下(第2泳道)。(C)藉由763—scFv-Col抑制EGFR的EGF誘發(fā)酪氨酸磷酸化(tyrosinephosphorylation)。在缺乏或存在763—scFv-Col(0.2-150nM)的條件下，將A431細(xì)胞與或不與16nMEGF—起培養(yǎng)30分鐘。在還原環(huán)境下，細(xì)胞溶解物(celllysate)于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離。將從不同細(xì)胞溶解物提取出的等量總蛋白質(zhì)加樣至各泳道中。使用抗磷酸化酪氨酸(phosphotyrosine)mAb藉由Western印跡檢測(cè)。于細(xì)胞溶解物中的EGFR酪氨酸磷酸化。使用抗(3肌動(dòng)蛋白(P-actin)作為加樣對(duì)照組。在缺乏抗體的條件下，將EGF誘發(fā)EGFR酪氨酸磷酸化指定為100%。圖16A-C顯示763—CSA2的純化與特征。膠原蛋白支架抗體，763—CSA2的圖式，763—CSA2包括氨基端氨基端763—scFv(抗EGFR)、突變的人類(lèi)IgG鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP)5GKPGKP(GPP)6，被XXI型膠原蛋白的C端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)跟隨著。(B)三聚體的確認(rèn)。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境下(第2泳道)。第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。(C)藉由ELISA測(cè)定763—CSA2對(duì)EGFR的結(jié)合。將96孔微量測(cè)試板用1pg/mlEGFR涂布，且之后與各種濃度純化的763—CSA2與HRP連結(jié)抗c-myc抗體一起培養(yǎng)。于450nm測(cè)量吸收。圖17A-C顯示雙重特異性CSA,763CSAOKT3的純化與特征。(A)膠原蛋白支架抗體，763CSAOKT3的圖式，763CSAOKT3包括氨基端氨基端763—scFv(抗EGFR)、突變的人類(lèi)IgG鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP),o，被XXI型膠原蛋白的C端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)與C端OKT3—scFv(抗CD3)跟隨著。(B)包含重組的雙重特異性763CSAOKT3抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基的Western印跡分析。從四個(gè)不同的穩(wěn)定復(fù)制(號(hào)碼從1-4)而來(lái)的各20(il的細(xì)胞培養(yǎng)基，在非還原與還原環(huán)境下，于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，且之后以抗c-mycmAb進(jìn)行免疫印跡分析。以過(guò)氧化酶(peroxidase)連結(jié)抗小鼠二次抗體檢測(cè)固定的抗體。(C)763CSAOKT3的純化。藉由柱層析從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化于小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)重組的763CSAOKT3。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境下(第1泳道)與還原環(huán)境下，而在還原環(huán)境下樣本于70°C下以50mMDTT處理10分鐘(第2泳道)。以ImperialTM蛋白質(zhì)染色溶液(PierceBiotechnology,Inc.)對(duì)凝膠進(jìn)行染色。圖18顯示雙重特異性CSA，763CSAOKT3，交聯(lián)A431(具有EGFR)與人類(lèi)CD3(+)T細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。于缺乏(A)或存在1:4(B);1:2(C)稀釋的包含重組的763CSAOKT3抗體的培養(yǎng)基中，混合等量(lx106細(xì)胞)的PKH-67標(biāo)記的A431細(xì)胞與PKH-26標(biāo)記的人類(lèi)CD3(+)T。圖19A-C顯示雙功能CSA，h4D5CSA-Luc的純化與特征。(A)膠原蛋白支架抗體，h4D5CSA-Luc的圖式，h4D5CSA-Luc包括氨基端氨基端h4D5—scFv(抗HER2/neu)、突變的人類(lèi)IgG鉸鏈區(qū)、膠原蛋白樣區(qū)(GPP),o,被XXI型膠原蛋白的C端二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)與C端Gaussia熒光酶跟隨著。(B)h4D5CSA-Luc的純化。藉由柱層析從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化于小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)重組的h4D5CSA-Luc。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境下(第2泳道)與還原環(huán)境下，而在還原環(huán)境下樣本于7(TC下以50mMDTT處理10分鐘(第3泳道)。以ImperialTM蛋白質(zhì)染色溶液(PierceBiotechnology,Inc.)對(duì)凝膠進(jìn)行染色。第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)品。(C)藉由ELISA測(cè)定h4D5CSA-Luc對(duì)HER2/neu過(guò)量表達(dá)的SKOV-3細(xì)胞的結(jié)合。96孔微量測(cè)試板被5x104細(xì)胞涂布且與兩倍連續(xù)稀釋的純化h4D5CSA-Luc—起培養(yǎng)。在以PBS/1%BSA清洗測(cè)試板后，藉由化學(xué)發(fā)光與生物熒光的附加來(lái)檢測(cè)固定的抗體，以微盤(pán)式光度計(jì)(microplateluminometer)來(lái)獲得數(shù)值。分析樣本三次。圖20A-B顯示357一scFv-Co1的純化與特征。(A)藉由柱層析從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化于小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)重組的抗體。將樣本于具有MOPS緩沖溶液的10%SDS/Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，在非還原環(huán)境(第1泳道)與還原環(huán)境(第2泳道)下。藉由357—scFv-Col與357IgG中和L929細(xì)胞的TNF-a誘發(fā)細(xì)胞凋亡。將L929小鼠纖成纖維細(xì)胞(fibroblast)(5x103細(xì)胞)與包含2嗎/ml放線(xiàn)菌素D與10ng/ml人類(lèi)重組TNF-a的357—scFv-Col或357IgG—起培養(yǎng)24小時(shí)。藉由MTT分析測(cè)定TNF-a誘發(fā)的細(xì)胞毒性。藉由在460nm測(cè)量光學(xué)密度來(lái)測(cè)定可見(jiàn)細(xì)胞的數(shù)目。使用公式來(lái)計(jì)算藉由抗體TNF-a的中和％中和=100x(細(xì)胞毒性對(duì)照-細(xì)胞毒性Ab)/細(xì)胞毒性對(duì)照；%細(xì)胞毒性二100x(j對(duì),稱(chēng)-j檢測(cè))/A對(duì)照，其中^對(duì)照為在對(duì)照組孔的吸收(不具TNF-a)，而^檢測(cè)為在具有TNF-a(細(xì)胞毒性對(duì)照)或具有TNF-a的抗體(細(xì)胞毒性Ab)的孔的吸收。主要附圖標(biāo)記說(shuō)明101異源區(qū)；103~支架區(qū)201~OKT3、528或erb的scFv203、303、403、1503、1603、1703、1903IgG鉸鏈區(qū)205、305人類(lèi)XXI型迷你膠原蛋白301、1707~OKT3—scFv(抗CD3)307~528—scFv401~scFv405-膠原蛋白支架區(qū)407~XXI型月交原蛋白的NC1區(qū)409、1301N端二硫群411、1305、1505、1605、1705、1905~二硫群413scFvl415~scFv2417、1907~焚光酶1303、1403、1507、1709、1909-(GPP)1307、1401~erb一scFv1501、1601、1701~763—scFv(抗EGFR)1607~(GPP)5GKPGKP(GPP)61901~h4D5—scFv(抗HER2/neu)發(fā)明詳述本發(fā)明根據(jù)(至少一部份根據(jù))一個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)而來(lái)——當(dāng)抗體區(qū)讀框(in-frame)融合至膠原蛋白支架區(qū)時(shí)，支架區(qū)的三聚體化可催生三聚體抗體。此抗體的結(jié)合親合力，與二價(jià)IgG及單價(jià)scFv相比，要來(lái)得優(yōu)異。根椐本發(fā)明而制造出的三聚體抗體對(duì)其配體的親合力可大于109m"。在一實(shí)施例中，融合多肽(fiisionpolypeptide)中的膠原蛋白支架區(qū)，可以讀框融合的方式結(jié)合至結(jié)合蛋白(bindingprotein),其中該膠原蛋白支架區(qū)具有驅(qū)動(dòng)融合多肽形成三聚體化的能力。上述融合多肽經(jīng)三聚體化后，仍保有結(jié)合至其配體的能力。結(jié)合區(qū)可為，例如細(xì)胞因子(cytokine)區(qū)、細(xì)胞因子受體區(qū)或抗體區(qū)。在一實(shí)施例中，細(xì)胞因子為T(mén)NF-a。在一實(shí)施例中，可將膠原蛋白支架區(qū)讀框融合至抗體區(qū)，以產(chǎn)生三聚體抗體。在一優(yōu)選實(shí)施例中，上述三聚體抗體為可溶抗體?？扇芸贵w在生理環(huán)境下為可溶。在一優(yōu)選實(shí)施例中，上述可溶三聚體抗體為分泌抗體。分泌抗體是由細(xì)胞所分泌。由于包含抗體區(qū)的多肽上具有信號(hào)序列(signalsequence),可將抗體的分泌作為目標(biāo)。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于107m-'。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于108m"。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于109m"。在某些實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力是1()7M"至101qm"、1()7m"至1()9]Vr1、1()7m"至108m"、108m-1_E1010m-i、1。8m"至109m-1,以及1()9m"至10101^1。在一實(shí)施例中，藉由在具有充足脯氨酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase,P4H)活性的系統(tǒng)中表達(dá)融合構(gòu)建體(flisionconstruct),以熱穩(wěn)定短膠原蛋白樣肽，例如(Gly-Pro-Pro)作為支架區(qū)，來(lái)驅(qū)使抗體的三聚體化。19此方法促使穩(wěn)定的三重螺旋結(jié)構(gòu)的采用，其在體內(nèi)影響蛋白質(zhì)價(jià)數(shù)(valency)、穩(wěn)定性與功能。本發(fā)明包含使用膠原蛋白序列，例如迷你膠原蛋白XII或XXI型，或膠原蛋白樣序列，例如(Gly-Pro-Pro;ho或(GPP)5GKPGKP(GPP)6做為膠原蛋白支架區(qū)，具有不論從C端或N端方向?qū)愒慈诤系鞍鬃陨沓珊?self-nucleation)與自身延展(self-propagation)的能力。本發(fā)明不需任何其它三聚體化結(jié)構(gòu)區(qū)。藉由在包含脯氨酸-4-羥化酶的系統(tǒng)中表達(dá)融合構(gòu)建體，膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白形成熱穩(wěn)定三重螺旋結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明的自身三聚體化膠原蛋白支架允許在任一末端或是同時(shí)兩個(gè)末端附加融合配偶體(ftisionpartners)。這具有重要的結(jié)果，如可使用自身三聚體化膠原蛋白支架來(lái)構(gòu)建可同時(shí)與兩個(gè)龐大的結(jié)合配偶體互相作用(各末端具有至多3或6的結(jié)合價(jià))的分子。本發(fā)明也證明三聚體化抗體正確折疊且顯示出高溶解度、親合力與穩(wěn)定性。此處使用的"膠原蛋白支架區(qū)"為膠原蛋白或膠原蛋白樣區(qū)，其允許藉由其本身形成三重螺旋結(jié)構(gòu)，其中"三重螺旋結(jié)構(gòu)"為三個(gè)亞單位共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物。此處使用的"膠原蛋白支架區(qū)"指膠原蛋白或膠原蛋白樣區(qū)其驅(qū)動(dòng)支架區(qū)的自身三聚體化。此處使用的"膠原蛋白支架區(qū)"并非指原膠原蛋白(procollagen)的C-前肽(propeptide)、膠原凝集素(collectin)或纖維膠凝蛋白家族蛋白質(zhì)(ficolinfamilyprotein)的巻曲螺旋頸區(qū)(coiled匿coilneckdomain)、|3-半乳糖苷酶((3-galactosidase)三聚體化區(qū)、GCN4亮氨酸拉鏈(leucinezipper)突變體的三個(gè)巻曲螺旋的螺旋結(jié)構(gòu)(Harburyetal.,(1993)Science262:1401-1407)、Clq與TNF超級(jí)家族蛋白質(zhì)的Clq與TNF區(qū)與噬菌體T4fibritin折疊區(qū)。"膠原蛋白支架抗體(collagenscaffoldantibody)"或"CSA"是這樣一種抗體，其包括膠原蛋白區(qū)，其融合至抗體區(qū)。膠原蛋白支架抗體與其編碼序列可包括下述序列的任何結(jié)合。上述各結(jié)合經(jīng)過(guò)特別地考慮。例如，膠原蛋白支架抗體可包括SEQIDNO:1、3、5與9中的一個(gè)或多個(gè)。因此，在一方面本發(fā)明的特征為分離的重組蛋白復(fù)合物，其包括第一融合多肽鏈，包括第一膠原蛋白支架區(qū)與第一抗體區(qū)讀框(in-frame)融合至該第一膠原蛋白支架區(qū)的一端；第二融合多肽鏈，包括第二膠原蛋白支架區(qū)；以及第三融合多肽鏈，包括第三膠原蛋白支架區(qū)。上述第一、第二與第三膠原蛋白支架域互相排列以形成三重螺旋線(xiàn)圈。并且上述第一膠原蛋白支架區(qū)與第一抗體區(qū)被讀框融合且在相同的肽鏈上。融合多肽鏈可包括酶區(qū)或熒光蛋白質(zhì)。熒光蛋白質(zhì)的例子可包括綠色熒光蛋白質(zhì)(greenfluorescentprotein,GFP)、珊瑚紅熒光蛋白(dsRed)與其變體。酶區(qū)的例子包括谷氨基硫轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase)、熒光素酶(luciferase)、卩-半乳糖香酶與|3-內(nèi)酰胺酶(卩-lactamase)。為了檢測(cè)或純化本發(fā)明的融合蛋白，融合多肽鏈可包括或不包括親合標(biāo)記(affinitytag)。親合標(biāo)記的例子包括多組氨酸-標(biāo)記(polyhistidine-tag)、myc-才示"i己、Strep-才示"i己、FLAG、E-沖示i己、血3求凝集素才示i己(hemagglutintag)、T7、S-標(biāo)記、HSV、VSV-G、抗-Xpress(anti-Xpress)與VS-標(biāo)記。"抗體區(qū)，，包括一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白(immunoglobulin)的互補(bǔ)決定區(qū)(complementary-determiningregion)。因jt匕,4元體區(qū)可包^^元體的4元原結(jié)合邵分，例如VH與Fab。在一實(shí)施例中，第一抗體區(qū)包括抗原結(jié)合片段或單鏈抗體的序列，抗原結(jié)合片段或單鏈抗體對(duì)例如串命名法3(ClusterDesignation3,CD3)、上皮生長(zhǎng)因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)、HER2/neu或肺瘤壞死因子-a(Tumornecrosisfactor-a，TNF-a)有特異性。第一多肽鏈可更包括第二抗體區(qū)讀框融合至第一支架區(qū)的另一端。在一實(shí)施例中，第二融合多肽鏈包括第二抗體區(qū)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，第一與第二抗體區(qū)彼此相同。第一與第二抗體結(jié)合區(qū)可結(jié)合至相同的結(jié)合配偶體或結(jié)合至兩個(gè)不同的結(jié)合配偶體。例如，第一抗體區(qū)與第二抗體區(qū)可包括第一單鏈抗體與第二單鏈抗體的序列，其中第一單鏈抗體與第二單鏈抗體可分別與CD3與EGFR結(jié)合。在一實(shí)施例中，第一與第二融合多肽皆包含上述第一與第二抗體的結(jié)合區(qū)。第二融合多肽鏈可包括第三抗體區(qū)讀框融合至第二支架區(qū)的一端、第四抗體區(qū)讀框融合至第二支架區(qū)的另一端或兩抗體區(qū)讀框融合至第二支架區(qū)的兩端。相似地，第三融合多肽鏈可包括第五抗體區(qū)讀框融合至第二支架區(qū)的一端、第六抗體區(qū)讀框融合至第二支架區(qū)的另一端或兩抗體區(qū)讀框融合至第二支架區(qū)的兩端。因此其可與一、二、三、四、五或六個(gè)結(jié)合配偶體結(jié)合。換言之，蛋白質(zhì)復(fù)合物可為單、雙、三、四、五或六價(jià)。第一、第二與第三支架區(qū)形成三重螺旋，所知如膠原蛋白或膠原蛋白樣區(qū)，而三支架區(qū)的每個(gè)包括一個(gè)或多個(gè)三重螺旋重復(fù)序列，各重復(fù)序列包括(G-X-Y)n序列，其中G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸，優(yōu)選為脯氨酸或羥脯氨酸，而且n大于等于5。此處所使用的"重復(fù)"指兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)的G-X-Y序列。膠原蛋白支架區(qū)并非一定由連續(xù)的完美G-X-Y重復(fù)序列所構(gòu)成。試舉許多天然膠原蛋白或包含膠原蛋白樣的蛋白質(zhì)為例，常見(jiàn)兩個(gè)G-X-Y重復(fù)序列之間摻插少了第一個(gè)G或第三個(gè)Y的序列片段(亦即G-X-Y-X-Y陽(yáng)G-X-Y或G陽(yáng)X-Y-G-X-G-X-Y)。本發(fā)明中由人類(lèi)第XXI型迷你膠原蛋白所構(gòu)成的膠原蛋白支架區(qū)，即包含兩個(gè)不完美的序列片段GF與KE。在某些實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)為包含至少8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)或20個(gè)G-X-Y重復(fù)序列的膠原蛋白支架，其中G為甘氨酸，X與Y可為任何氨基酸。在某些實(shí)施例中，至少5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在某些實(shí)施例中，至少5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或IO個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-O,其中P為脯氨酸，O為羥脯氨酸。膠原蛋白支架區(qū)可驅(qū)動(dòng)自身三聚體化的形成。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)包括(G-P-P/0)k)的序列。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)包括10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在某些實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)包括少于IO、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、45或50個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在某些實(shí)施例中，膠原蛋白支架的長(zhǎng)度短于150、125、100、90、80、70、60、50或40個(gè)氨基酸。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架含有可驅(qū)動(dòng)自身形成三聚體化的10-30個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，多于1/3的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，多于1/2的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，多于2/3的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，多于3/4的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，所有的G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。在一實(shí)施例中，支架區(qū)包括(G-P-P/0)sGKPGKP(G-P-P/0)6的序列。在一實(shí)施例中，支架區(qū)包括(G-P-P/0)h),其中P/0指在Y位置的氨基酸為P或O。在一優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白支架包括至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，其中至少5、6、7、8、9或10個(gè)Y為羥脯氨酸。此膠原蛋白支架可驅(qū)動(dòng)驅(qū)動(dòng)自身三聚體化的形成。在一優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白支架包括至少5、6、7、8、9或10個(gè)G-P-O重復(fù)序列與抗體區(qū)，其中該膠原蛋白支架的三條多肽可交互作用而形成三聚體可溶抗體，此三聚體可溶抗體以至少10lVr1的親合力，特異性結(jié)合至配體。在一優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白支架含有6或7個(gè)G-P-O重復(fù)序列，且此些G-P-O重復(fù)序列彼此的間可緊鄰或不緊鄰。例如，G-P-P重復(fù)序列可被分開(kāi)成兩個(gè)讀框氨基酸序列，其包括藉由1、2、3、4或5個(gè)G-X-Y重復(fù)序列來(lái)分離的3、4或5個(gè)G-P-O重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架包括(G-P-0)3GXY(G-P-0)4。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架為非纖維狀具有中斷的三重螺旋的原纖維伴隨性股原蛋白(fibril-associatedcollagenwithinterruptedtriple-helices,以下稱(chēng)FACIT)的膠原蛋白(COLl)區(qū)。在優(yōu)選的情況下，三聚體抗體含有FACIT的COL1區(qū)，但不含非膠原蛋白(noncollagenous,NCl)區(qū)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，COLl可源自第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白。在一優(yōu)選實(shí)施例中，三聚體抗體包括SEQIDNO:7。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架至少與源自第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白的COL1區(qū)具有75%、80%、85%、90%或95%的相同度。在一實(shí)施例中，膠原蛋白支架至少與從第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白而來(lái)的COL1區(qū)的G-X-Y重復(fù)序列具有75%、80%、85%、90%或95%的同一性。在一優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)至少與源自第IX、XII、XIV、XVI、XIX、XX、XXI或XXII型膠原蛋白的COL1區(qū)的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或30個(gè)G-X-Y重復(fù)序列具有75%、80%、85%、90%或95%的同一性。在一特別優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白支架至少與源自第XXII型膠原蛋白的COL1區(qū)的10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列具有75%、80%、85%、90%或95%的同一性。在一優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)的G-X-Y重復(fù)序列，包括至少5、6、7、8、9或10個(gè)Y位置被羥脯氨酸化的G-X-Y重復(fù)序列。上述的序列同一性，可藉由得自威斯康星州大學(xué)遺傳計(jì)算機(jī)小組(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup,UWGCG)的GAP計(jì)算機(jī)程序(版本6.0,Devereux等人發(fā)表于Nucl.AcidsRes.12:387,1984)來(lái)判定。GAP計(jì)算機(jī)程序利用經(jīng)由Smith與Waterman(Adv.Appl.Math2:482,1981)所修訂23的Needleman與Wunsch的比對(duì)方法(J.Mol.Biol.48:443,1970)。GAP程序的預(yù)定參數(shù)包括(l)對(duì)于核苷酸的比較矩陣(包括對(duì)于相同位置為1的值與對(duì)于不同/f立置為0的〈直)與經(jīng)Schwartz與Dayhoff，eds(AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358,1979)所敘述的Gribskov與Burgess的力口斗又t匕4交頭巨卩車(chē)(weightedcomparisonmatrix)(Nucl.AcidsRes.14:6745,1986);(2)每個(gè)缺口罰分3.0且各缺口延伸罰分0.10;與(3)末端缺口不罰分。在一實(shí)施例中，上述的第一、第二與第三融合多肽本質(zhì)上是相同的，彼此具有至少75%(即任何介于75%與100%之間的數(shù)字，包括75%與100%)的序列同一性。由三個(gè)相同的融合多肽形成的復(fù)合物為同源三聚體(homotrimer)。三個(gè)融合多肽可為功能性等同的多肽。"功能性等同，，指一個(gè)共同多肽的多肽衍生物，即一個(gè)蛋白質(zhì)具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變、插入、缺失、截?cái)?、融合蛋白質(zhì)或上述的組合，且其實(shí)質(zhì)上維持形成三重螺旋的能力與異源區(qū)的親合力，例如與配體結(jié)合。異源多肽、核酸或基因?yàn)槎嚯?、核酸或基因其與其它多肽、核酸或基因連結(jié)，且其并非自然連結(jié)。兩個(gè)融合區(qū)或序列若在天然存在的蛋白質(zhì)或核酸中并非為鄰接，則彼此為異源。本發(fā)明也包括分離(isolated)的重組融合多肽(即單條融合多肽)，其包括(i)用以形成三重螺旋之一的膠原蛋白支架區(qū)；與(ii)讀框融合至膠原蛋白區(qū)其中一端之一的第一異源區(qū)，或讀框融合至膠原蛋白區(qū)另一端之一的第二異源區(qū)。異源區(qū)可為前述提及的具有抗體-抗原結(jié)合特性的任何形式之一，且此異源區(qū)可藉由各種為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得，例如噬菌體展示篩選(phagedisplayscreening)。分離的多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物意指該多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物實(shí)質(zhì)上由天然相關(guān)的分子分離，即由干重計(jì)算具有至少75%的純度(任何介于75%與100%之間的數(shù)字，包括75%與100%)。純度可藉由任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量，例如藉由柱層析(columnchromatography)、聚丙烯酰胺凝股電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)或高效能液相層析法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析。本發(fā)明的分離的多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物可由天然來(lái)源分離或藉由重組DNA技術(shù)制造。在一優(yōu)選實(shí)施例中，用以形成三聚體抗體的三條多肽為非連續(xù)的(non-contiguous)。在另一實(shí)施例中，這三條多肽為連續(xù)的，即翻i奪成一個(gè)單一的翻譯產(chǎn)物。在本實(shí)施例中，三條多肽之間可藉由兩個(gè)或多個(gè)彈性鉸鏈區(qū)(flexiblehingeregions)而予以連結(jié)。本發(fā)明還涉及分離的核酸，所述分離的核酸包括編碼前段所述的融合多肽的序列或該序列的互補(bǔ)序列。核酸指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)或者DNA或RNA類(lèi)似物。DNA或RNA類(lèi)似物可由核苷酸類(lèi)似物合成。這種核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈DNA。"分離的核酸"是其結(jié)構(gòu)不與任何天然存在的核酸或任何天然存在的基因組核酸片段相同的核酸。因此該用語(yǔ)包含，例如(a)DNA,其具有天然存在的基因組DNA分子的一部分序列，但不與在生物體的基因組中天然存在于其兩側(cè)的編碼序列鄰接；(b)將核酸在某種程度上并入載體(vector)或原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的基因組中，由此所形成的分子不與任何天然存在的載體或基因組DNA相同；(c)分離的分子，例如cDNA、基因組片段、藉由聚合酶連鎖反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)所產(chǎn)生的片段或限制片段(restrictionfragment);與(d)重組核苷酸序列，其為雜交基因(即編碼融合蛋白的基因)的一部份。上述核酸可用來(lái)表達(dá)本發(fā)明的多肽。為達(dá)此目的，可將上述核酸連接至適合的調(diào)控序列以產(chǎn)生表達(dá)載體。載體指是一種核酸分子，其具有轉(zhuǎn)移另一核酸至其連接處的能力。載體具有自主性復(fù)制(autonomousreplication)或插入至宿主DNA的能力。載體的例子包括質(zhì)粒(plasimd)、粘粒(cosmid)或病毒載體(viralvector)。本發(fā)明的載體包括核酸，其處在適合于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式。優(yōu)選地載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，其與被表達(dá)核酸序列連接。"調(diào)控序列"包括啟動(dòng)子(promoter)、增強(qiáng)子(enhancer)和其它表達(dá)控制元件(例如力。A信號(hào)(polyadenylationsignal))。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列的基本表達(dá)與組織特異性調(diào)控和/或可誘導(dǎo)的序列。表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可依據(jù)下列因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、需要的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等?？梢氡磉_(dá)載體至宿主細(xì)胞以制造本發(fā)明的多肽。包括上述核酸的宿主細(xì)胞也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)例包括大腸桿菌co/z')細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如使用果蠅CDmso//zz7a)S2細(xì)胞或桿狀病毒(baculovirus)細(xì)胞)、酵母細(xì)胞或哺乳類(lèi)細(xì)胞(例如小鼠骨髓瘤(myeloma)確細(xì)胞)。請(qǐng)參閱，例如Goeddel，(1990)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA.。為了制造本發(fā)明的融合多肽，在準(zhǔn)許多肽表達(dá)的情況下將宿主細(xì)胞于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中上述多肽是藉由本發(fā)明核酸所編碼的多肽，以及從培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化上述多肽?；蛘?，可于體外轉(zhuǎn)錄與翻譯本發(fā)明的核酸，例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列與T7聚合酶。為了制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物，可于準(zhǔn)許多肽表達(dá)與三重螺旋線(xiàn)圈形成的情況下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞包括第一、第二與第三核酸，其分別編碼出上述第一、第二與第三融合多肽，其中上述多肽是藉由所述三個(gè)核酸所編碼，以及從培養(yǎng)的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化上述蛋白質(zhì)復(fù)合物。而優(yōu)選的是上述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞(eukaryoticcell),其包括使脯氨酸殘基羥基化(hydroxylate)的酶活性。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)在附圖與以下的敘述中提出。本發(fā)明的其它特征、目的與優(yōu)點(diǎn)將可從本發(fā)明的敘述、附圖與權(quán)利要求書(shū)中顯示。本發(fā)明的可溶三聚體抗體相較于一般抗體有許多優(yōu)點(diǎn)。一方面而言，當(dāng)上述六個(gè)區(qū)域的兩個(gè)或多個(gè)彼此相同時(shí)，蛋白質(zhì)復(fù)合物可具有2-6個(gè)對(duì)結(jié)合配偶提(例如抗原)具有特異性的結(jié)合區(qū)域，與之相比，一般抗體只具有兩個(gè)這種區(qū)域。換句話(huà)說(shuō)，不像一般抗體對(duì)于抗原只具二價(jià)，這種蛋白質(zhì)復(fù)合物可以是雙、三、四、五或六價(jià)。因而，可將其制造為具有各種親合力，且親合力高于一般抗體。因?yàn)榫哂休^高的親合力，所以比起一般抗體而言，達(dá)成期望的目標(biāo)需要的蛋白質(zhì)復(fù)合物的量較少且反應(yīng)時(shí)間較短。所述期望的目標(biāo)例如療效(therapeuticeffects),由此降低治療成本和縮小副作用(例如，非期望的免疫反應(yīng))。在另一方面，當(dāng)上述六個(gè)區(qū)域的兩個(gè)或多個(gè)互不相同時(shí)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以具有2-6個(gè)結(jié)合區(qū)域，這些結(jié)合區(qū)域?qū)?-6個(gè)不同的結(jié)合配偶體具有特異性。聯(lián)合不同特異性的結(jié)合配偶體位成為一個(gè)單元，使其具有將多種結(jié)合配偶體集合在一起的能力，并因此具有令人滿(mǎn)意的使用于治療、組織重建(tissuereconstruction)和在纟內(nèi)米層；欠活'l"生蛋白質(zhì)片幾才成(activeproteinmachinery)(例如一多亞單位酶)的集合。為了在人類(lèi)體內(nèi)使用，本發(fā)明的三聚體抗體優(yōu)選為人源(humanorigin)。例如，其可包括人源化單鏈抗體序列，該序列讀框融合至人源的膠原蛋白支架。由于許多具有膠原蛋白區(qū)的膠原蛋白樣蛋白在血液中相當(dāng)穩(wěn)定，支架區(qū)融合蛋白同樣也應(yīng)該能夠在血液中保持結(jié)構(gòu)完整。序列Gly-Pro-Hyp對(duì)于形成和穩(wěn)定三重螺旋結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)良多，且Gly-Pro-Hyp三肽重復(fù)序列可自身配裝(self-assemble)成高穩(wěn)定性的三重螺旋結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明以呈熱穩(wěn)定的短鏈膠原蛋白樣肽(Gly-Pro-Pro)K)，取代迷你膠原蛋白第XXI型的膠原蛋白區(qū)，由此作為此處敘述的膠原蛋白支架抗體的支架模版。上述的穩(wěn)定三重螺旋結(jié)構(gòu)，可透過(guò)具有充足脯氨酸-4-羥化酶(prolyl-4-hydroxylase,P4H)活性的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)所取4尋。的確，4艮據(jù)這才羊的方式，erb—scFv-Col與OKT3—scFv-Col皆可^皮配裝成為三聚體的結(jié)構(gòu)，且erb一scFv-Col可能藉由在兩個(gè)三聚體中的兩個(gè)C端半胱氨酸殘基的鏈內(nèi)二硫鍵交聯(lián)(interchaindisulfidecrosslinking),更進(jìn)一步聚合(oligomerized)成為六聚體。將erb_scFv-Col從三聚體變?yōu)榱垠w的過(guò)程為細(xì)胞內(nèi)步驟，由于在濃度超過(guò)一般存在的erb一scFv-Col六聚體形式時(shí)，濃度減低的三聚體結(jié)構(gòu)并不會(huì)配裝成較高階的結(jié)構(gòu)。小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0細(xì)胞對(duì)于重組的膠原蛋白或膠原蛋白樣蛋白質(zhì)的制備是一個(gè)良好的表達(dá)系統(tǒng)。在重組erb_scFv-Col中，在膠原蛋白GXY三個(gè)為一組的(Gly-Pro-Pro)!。序列的Y位置中的脯氨酸總數(shù)的近61%為被羥基化。因此在此系統(tǒng)中，至少6個(gè)Gly-Pro-Pro重復(fù)序列被羥基化。丙烷基羥基化的(Gly-Pro-Pro),o對(duì)于膠原蛋白支架抗體分子的三聚體化配裝的貢獻(xiàn)顯著，因?yàn)榻逵蒞estern印跡(Westemblot)分析，幾乎沒(méi)有單體形式的膠原蛋白支架抗體存在于培養(yǎng)基中。從圖6B與14B所顯示的消失的單體水平來(lái)判斷，在經(jīng)純化的膠原蛋白支架抗體樣本中，2M的尿素于高至45。C的溫度下，于加入2%SDS加樣緩沖溶液(loadingbuffer)后，對(duì)于分離膠原蛋白支架抗體的三聚體形式而言并不夠強(qiáng)。在血清穩(wěn)定性測(cè)定中，將各種erb抗體形式在37。C培養(yǎng)于人類(lèi)血清中達(dá)7天后，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),相對(duì)于二價(jià)erb—scFv-Fv的亞樣i摩爾濃度(sub-micromolar)與單1"介erb—scFv的孩i:摩爾濃度(micromolar)，erb_scFv-Col的抗體濃度為在納摩爾濃度(nanomolar)nM范圍。因此，膠原蛋白支架抗體在生理環(huán)境下可保持其多價(jià)標(biāo)的結(jié)合形式。膠原蛋白支架抗體的熱穩(wěn)定三聚體結(jié)構(gòu)符合未來(lái)在體內(nèi)使用的多目的多聚體化系統(tǒng)(multi-purposemultimerizingsystem)。許多具有膠原蛋白區(qū)的膠原蛋白樣蛋白質(zhì)表達(dá)于人類(lèi)血清中，并且在保護(hù)人體免遭感染性生物體的過(guò)程中扮演先天免疫系統(tǒng)的作用。這些蛋白包括補(bǔ)體蛋白Clq、凝集素家族、膠27凝素家族蛋白質(zhì)-甘露糖結(jié)合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)、纖維膠凝蛋白(ficolin)、表面活性蛋白質(zhì)(surfactantprotein)A與D(SP-A與SP-D)。而這些"防御膠原蛋白"共同的結(jié)構(gòu)特征為多蛋白質(zhì)單位，具有在C端的目標(biāo)結(jié)合區(qū)。形成這些多三聚體化結(jié)構(gòu)的驅(qū)動(dòng)力與形成纖維狀膠原蛋白的驅(qū)動(dòng)力相似。首先以三多肽鏈的巻曲螺旋頸區(qū)將此三多肽鏈三聚體化，巻曲螺旋頸區(qū)為緊鄰著目標(biāo)結(jié)合區(qū)的N端，在最后以此三多肽鏈的N端半胱氨酸殘基堆?；蜴渻?nèi)二硫鍵交聯(lián)三聚體分子前，從C到N端以一種類(lèi)似于拉鏈的方式(zipper-likefashion)將巻曲螺旋頸區(qū)進(jìn)行三重螺旋折疊(Hakanssonetal.，(1999)Structure7:255-264;HakanssonandReid，(2000)ProteinSci9:1607-1617;Sheriffetal.,(1994)NatStructBiol1:789-794;WeisandDrickamer,(1994)Structure2:1227-1240)。因此多聚體化顯著增加這些防御膠原蛋白的結(jié)合區(qū)的功能性親合力。當(dāng)藉由表面等離振子共振(surfaceplasmonresonance,SPR)和竟?fàn)幜魇郊?xì)胞儀(competitionflowcytometry)來(lái)分析比較各種erb和OKT3抗體時(shí)，目標(biāo)結(jié)合親合力的改變顯得顯著。結(jié)合親合力的數(shù)據(jù)證明，當(dāng)膠原蛋白支架抗體分子的價(jià)數(shù)增加時(shí)，會(huì)增進(jìn)抗體與目標(biāo)之間的標(biāo)靶(targeting)強(qiáng)度與特異性。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，三價(jià)OKT3膠原蛋白支架抗體的免疫抑制T細(xì)胞活化的有效劑量小于OKT3IgG。在人類(lèi)外周血單核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中OKT3—scFv-Col不會(huì)誘導(dǎo)T-細(xì)胞增殖或IL-2產(chǎn)生，大量減少OKT3第一劑量癥狀的影響是由于短暫的T細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子(cytokine)釋放。這種新的抗-CD3形式可提供強(qiáng)而有力免疫抑制藥物，其具有減低的劑量、毒性與治療花費(fèi)。藉由具有或不具有結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的CDR嫁接以從鼠科至人源轉(zhuǎn)移CDR的鼠科mAb抗體的人源化通常導(dǎo)致結(jié)合親合力的降低或損失(Queenetal.,(1989)ProcNatlAcadSciUSA86:10029-10033;Riechmannetal.;(1988)Nature332:323-327)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，三聚體可溶抗體不包括Fc區(qū)。藉由使用噬菌體展示scFv文庫(kù)(PhagedisplayscFvlibrary)篩選高親合力結(jié)合物的鏈改組(chain-shuffling)的親合力熟成是一個(gè)冗長(zhǎng)的步驟；然而改善親合力的結(jié)果并不確定。因此，人源化后對(duì)于目標(biāo)抗原的低親合力會(huì)妨礙許多治療性的抗體。在一些例子中，應(yīng)進(jìn)一步推敲抗體的特征。抗原結(jié)合配偶體的多聚體化明顯增加了在非常接近目標(biāo)細(xì)胞時(shí)結(jié)合至特定相同的配體群組的可得性?？商嶙h不同的方法以獲得多價(jià)分子以改善功能性親合力。包括設(shè)計(jì)替代結(jié)合蛋白質(zhì)，其根據(jù)具有免疫球蛋白的支架(HolligerandHudson,(2005)NatBiorechnol23:1126-1136)或根據(jù)完全不同的蛋白質(zhì)拓樸學(xué)(topology)(Binzetal.,(2005)NatBiotechnol23:1257-1268)。例如，已報(bào)導(dǎo)了使用與蛋白質(zhì)AFc結(jié)合區(qū)的Fv片段(ItoandKurosawa,(1993)JBiolChem268:20668-20675)、用以形成四聚合體復(fù)合物的核心鏈霉抗生物素蛋白(core-streptavidin)(Dubeletal.，(1995)JImmunolMethods178:201-209)或轉(zhuǎn)錄因子p53的人類(lèi)四聚體化區(qū)(Rheinneckeretal.,(1996)JImmunol157:2989-2997)。最近已采用非IgG蛋白質(zhì)支架片段，例如"抗運(yùn)載蛋白(anticalin)"(Skerra，(2000)BiochimBiophysActa1482:337-350)、"錨蛋白重復(fù)序歹寸(ankyrinrepeat)"(Binzetal.,(2904)NatBiotechnoil22:575-582)、"親和體(affibody)分子"(Nordetal"(1997)NatBiotechnol15:772-777)與四結(jié)合素(tetranectin)的C型類(lèi)凝集素區(qū)(Christianetal.InternationalPublicationNo.WO98/56906;Graversenetal.,(2000)JBiolChem275:37390-37396)來(lái)增加目標(biāo)結(jié)合親合力、熱穩(wěn)定性與壽文感度。然而這關(guān)，其嚴(yán)重限制了潛在治療性應(yīng)用。用以形成熱穩(wěn)定多價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)合物的三重體形式(triplex-forming)膠原蛋白樣肽融合支架，在此被用于證明膠原蛋白支架抗體為一個(gè)新的平臺(tái)，可改善治療性抗體的功能性親合力與有絲分裂性(mitogenicity)。更重要的是，已證明scFv與膠原蛋白支架抗體中的膠原蛋白樣支架區(qū)的融合使各區(qū)正確折疊，而不損害目標(biāo)結(jié)合的活性或三重螺旋結(jié)構(gòu)的三聚體配裝。此三重體形式的膠原蛋白樣區(qū)，可做為現(xiàn)存的支架或新的蛋白質(zhì)藥物，藉由在融合蛋白質(zhì)接近的情況下，對(duì)以下物質(zhì)進(jìn)行三聚體化(甚或寡聚化(oligomerizing),其中這種寡聚化由膠原蛋白纖維間的堆?；蛉垠w分子間的鏈間二硫鍵交聯(lián)而來(lái))活性蛋白質(zhì)，所述活性蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)激素、細(xì)胞因子、淋巴因子(lymphokine)、生長(zhǎng)因子、凝集素、酶與可溶受體片段；或粘著分子(adhesionmolecule),例如選4奪素(selectin)與整聯(lián)蛋白(integrin)?？山逵芍亟M技術(shù)獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物或多肽?？蓪⒕幋a復(fù)合物的多肽的核酸引入適合的宿主細(xì)胞中，并且在允許表達(dá)藉由上述核酸編碼的多肽并在多肽間形成三重螺旋的條件下來(lái)表達(dá)上述多肽。為了促進(jìn)三重螺旋支架的形成，可在宿主細(xì)胞中共表達(dá)脯氨酸-4-羥化酶，其為在生物合成膠原蛋29白過(guò)程中的關(guān)鍵酶。異源性蛋白質(zhì)區(qū)域可包括"結(jié)合區(qū)"，其包括但不限于抗體或其片段(例如其抗原結(jié)合片段)。在此處所使用"抗體"意指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原結(jié)合部分。其指蛋白質(zhì)包括最少一個(gè)，優(yōu)選為兩個(gè)重(heavy，H)鏈可變區(qū)域(vh),以及至少一個(gè)，優(yōu)選為兩個(gè)輕(light,L)鏈可變區(qū)域(vl)。因此，在此處所使用的"抗體區(qū)"指抗體或抗體的抗原結(jié)合部分，且包括Vh、Vl或Fab區(qū)、單鏈抗體(single-chainantibody,scFv)的Fv片段與VHH區(qū)(參見(jiàn)WO94/4678)?？蓪H與VL區(qū)域更進(jìn)一步細(xì)分為超變區(qū)，稱(chēng)為"互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion)""(CDR)";和散布區(qū)域，其較保守，稱(chēng)為框架區(qū)域(frameworkregion)。已經(jīng)確定了互補(bǔ)決定區(qū)與框架區(qū)域的范圍(參閱Kabatetal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo,91-3242,andChothiaetal.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。每個(gè)VH與Vl—般由三個(gè)CDR與四個(gè)FR(frameworkregion)組成，從氨基端到羧基端排列的順序?yàn)镕R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4?？贵w可進(jìn)一步包括重鏈和輕鏈恒定區(qū)域(constantregion),由此分別形成重鏈和輕鏈免疫球蛋白鏈。重鏈恒定區(qū)域包括三個(gè)區(qū)域，CH1、Ch2與CH3。輕鏈恒定區(qū)域包括一個(gè)區(qū)域，重鏈和輕鏈的可變區(qū)域包括結(jié)合區(qū)域，其與抗原反應(yīng)?？贵w的恒定區(qū)域通常協(xié)調(diào)抗體結(jié)合至宿主組織或因子，所述因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞(effectorcell))和典型補(bǔ)體系統(tǒng)的第一補(bǔ)體Clq。此處使用的"免疫球蛋白"指一種蛋白質(zhì)，其包括一個(gè)或多個(gè)肽，其本質(zhì)上是由免疫球蛋白基因所編碼。經(jīng)認(rèn)可的人類(lèi)免疫球蛋白基因包括k、x、a(IgAl和IgA2)、y(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、S和p恒定區(qū)域基因和無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)域基因。全長(zhǎng)免疫球蛋白"輕鏈"(約25KDa或214個(gè)氨基酸)在NH2端(約110個(gè)氨基酸)藉由可變區(qū)域基因所編碼，并在COOH端藉由k或人恒定區(qū)域基因所編碼。而全長(zhǎng)免疫球蛋白"重鏈"(約50KDa或446個(gè)氨基酸)相似地藉由可變區(qū)域基因(約116個(gè)氨基酸)，和其它上述的恒定區(qū)域基因，例如y(編碼出約330個(gè)氨基酸)所編碼?？贵w(或"抗體部分"或"片段")的"抗原結(jié)合片段"指全長(zhǎng)抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，其保留特異性結(jié)合至其配體或抗原(例如EGFR或CD3多肽或其片段)的能力。抗體的抗原結(jié)合片段的例子包括，但不限于(i)Fab片段，其是一種單價(jià)片段，包括Vl、Vh、Cl和Cw區(qū)域；(ii)F(ab，)2片段，其是一種二價(jià)片段，包括藉由二硫鍵橋在其鉸鏈區(qū)域(hingeregion)連結(jié)的兩個(gè)Fab片段；(iii)Fd片段，其包括Vh和Chi區(qū)域；(iv)Fv片段，其包括抗體單股的Vl和Vh區(qū)域；(v)dAb片段(Wardetal.,(1989)Nature341:544-546)，其包括VH區(qū)域；(vi)分離的CDR以及(vii)Vt或Vh區(qū)域。更進(jìn)一步，雖然Fv片段的兩個(gè)區(qū)域Vl和VH是由分開(kāi)的基因所編碼，但使用重組方法可將它們連接，藉由人造接頭可將它們制成一個(gè)單鏈蛋白質(zhì)，其中Vl和VH區(qū)域配對(duì)形成一個(gè)單價(jià)分子(已知如單鏈Fv(scFv),參閱，例如Birdetal.(1988)Science242:423-426;andHustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包含在抗體的"抗原結(jié)合片段"。這些抗體片段可藉由本
技術(shù)領(lǐng)域：
常見(jiàn)的技術(shù)獲得，并以與完整抗體相同的方式來(lái)篩選應(yīng)用。抗體可以是單克隆抗體。在一實(shí)施例中，抗體可以以重組方法制備，例如藉由噬菌體展示或組合方法(combinatorialmethod)來(lái)制造。以噬菌體展示和組合方法產(chǎn)生抗體為本寺支術(shù)領(lǐng)域所熟知(參閱，例如Ladneretal.美國(guó)專(zhuān)利No.5,223,409;Kangetal.InternationalPublicationNo.WO92/18619;Doweretal.InternationalPublicationNo.WO91/17271;Winteretal.InternationalPublicationWO92/20791;Marklandetal.InternationalPublicationNo,WO92/15679;Breitlingetal.InternationalPublicationWO93/01288;McCaffertyetal.InternationalPublicationNo.WO92/01047;Garrardetal.InternationalPublicationNo.WO92/09690;Ladneretal.InternationalPublicationNo.WO90/02809;Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;Griffthsetal,(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMolBiol226:889-896;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580;Garradetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)NucAcidRes19:4133-4137;和Barbasetal.(1991)PNAS88:7978-7982)。在一實(shí)施例中，抗體為完全人類(lèi)抗體(例如，在經(jīng)遺傳工程改造的小鼠中制備的源自人類(lèi)免疫球蛋白序列的抗體)或非人類(lèi)抗體，例如嚙齒類(lèi)動(dòng)物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如猴子)、駱駝抗體。非人類(lèi)抗體優(yōu)選為嚙齒類(lèi)動(dòng)物(小鼠或大鼠抗體)抗體。制備嚙齒類(lèi)動(dòng)物抗體的方法已為本
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知?？梢越逵墒褂眠z傳工程^、鼠執(zhí)行人類(lèi)基因來(lái)制造人類(lèi)單克隆抗體，而不是使用小鼠的系統(tǒng)。使用經(jīng)過(guò)感興趣的抗原免疫的遺傳工程的小鼠脾細(xì)胞(splenocytes)來(lái)制備雜交瘤(hybridoma)，其分泌對(duì)人類(lèi)蛋白質(zhì)的抗原決定位(epitope)具有特異性親合力的mAbs(參閱，例如Woodetal.InternationalApplicationWO91/00906，Kucherlapatietal.PCTpublicationWO91/10741;Lonbergetal.InternationalApplicationWO92/03918;Kayetal.InternationalApplication92/03917;Lonberg,N.etal.1994Nature368:856-859;Green,L丄.etal.1994NatureGenet.7:13-21;Morrisonetal.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855;Bruggemanetal,1993YearImmunol7:33-40;Tuaillonetal.1993PNAS90:3720-3724;Bruggemanetal.1991EurJImmunol21:1323-1326)。抗體的可變區(qū)域或其部份，例如CDR，可在非人類(lèi)物種(例如，大鼠或小鼠)中產(chǎn)生?？墒褂们逗?、CDR移植和人源化抗體。本發(fā)明中對(duì)于在非人類(lèi)物種(例如，大鼠或小鼠)中產(chǎn)生的抗體進(jìn)行修飾(例如在可變框架(variableframework)或恒定區(qū)域)，以降低在人體內(nèi)的抗原性(antigenicity)。可藉由本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的基因重組DNA技術(shù)來(lái)制備嵌合抗體(chimericantibody)。例如這樣一種基因，其編碼鼠科動(dòng)物(或其它物種)單克隆抗體分子的Fc恒定區(qū)域，以限制酶將其編碼鼠科動(dòng)物Fc的區(qū)域移除，然后在相同位置以編碼人類(lèi)Fc恒定區(qū)域的基因取代(見(jiàn)，Robinsonetal.，InternationalPatentPublicationPCT/US86/02269;Akira,etal.，EuropeanPatentApplication184,187;Taniguchi,M.,EuropeanPatentApplication171,496;Morrisonetal.，EuropeanPatentApplication173,494;Neubergeretal.，InternationalApplicationWO86/01533;Cabillyetal.美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567;Cabillyetal.,EuropeanPatentApplication125,023;Betteretal.(1988Science240:1041-1043);Liuetal.(1987)PNAS84:3439-3443;Liuetal"1987,J.Immunol.139:3521-3526;Sunetal.(1987)PNAS84:214-218;Nishimuraetal.,1987,Cane,Res.47:999-1005;Woodetal.etal(1985)Nature314:446-449;和Shawetal.,1988,J.NatlCancerInst.80:1553-1559)。人源化或CDR移植抗體具有至少一個(gè)或兩個(gè)但一般為全部三個(gè)受體(recipient)CDR(免疫球蛋白重鏈或輕鏈)被以供體CDR取代。抗體可由至少一部份的非人類(lèi)CDR取代或只有CDR中的一些由非人類(lèi)的CDR取代。只需為嚙齒類(lèi)動(dòng)物抗體，例如大鼠或小鼠抗體，并且受體為人類(lèi)框架(framework)或人類(lèi)共有框架(consensusframework),—般而言，提供CDR的免疫球蛋白稱(chēng)為"供體"而提供框架的免疫球蛋白稱(chēng)為"受體(acceptor)"。在一實(shí)施例中，供體免疫球蛋白是非人類(lèi)(例如大鼠)免疫球蛋白。受體框架是天然存在(例如人類(lèi))或共有框架，或依序列約85%或更高，優(yōu)選為90%、95%、99%或更高相同程度。此處所使用的"共有序列(consensuss叫uence)"指這樣一種序列，其從相關(guān)序列的家族中最常存在的氨基酸(或核苷酸)形成(參閱，例如Winnaker,FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987)。在蛋白質(zhì)家族中，在共有序列+的每個(gè)位置，由此家族中在那個(gè)位置最常存在的氨基酸所占據(jù)。若兩個(gè)氨基酸發(fā)生的頻率相同，兩者中的任一個(gè)皆可包含于共有序列。"共有框架"指框架區(qū)域在共有免疫球蛋白序列之中。可藉由本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法將抗體進(jìn)行人源化。藉由取代Fv可變區(qū)域的序列可產(chǎn)生人源化抗體，其中Fv可變區(qū)域不直接包含于抗原與人類(lèi)Fv可變區(qū)域的相同序列結(jié)合的作用中。對(duì)于產(chǎn)生人源化抗體的方法由Morrison,S.L.，1985，Science229:1202-1207、Oietal.，1986，BioTechniques4:214、Queenetal.US5,585,089、US5,693,761和US5,693,762所提供。那些方法包括分離、操作和表達(dá)核酸序列，其中核酸序列從至少重鏈或輕鏈之一編碼免疫球蛋白Fv可變區(qū)域的全部或部份。此種核酸的來(lái)源是本
技術(shù)領(lǐng)域：
中眾所周知的，并且例如可從雜交瘤中獲得，其中此雜交瘤產(chǎn)生抗體抵抗感興趣的多肽或其片段?？芍亟MDNA克隆(clone)至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，其中此重組DNA編碼人源化抗體或其片段。可將人源化抗體融合至支架，在所述人源化抗體中，已將特定氨基酸取代、缺失或增加。優(yōu)選的人化抗體具有在框架區(qū)域中具有氨基酸取代，由此來(lái)改善對(duì)抗原的結(jié)合。例如這樣一種人源化抗體，其具有框架殘基相同于供體的框架殘基或其它氨基酸，除了受體的框架殘基。為了產(chǎn)生此種抗體，藉由對(duì)應(yīng)的供體氨基酸可取代經(jīng)過(guò)選擇的少數(shù)受體人源化免疫球蛋白鏈的框架殘基。優(yōu)選的取代位置包括鄰接于CDR的氨基酸殘基或其具有與CDR反應(yīng)的能力。從供體選擇氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)敘述于US5,585,089。將抗體人源化的其33它技術(shù)敘述于Padlanetal.EP519596Al。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體的各多肽不包括膠原蛋白NC1區(qū)。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體的各多肽不包括二碌^建結(jié)(disulfideknot)。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體的各多肽不包括噬菌體T4fibritin折疊區(qū)。優(yōu)選三聚體抗體的支架大小為最小。在一實(shí)施例中，膠原蛋白樣區(qū)包括(G-P-P/0)k)的序列。在一實(shí)施例中，各多肽包括少于13個(gè)G-X-Y重復(fù)序歹'j。在某些實(shí)施例中，三聚體抗體包括少于ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、30、35、40、45或50個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在某些實(shí)施例中，三聚體抗體的各多肽的分子量小于35、37、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50kD。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體的分子量小于105、110、115、120、125、130、135、140、145或150kD。在一優(yōu)選實(shí)施例中，三聚體可溶抗體包括三條多肽，其中各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，其包括至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，且至少5、6、7、8、9或10個(gè)Y為羥脯氨酸；以及抗體區(qū)，其中所述三條多肽的膠原蛋白樣支架區(qū)互相作用以形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少1(^NT'的親合力特異性結(jié)合至配體。本發(fā)明也包括核酸，其編碼融合多肽形成本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物。核酸分離(例如RT-PCR)?？蓪⒑怂峁δ苄赃B接至表達(dá)載體?？墒褂媒?jīng)核酸或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來(lái)制備本發(fā)明的融合多肽或蛋白質(zhì)復(fù)合物。用以制備抗體的有用的細(xì)胞包括昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞包括，但不限于骨髓瘤NS0細(xì)胞、CHO細(xì)胞或淋巴細(xì)胞(lymphaticcell)。本發(fā)明包括產(chǎn)生三聚體可溶抗體的方法，其藉由將編碼膠原蛋白支架區(qū)的核酸與包括抗體區(qū)的核酸連結(jié)，例如使用一般分子技術(shù)?？芍苯訉⒛z原蛋白支架區(qū)與抗體區(qū)連接，或可藉由額外的序列將其分離，例如編碼鉸鏈(hinge)區(qū)的核苷酸序列。可在允許羥脯氨酸化的細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)上迷核酸，例如NS0細(xì)胞。在一實(shí)施例中，本發(fā)明包括產(chǎn)生三聚體可溶抗體的方法，其藉由將編碼膠原蛋白樣區(qū)的核酸與編碼抗體區(qū)的核酸讀框連結(jié)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，膠原蛋白樣區(qū)包括大于10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列。在一實(shí)施例中，膠原蛋白樣區(qū)包括10-30個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，G為甘氨酸，X為任何氨基酸且Y為任何氨基酸，且至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P。在一實(shí)施例中，^皎原蛋白樣區(qū)的核酸與編碼對(duì)應(yīng)于配體的抗體的核酸讀框連結(jié)；以及將上述編碼的多肽于細(xì)胞中表達(dá)，其中至少5、6、7、8、9或10個(gè)G-P-P重復(fù)序列的Y位置經(jīng)羥脯氨酸化；其中三條多肽的羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)互相反應(yīng)以形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少1(^M"的親合力特異性結(jié)合至配體。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于107M"。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于1()SM人在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于1(^M"。在某些實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力為107]\4"至10^m"、1()7m"至1()9m"、107]V^至108m-'、108m-1_￡1010m-1、1()8m"至109m",以及1。9m"至1010m-1。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體所對(duì)應(yīng)的配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體所對(duì)應(yīng)的配體為人類(lèi)CD3。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體所對(duì)應(yīng)的配體為人類(lèi)HER2/neu。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體所對(duì)應(yīng)的配體為人類(lèi)TNF-a。可從包括編碼出本發(fā)明多肽的核酸的載體，優(yōu)選為表達(dá)載體來(lái)表達(dá)支架區(qū)蛋白質(zhì)和支架區(qū)融合蛋白質(zhì)。此處所使用的"載體"指核酸分子，其具有克隆另一核酸至其連接處的能力，可包括質(zhì)粒(plasimd)、粘粒(cosmid)或病毒載體(viralvector)。載體具有自主性復(fù)制(autonomousreplication)或插入至宿主DNA的能力。病毒載體包括復(fù)制有缺陷的反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)、腺病毒(adenovirus)和腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus)。在原核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)最通常在具有載體的大腸桿菌中執(zhí)行，而此載體包括基本的或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其驅(qū)動(dòng)融合或非融合蛋白的表達(dá)。融合載體可將一些氨基酸加入至在其中編碼的蛋白質(zhì)，通常加入至重組蛋白的氨基端。此種融合載體提供三種用途l)增加重組蛋白的表達(dá)；2)增加重組蛋白的穩(wěn)定性和；3)在親合性純化中，藉由作為配體來(lái)幫助重組蛋白的純化。通常在融合部分和重組蛋白的交接處引入蛋白質(zhì)切割位點(diǎn)以使重組蛋白在融合蛋白純化之后可從融合部分分離。此種酶和其同源識(shí)別的序列，包括因子X(jué)a、凝血酶(thrombin)和腸激酶(enterokinase)。一4殳融合表達(dá)載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.andJohnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，N丄)，其對(duì)目標(biāo)融合蛋白分別融合了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase，GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白(maltoseEbindingprotein)或蛋白質(zhì)A。在大腸桿菌中將重組蛋白的表達(dá)最大化是在宿主細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，而此宿主細(xì)菌的蛋白質(zhì)裂解重組蛋白的能力受損(Gottesman，S.，(1990)GeneExpressionTechnology:MethodinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,Calif.119128)。另一策略為，在將核酸插入表達(dá)載體之前，改變此核酸的序列，使后續(xù)制備出來(lái)的氨基酸，會(huì)為大腸桿菌所優(yōu)先使用(Wadaeta1.，(1992)NucleicAcidsRes.20:2111-2118)。本發(fā)明此種核酸序列的改變可藉由標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)實(shí)行。宿主細(xì)胞可為任何原核細(xì)胞或真核細(xì)胞?？蓪⒈景l(fā)明的蛋白質(zhì)表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinesehamsterovarycells,CHOcell))或COS細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1起源的SV40細(xì)胞；Gluzman(1981)Cell23:175182))中。其它適合的細(xì)胞為本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人士所周知。經(jīng)由一般轉(zhuǎn)化(transformation)或轉(zhuǎn)染(transfection)技術(shù)可將載體DNA引入宿主細(xì)胞中。此處所使用的"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"指各種本
技術(shù)領(lǐng)域：
中所認(rèn)定用來(lái)將外源核酸(例如DNA)引入宿主細(xì)胞中的過(guò)程，包括磷酸鈣或氯化鈣共沈淀法(co-precipitation)、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法(DEAE-dextran-mediatedtransfection)、月旨質(zhì)專(zhuān)爭(zhēng)染'法(lipofection)或電穿孑Li(electroporation)。本發(fā)明包括一種抑制配體的生物活性的方法，包括將三聚體可溶抗體和該配體一起培養(yǎng)，并且所述三聚體可溶抗體包括三條多肽，其中該三聚體可溶抗體結(jié)合至該配體，抑制了該配體的生物活性。在一優(yōu)選實(shí)施例中，各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，其包括至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，其中G為甘氨酸，X為任何氨基酸且Y為任何氨基酸，其中至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O,至少5、6、7、8、9或10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-O和其中P為脯氨酸而O為羥脯氨酸；以及抗體區(qū)，其中所述三條多肽的羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)互相反應(yīng)以形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少107M"的親合力特異性結(jié)合至配體。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于107M-L在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于108M-1。在一實(shí)施例中，可36溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于109M-1。在某些實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力介于107M-1至1010M-1的間、107M-1至109M-1的間、107M-1至108M-1的間、108M-1至1010M-1的間、108M-1至109M-1的間，以及109M-1至1010M-1的間。在一實(shí)施例中，三聚體可溶抗體所對(duì)應(yīng)的配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體、人類(lèi)CD3、人類(lèi)HER2/neu或人類(lèi)TNF-a。可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)復(fù)合物和具療效成分(thempeuticmoiety)進(jìn)行結(jié)合，例如細(xì)胞毒素(cytotoxin)、治療試劑或放射性離子(radioactiveion)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性試劑包括任何對(duì)細(xì)胞有害的試劑。實(shí)例包括太平洋紫杉醇(taxol)、細(xì)胞松弛素B(cytochalasinB)、短桿菌素D(gramicidinD)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、吐根石威(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、滅必治(etoposide)、鬼臼p塞吩甙(tenoposide)、維克思丁(vincristine)、，敏伯斯登(vinblastine)、4火水仙減<(colchicin)、阿霉素多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、(dihydroxyanthracindione)、米托(mitoxantrone)、普卡霉素(mithramycin)、放線(xiàn)菌素D(actinomycinD)、去氬睪丸素(l-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、4尋4爭(zhēng)卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、恩特來(lái)(propranolol)、噪呤霉素核苷酸(puromycin)、美登素(maytansinoids)，例如，美登醇(maytansinol)(見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利No.5,208,020)、CC-1065(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,475,092,5,585,499,5，846,545)和其類(lèi)似物或同源物。治療試劑包括，但不限于，抗代謝劑(antimetabolites)(例如，滅殺除癌(methotrexate)、巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-碌l鳥(niǎo)。票呤核苷(6-thioguanine)、賽達(dá)命(cytarabine)、5-氟尿嗜^氨烯咪胺(5-fluoroumcildecarbazine))、烷化基藥齊l](alkylatingagents)(例^口,氣芥氣(mechlorethamine)、thioepachlorambucil、CC-1065、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)和洛莫司汀(lomustine，CCNU)、(cyclothosphamide)、補(bǔ)束克(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脈佐菌素(streptozotocin)、絲裂霉素C(mitomycinC)和順4白帝爾(cis-dichlorodiamineplatinum(II)(DDP)cisplatin))、四環(huán)霉素(anthracyclines)(例如,柔紅霉素(daunorubicin)(的前稱(chēng)為daunomycin))、抗生素(例如，可美凈(dactinomycin)(之前稱(chēng)為放線(xiàn)菌素(actinomycin))、樸類(lèi)惡(bleomycin)、普卡霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin，AMC))以及抗有絲分裂劑(anti-mitoticagents)(例如，維克思丁(vincristine)、壽文伯斯登(vinblastine)、太平洋紫杉醇(taxol)和美登素(maytansinoids))。本發(fā)明實(shí)施例中預(yù)期的放射性離子包括但不限于m銦、113銦、"錸、105錸、1()1錸、"锝(technetium)、121碲(tellurium)、122碲、125碲、165銩、167銩、168銩、123碘、125硤、126碘、131碘、133碘、81氪、33氣、9Q釔、213敘、77溴、18氟、95釕、97釕、朋釕、105釕、107汞、203汞、67鎵、68鎵、35硫和14碳。藉由上述的結(jié)合物，可修飾宿主體內(nèi)的已知生物反應(yīng)。不將藥物部分(drugmoiety)設(shè)計(jì)限制為典型化學(xué)治療試劑。例如，藥物部分可以是具有生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括，例如毒素，如雞母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻蛋白A(ricinA)、纟錄膿4干菌夕卜毒素(pseudomonasexotoxin)或白口侯毒素(diphtheriatoxin);蛋白質(zhì)，例如月中瘤壞死因子(tumornecrosisfactor)、a-干4尤素(a畫(huà)interferon)、P-干4尤素((3-interferon)、3申經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(plateletderivedgrowthfactor)、組織胞漿素原激活素(tissueplasminogenactivator);或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(biologicalresponsemodifier),例如，淋巴因子(lymphokines)、細(xì)胞白介素-1(interleukin-l,"IL-r)、細(xì)胞白介素-2(interleukin-2，"IL-2"),細(xì)胞白介素-6(interleukin-6，"IL-6")、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)月包集落刺;敫因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,"GM-CSF")、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,"G-CSF")或其它生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施例中，可將支架融合蛋白與聚合物結(jié)合。此種聚合物包括，但不限于，聚乙二醇(polyethyleneglycol)、聚丙二醇(polypropyleneglycol)和聚羥乙烯聚酯多元醇(polyoxyethylatedpolyol)。前述蛋白質(zhì)和結(jié)合依據(jù)其異源性區(qū)域的特異性，可用來(lái)治療多種失調(diào)，包括癌癥、炎性疾病(inflammationdisease)、代謝疾病(metabolismdisease)、纖維化疾病(fibrosisdisease)和心血管循環(huán)器官疾病(cardiovasculardisease)。因此本發(fā)明以治療此種失調(diào)為特征，例如，藉由把本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物之一以有效量(effectiveamount)給予需要的病患以治療失調(diào)?？烧J(rèn)定被治療的病患具有以失調(diào)為特征的情況或是處于此風(fēng)險(xiǎn)中。此方法可單獨(dú)表達(dá)或與其它藥物或治療結(jié)合。因?yàn)楸景l(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物具有多重特異性的特色，可以使用其來(lái)連接在一般情況下并不互相結(jié)合的分子或細(xì)胞。此特征對(duì)于細(xì)胞療法(cell-basedtherapy)特別有用。在一實(shí)施例中，蛋白質(zhì)復(fù)合物中的異源性區(qū)域具有活化細(xì)胞毒素性細(xì)胞(cytotoxiccell)(例如毒殺性T細(xì)月包(cytotoxicTcell))的能力，藉由與位于細(xì)胞毒素性細(xì)胞上的反應(yīng)因子抗原(effectorantigen)特異性結(jié)合，而其它異源性區(qū)域則特異性結(jié)合至位于將被破壞的病原體或有害細(xì)胞的目標(biāo)抗原。在此方法中，蛋白質(zhì)復(fù)合物可用來(lái)治療因病原體或有害細(xì)胞所導(dǎo)致的失調(diào)。"治療"定義為將組合物給予病患，以治愈、減輕、緩和、治療、避免或改善失調(diào)、失調(diào)的癥狀、對(duì)于失調(diào)的疾病狀態(tài)第二期或傾向于疾病的體質(zhì)為目的。"有效量，，為具有產(chǎn)生醫(yī)藥上令人滿(mǎn)意的結(jié)果的組合物的量，例如上述于被治療的病患產(chǎn)生醫(yī)藥上令人滿(mǎn)意的結(jié)果的量。經(jīng)由本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物與細(xì)胞毒素性細(xì)胞上當(dāng)作反應(yīng)因子抗原的CD3抗原結(jié)合，可活化細(xì)胞毒素性細(xì)胞。其它淋巴樣細(xì)胞(lymphoidcell)相關(guān)的反應(yīng)因子抗原包括人類(lèi)CD16抗原、NKG2D抗原、NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原和CD89抗原。與這些反應(yīng)因子抗原結(jié)合使效應(yīng)細(xì)胞活化，效應(yīng)細(xì)胞例如，單核細(xì)胞(monocyte)、嗜中性粒細(xì)胞(neutrophilicgranulocyte)和樹(shù)突細(xì)月包(dendriticcell)。這些^皮活4匕的細(xì)月包之后會(huì)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞施加細(xì)胞毒性或細(xì)胞凋亡影響(apoptoticeffect)。目標(biāo)抗原為這樣一種抗原，其獨(dú)特地表達(dá)于與死亡情況相關(guān)的細(xì)胞上，但是其不表達(dá)于或以低水平表達(dá)于或是不可達(dá)到于細(xì)胞健康的情況下。這些與有害細(xì)胞相關(guān)的目標(biāo)抗原的例子包括EpCAM、CCR5、CD19、HER2/neu、HER3、HER4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(黏液素(mucin))、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5.sub.AC、MUC5.sub.B、MUC7、beta.hCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經(jīng)節(jié)苷脂CD3(gangliosideGD3)、9-0-Acetyl-GD3、GM2、GloboH、fUcosylGM1、PolySA、GD2、碳脫水酶(CarboanhydraseIX(MN/CAIX))、CD44v6、音速小子(SonicHedgehog(Shh))、Wue-l、漿細(xì)胞抗體(PlasmaCellAntigen)、膜結(jié)合(membrane-bound)IgE、黑色素細(xì)胞瘤硫化軟骨蛋白多糖(MelanomaChondroitinSulfateProteoglycan(MCSP))、CCR8、TNF-alpha前驅(qū)物、STEAP、間皮素(mesothelin)、A33抗原、前列腺干細(xì)胞抗原(ProstateStemCellAntigen(PSCA))、Ly-6、第四型固定膠(desmoglein4)、鈣黏附素E新表4立(E醫(yī)cadherinneoepitope)、月臺(tái)JL乙酰月旦石成受體(FetalAcetylcholineReceptor)、CD25、CA19-9標(biāo)志(marker)、CA-125標(biāo)志和米勒抑制受質(zhì)受體第II型(MuellerianInhibitorySubstance(MIS)Receptortype11)、sTn(唾液酸化Tn抗原(sialylatedTnantigen;TAG-72))、FAP(纖維組織母細(xì)胞活化抗原(fibroblastactivationantigen))、內(nèi)皮唾(液)酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。體內(nèi)的方式為將一有療效的組合物(例如，包含本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物的組合物)給予病患。一般而言，將復(fù)合物懸浮于一藥學(xué)上可接受的載體(carrier)(例如生理食鹽水)和將其以口服給藥或藉由靜脈內(nèi)(intravenous)注入或注射或灌入皮下(subcutaneous)、月幾肉內(nèi)(intramuscular)、革肖內(nèi)(intrathecal)、腹月空內(nèi)(intraperitoneal)、直腸內(nèi)(intrarectal)、陰道內(nèi)(intravaginal)、鼻內(nèi)(intranasal)、胃內(nèi)(intragastrical)、氣管內(nèi)(intratracheal)或月申內(nèi)(intrapulmonary)。劑量要求是依據(jù)所選擇的給藥途徑；配方性質(zhì)；病患疾病的性質(zhì)；病患體型、體重、表面積、年紀(jì)和性別；病患被給予的其它藥物和主治醫(yī)師的判斷。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?.01-100.0mg/kg，更明確為0.1-100、0.1-75、0.1-50、0.1-25、0.1-10、0.5-100、0.5-75、0.5-50、0.5-25、0.5-10、1-100、1-75、1-50或1-25mg/kg。優(yōu)選劑量包括I-IO、10-100、10-75、10-50、10-25、25-50、50-75、25-100、50-100或75-100mg/kg。劑量范圍為l-2、3-4、5-6、7-8或9-10mg/kg更佳。本發(fā)明的治療性組合物在1-10個(gè)星期，優(yōu)選為2-8星期，更優(yōu)選為3-7星期，甚至更優(yōu)選為45或6星期間被每天、一次、兩次、三次或每星期給予。在可得成分的多樣化和多種給藥途徑的不同功效的觀點(diǎn)下，劑量需求的多樣性是可以預(yù)期的。例如，預(yù)期口服給藥比靜脈內(nèi)注射給藥需要更高的劑量?？衫脴?biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序(standardempiricalroutines)調(diào)整這些劑量程度的多樣性以將其最佳化，而此為本發(fā)明領(lǐng)域所公知。概括成分于適當(dāng)?shù)倪f送運(yùn)載體(vehicle)(例如聚合4敬粒(polymericmicroparticles)或可才直入裝置(implantabledevices)),可增加遞送的效率，特別是對(duì)于口服遞送而言。藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、分散媒(dispersionmedium)、涂層(coating)、抗菌和抗真菌試劑和等滲透壓和吸收延遲(absorptiondelaying)試劑。具體而言，這些試劑可包括生理鹽水(salinesolution)、不揮發(fā)油(fixedoil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌試劑，例如苯曱醇(benzylalcohol)或苯曱酸曱脂(methylparaben);抗氧化劑，例如抗壞血酸(ascorbicacid)或亞碌b酸氫鈉(sodiumbisulfite);螯合劑(chelatingagent),例如乙歸二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid);緩沖溶液，例如醋酸、檸檬酸或磷酸；調(diào)整張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖(dextrose)。藥學(xué)組成物的pH可以用酸或石威來(lái)調(diào)整，例如鹽酸或氫氧化鈉。本發(fā)明范圍亦涵蓋藥學(xué)組合物，其包括藥學(xué)上可接受的載體和有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)復(fù)合物?？墒褂么怂帉W(xué)組合物來(lái)治療上文所列癥狀。藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、分散媒、涂層、抗菌和抗真菌試劑和等滲透壓和吸收延遲試劑。對(duì)于不同的給藥方式，可利用一般方法將要學(xué)組合物配置成劑型(dosageform)?？设b定本發(fā)明組合物于體內(nèi)和體外兩者的功效。對(duì)于體內(nèi)的研究，可向動(dòng)物注射組合物(例如，小鼠模型)，以及之后記錄其治療功效。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，可決定適當(dāng)?shù)膭┝糠秶徒o藥方式。此處所-使用的"對(duì)應(yīng)于(directedagainst)"和"特異性結(jié)合至"指抗體或抗體的片段以至少10"M結(jié)合至其配體。在一實(shí)施例中，第一支架融合蛋白質(zhì)為(GPP)k)融合至對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP)川融合至對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體片段，其中此片段可為，但不限于一scFv、VL、VH或Fab片段。在本發(fā)明另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP—融合至對(duì)應(yīng)于CD3的抗體。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP一融合至對(duì)應(yīng)于CD3的抗體片段，其中此片段可為，但不限于scFv、VL、VH或Fab片段。在本發(fā)明又另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP)10的雙重特異性融合蛋白質(zhì)，其具有對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片段和對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或融合蛋白質(zhì)。對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片段可與(GPP),o的N端融合，而對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片段可與(GPP)u)的C端融合。此實(shí)施例包括，但不限于雙重特異性膠原蛋白區(qū)融合蛋白質(zhì)763CSAOKT3。在本發(fā)明另一實(shí)施例中，對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片段可和(GPP)k)的N端融合，而對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片段可和(GPP)k)的C端融合。在本發(fā)明又另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)是介于(GPP)1Q和對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片端的融合，其中抗體或抗體片段融合至(GPPho的N端或C端。第二膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)可為介于(GPP),o和對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片端的融合，其中抗體或抗體片段融合至(GPP)h)的N端或C端。在本發(fā)明一實(shí)施例中，抗EGFRscFv膠原蛋白支架區(qū)為763—scFv-Col。在本發(fā)明一實(shí)施例中，抗CD3scFv膠原蛋白支架區(qū)為OKT3—scFv-Col。在本發(fā)明另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP)k)融合至對(duì)應(yīng)于TNF-a的抗體。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP)k)融合至對(duì)應(yīng)于TNF-a的抗體片段，其中此片段可為，但不限于scFv、VL、VH或Fab片段。在本發(fā)明一實(shí)施例中，抗TNF-ascFv月交原蛋白支架為區(qū)蛋白質(zhì)為357—scFv隱Col。在本發(fā)明又另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP)10的雙重特異性融合蛋白質(zhì)，其具有對(duì)應(yīng)于TNF-a、EGFR的抗體或抗體片段和對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或融合蛋白質(zhì)。對(duì)應(yīng)于TNF-a、EGFR的抗體或抗體片段可與(GPPh。的N端融合，而對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片段可與(GPP)u)的C端融合。在本發(fā)明另一實(shí)施例中，對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片段可與(GPP一的N端融合，而對(duì)應(yīng)于TNF-a、EGFR的抗體或抗體片段可與(GPP)^的C端融合。在本發(fā)明又另一實(shí)施例中，其中的膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP)10和對(duì)應(yīng)于TNF-a的抗體或抗體片端的融合，其中抗體或抗體片段融合至(GPP),o的N端或C端。另一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)可為介于(GPP)u)和對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片端的融合，其中抗體或抗體片段融合至(GPP),o的N端或C端。在本發(fā)明又另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為(GPP),0的雙重特異性融合蛋白質(zhì)，其具有對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片段和對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或融合蛋白質(zhì)。對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片段可與(GPP)k)的N端融合，而對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片段可與(GPP)h)的C端融合。在本發(fā)明另一實(shí)施例中，對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片段可與(GPP)u)的N端融合，而對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片段可與(GPP),o的C端融合。在本發(fā)明又另一實(shí)施例中，第一膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)為介于(GPP—和對(duì)應(yīng)于EGFR的抗體或抗體片端的融合，其中抗體或抗體片段融合至(GPP)w的N端或C端。第二膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)可為介于(GPP;ho和對(duì)應(yīng)于CD3的抗體或抗體片端的融合，其中抗體或抗體片段融合至(GPP),o的N端或C端。42在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施例中，膠原蛋白支架區(qū)融合蛋白質(zhì)可包括融合標(biāo)志蛋白質(zhì)。標(biāo)志蛋白質(zhì)包括，但不限于熒光酶、綠色熒光蛋白質(zhì)或增強(qiáng)的綠色熒光蛋白質(zhì)。這些實(shí)施例包括，但不限于h4D5CSA-Luc,其對(duì)應(yīng)于HER2/neu。可使用包括標(biāo)志蛋白質(zhì)的膠原蛋白區(qū)融合蛋白質(zhì)用于診斷和分子造影中。在本發(fā)明實(shí)施例中，可將包括標(biāo)志蛋白質(zhì)或放射性離子或其它融合部分的膠原蛋白支架區(qū)蛋白質(zhì)包裝于試劑盒中，此試劑盒包括支架區(qū)融合蛋白和對(duì)于特定分子造影所需的其它試劑。這些試劑包括，但不限于用于制備生物材料的試劑和顯像(visualization)標(biāo)志蛋白質(zhì)的試劑。本發(fā)明包括一種檢測(cè)配體的方法，包括將三聚體可溶抗體和該配體一起培養(yǎng)以及檢測(cè)該三聚體可溶抗體對(duì)該配體的結(jié)合，其中該三聚體可溶抗體包括三條多肽。在一優(yōu)選實(shí)施例中，各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，其包括至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，其中G為甘氨酸，X為任何氨基酸且Y為任何氨基酸，其中至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O，其中至少5、6、7、8、9或10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-O并且其中P為脯氨酸而O為羥脯氨酸；以及抗體區(qū)，其中三條多肽的羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)互相反應(yīng)以形成該三聚體可溶抗體，以至少1(^M"的親合力特異性結(jié)合至配體。在一優(yōu)選實(shí)施例中，各多肽包括膠原蛋白支架區(qū)，其包括至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列，其中G為甘氨酸，X為任何氨基酸且Y為任何氨基酸，其中至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O,其中至少5、6、7、8、9或10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-X-O并且其中O為羥脯氨酸；以及抗體區(qū)，其中三條多肽的羥脯氨酸化的膠原蛋白支架區(qū)互相反應(yīng)以形成該三聚體可溶抗體，以至少107M"的親合力特異性結(jié)合至配體。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于10M"。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于108M"。在一實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力大于109M"。在某些實(shí)施例中，可溶三聚體抗體對(duì)其配體的親合力是1()7M"至1(Tm"、1()7m"至1()9m"、io7m"至10S]Vr1、108M"至1010M-1、108Nf1至109M_1,以及109M"至1010M"。在某些實(shí)施例中，可溶三聚體抗體包括熒光酶多肽。本發(fā)明實(shí)施例包括重組蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包括第一融合多肽鏈，其包括第一膠原蛋白支架區(qū)和融合至第一支架區(qū)的一端的第一異源區(qū)；第二融合多肽鏈，其包括第二膠原蛋白支架區(qū)；以及第三融合多肽鏈，其包括第三支架區(qū)，其中第一第二和第三支架區(qū)對(duì)齊以形成三重螺旋。在更進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中第一融合多肽鏈更包括第二異源區(qū)融合至第一支架區(qū)的另一端。本發(fā)明其它實(shí)施例包括蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中第一異源區(qū)包括特異性結(jié)合CD3的第一單鏈抗體的序列或第二異源區(qū)包括特異性結(jié)合EGFR的第二單鏈抗體的序列。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施例中，蛋白質(zhì)復(fù)合物包括第二融合多肽鏈，其包括第三異源區(qū)融合至第二支架區(qū)的一端，且第二融合多肽鏈包括第四異源區(qū)融合至第二支架區(qū)的另一端，第三融合多肽鏈包括第五異源區(qū)融合至第三支架區(qū)的一端和第四異源區(qū)融合至第三支架區(qū)的另一端，其中各重復(fù)序列包括(GPP)K)的序列。實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)于抗EGFR抗體區(qū)的噬菌體展示文庫(kù)(phagedisplaylibrary)的篩選藉由篩選人類(lèi)單一折疊scFv噬菌體展示文庫(kù)(phagedisplaylibrary)來(lái)分離erb噬菌粒phagemid)，其包括結(jié)合各種片段(scFv)的EGFR細(xì)胞外區(qū)(EGFR-ECD)(TomlinsonI+J;kindlyprovidedbyI.M.TomlinsonandG,Winter,MRCLaboratoryofMolecularBiology,Cambridge,UK)。使用涂布有10的經(jīng)純化的EGFR細(xì)胞外區(qū)(EGFR-ECD;ResearchDiagnostics,Inc.)的免疫試管(immunotube)(Maxisorp;Nunc,Roskilde,Denmark)來(lái)執(zhí)行篩選。根據(jù)操作手冊(cè)執(zhí)行經(jīng)洗提的噬菌體的封閉(blocking)、淘洗、清洗、洗提和再擴(kuò)增(reamplification)。鑒定了一些復(fù)制子。在藉由Western印跡和ELISA確認(rèn)后，選出復(fù)制子，erb一scFv進(jìn)行更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。獲得編碼erb—scFv的cDNA,并將藉由標(biāo)準(zhǔn)方法其連接至表達(dá)載體。erb—scFv的多肽序列示于SEQIDNO:1，其編碼核苦酸序列示于SEQIDNO:2。之后在昆蟲(chóng)細(xì)胞林果蠅(DrosophilaS2)中表達(dá)該表達(dá)載體。純化抗EGFRerb—scFv且將其進(jìn)行Western印跡和ELISA以確認(rèn)其對(duì)EGFR的特異性。實(shí)施例2CD3抗體區(qū)實(shí)施RT-PCR以從雜交瘤細(xì)胞抹獲得cDNA，其編碼出抗CD3單克隆抗體0KT3的重鏈可變區(qū)(heavychainvariablereagion,VH)和輕鏈可變區(qū)(lightchainvariablereagion,VL)。之后連接兩種cDNA以產(chǎn)生融合序列，其編碼OKT3的VH-VL的融合蛋白質(zhì)。該融合蛋白質(zhì)的多肽序列示于SEQIDNO:3,其編碼cDNA序列示于SEQIDNO:4。實(shí)施例3EGFR抗體區(qū)執(zhí)行相同的步驟以獲得編碼抗EGFR單克隆抗體528的VH和VL的cDNA以及融合序列，所述融合序列編碼抗EGFR528的VH-VL的融合蛋白質(zhì)。528單克隆抗體與細(xì)胞膜上的EGFR結(jié)合，例如于人類(lèi)表皮樣癌(humanepidermoidcarcinoma)A431細(xì)胞。此單鏈抗體的多肽序列示于SEQIDNO:5,其編碼cDNA序列示于SEQIDNO:6。實(shí)施例4抗體區(qū)和人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI的融合分別將編碼上述抗EGFRerbOKT3Vh-Vl和抗EGFR528VprVL讀框融合至人類(lèi)迷你膠原蛋白XXIcDNA，其包括于5'端的人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)，EPKSCDKTHTCPPCPRSIP,以及于3'端的組氨酸標(biāo)記。人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI的多肽和cDNA序列分別示于SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，注意在SEQIDNO:7中，Pro為脯氨酸或羥脯氨酸。構(gòu)建體包括衍生于OKT3IgG的氨基端抗CD3scFv、人類(lèi)IgG2的鉸鏈區(qū)、人類(lèi)迷你膠原蛋白XXI多肽，且伴隨著T4fibritin折疊區(qū)和組氨酸標(biāo)記的OKT3mC21fd。噬菌體T4fibritin折疊區(qū)具有充分的驅(qū)動(dòng)膠原蛋白區(qū)三聚體化和正確折疊的能力，且其包括27個(gè)氨基酸，NH2-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL-COOH,并形成具有疏水內(nèi)部的類(lèi)卩螺旋結(jié)構(gòu)(Franketal.,(2001)JMolBiol308:1081-1089)。將對(duì)于OKT3mC21和OKT3mC21fd兩者所產(chǎn)生的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入果蠅S2細(xì)胞，果蠅S2細(xì)胞帶有穩(wěn)定表達(dá)的脯氨酸-4-羥化酶基因。于殺稻瘟菌素(blasticidin)存在的條件下培養(yǎng)細(xì)胞以選出抗殺稻瘟菌素的細(xì)胞。收集45細(xì)胞培養(yǎng)懸浮物，且藉由以單克隆抗體3E2進(jìn)行的Western印跡來(lái)分析，單克隆抗體3E2辨認(rèn)al(XXI)膠原蛋白的C端NC1區(qū)。如圖2所示，在非還原環(huán)境下，OKTmC21和OKT3mC21fd皆形成三重結(jié)構(gòu)(如T所示)。也在OKTmC21和OKT3mC21fd兩者內(nèi)皆檢測(cè)到分子間二硫一睫三聚體(如M所示)。此結(jié)果證明OKT3_scFv的異源性融合蛋白質(zhì)并不影響迷你膠原蛋白XXI的支架區(qū)的三聚體化，且甚至不需任何三聚體結(jié)構(gòu)，例如T4fibritin折疊區(qū)。實(shí)施例5抗體區(qū)和膠原蛋白樣區(qū)的融合以熱穩(wěn)定的短膠原蛋白樣肽(Gly-Pro-Pro)k)取代迷你膠原蛋白XXI的膠原蛋白區(qū)作為膠原蛋白支架抗體的支架模板。產(chǎn)生八個(gè)融合多肽erb—scFv-Col、OKT3—scFv-Col、763—scFv-Col、357—scFv-Col、erb—scFv-GPP10、Col-erb—scFv、763CSA-OKT3和h4D5CSA-Luc。對(duì)于763—CSA2的構(gòu)建而言，其它膠原蛋白樣肽，(GPP)5GKPGKP(GPP)6,被用來(lái)當(dāng)作三聚體支架。在小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)這些支架區(qū)融合蛋白為可溶性分泌蛋白。重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)PCR從erb噬質(zhì)粒擴(kuò)增編碼erb的scFV的cDNA。藉由從OKT雜交瘤(ATCC,CRL-8001)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物獲得編碼鼠科IgG2a抗CD3mAbOKT3的序列(OrthoPharmaceuticalCoroporation)。依據(jù)^>開(kāi)的核苷酸序列，藉由RT-PCR獲得OKT3的VH和VL的cDNA。藉由以甘氨酸接頭(GGGGS)3連接VH和vl產(chǎn)生erb和OKT3的scFvPCR融合。4吏用書(shū)亍生自panitumumab(Vectibix,Amgen，Inc.)的cDNA的引物^式劑盒PCR擴(kuò)增編碼mAb763的VH和VL的cDNA,panitumumab的cDNA是根據(jù)公開(kāi)的核苷酸序列(美國(guó)專(zhuān)利No.6,235,883)。藉由以甘氨酸接頭(GGGGS)3連接VH和VL產(chǎn)生763的scFvPCR融合。實(shí)施RT-PCR以從雜交瘤357-101-4纟田胞抹(ECACCNo.92030603)獲得編石馬才元TNF-a單克隆4元體357的重4連可變區(qū)(heavychainvariablereagion,Vh)和輕鏈可變區(qū)(lightchainvariablereagion,Vl)的cDNA，小鼠抗人類(lèi)TNF-amAb具有強(qiáng)效中和活性。之后以甘氨S臾接頭(GGGGS)3(SEQIDNO:9中的氨基酸107-121)連接兩種cDNA以產(chǎn)生融合序列，其編碼357scFv的融合蛋白質(zhì)。此融合蛋白質(zhì)的多肽序列示于SEQIDNO:9,其編碼cDNA序列示于SEQIDNO:10。為了產(chǎn)生scFv-Col，其編碼區(qū)包括N端scFv核芬酸序列和C端基因，其編碼EPKSCDKTHTCPPCPRSIP(GPP),。GICDPSLCFSVIARRDPFRKGPNY(SEQIDNO:11)，其編碼人類(lèi)IgG的鉸鏈區(qū)(斜體顯示)、膠原蛋白樣支架區(qū)(以粗體顯示)和XXI型膠原蛋白的NC1區(qū)。以下顯示合成的包含膠原蛋白支架的多肽(SEQIDNO:11)，其cDNA序列示于SEQIDNO:12。SEQIDNO:11G/MiVoZ^/S^Q^^Z^TT^/^r/zrO^/VoPraCys/VoArgSerlleProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCysPheSerVallleAlaArgArgAspProPheArgLysGlyProAsnTyr藉由重疊PCR(overlappingPCR)制備合成序列(SEQIDNO:12)且將在兩側(cè)具有Notl和Xhol位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物復(fù)制進(jìn)入表達(dá)載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)的相同位置。之后將erb、OKT3、763和357的scFv讀框復(fù)制至上述包含C端膠原蛋白支架的構(gòu)建體中的Ascl和Notl位點(diǎn)以分別制備erb_scFv-Col、OKT3—scFv-Col、763—scFv-Col和357—scFv-Col的表達(dá)構(gòu)建體。接著產(chǎn)生erb—scFv-GPP1()以證明膠原蛋白支架抗體的膠原蛋白支架肽，(GPP)10，其可自身驅(qū)動(dòng)非共價(jià)鍵合三聚體融合蛋白質(zhì)，不需存在于膠原蛋白樣區(qū)中或兩側(cè)的鍵內(nèi)交聯(lián)氨基酸殘基的幫助(例如半胱氨酸或賴(lài)氨酸)。erb—scFv-GPP1()的編碼區(qū)包括erb_scFv的N端核香酸序列和C端合成基因，其編碼GSP(GPP)1()GPSSGG的肽序列，此序列包括膠原蛋白樣支架區(qū)(粗體顯示)。這種包含合成膠原蛋白支架的多肽和cDNA序列分別示于SEQIDNO:13和SEQIDNO:14，注意在SEQIDNO:13中，Pro為脯氨酸或羥脯氨酸。由重疊PCR將erb—scFv的cDNA讀框復(fù)制至上述C端膠原蛋白支架序列，且將在兩側(cè)具有Ascl和Agel位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物復(fù)制進(jìn)入表達(dá)載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)以制備erb—scFv-GPPIO的表達(dá)構(gòu)建體。接著制備Col-erb_scFv。Col-erb_scFv的膠原蛋白支架區(qū)包括TCPPCPRSIP(GPP)1()GICDPSLC的肽序列，其包括膠原蛋白樣區(qū)(GPP)10，其47具有兩個(gè)位于兩側(cè)的二硫鍵結(jié)(disulfideknot)TCPPCPRSIP和GICDPSLC。這種包含合成膠原蛋白支架的多肽和cDNA序列分別示于SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，注意在SEQIDNO:15中，Pro為脯氨酸或幾脯氨酸。。由重疊PCR將erb—scFv的cDNA讀框復(fù)制至上述N端膠原蛋白支架序列(SEQIDNO:16),且將在兩側(cè)具有BamHI和Agel位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物復(fù)制進(jìn)入表達(dá)載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)以制備Col-erb—scFv的表達(dá)構(gòu)建體。接著制備763CSA2。763CSA2的編碼區(qū)包括氨基端763—scFv(抗EGFR)和C端合成膠原蛋白支架基因，其編碼EPKSGDKTHTCPPCPRSIP(GPP)sGKPGKP(GPP)6GICDPSLC的肽序列，此序列包括突變的人類(lèi)IgG鉸鏈區(qū)(斜體顯示)、膠原蛋白樣區(qū)(粗體顯示)和XXI型膠原蛋白的二硫鍵結(jié)(GICDPSLC)。以下顯示包含合成膠原蛋白支架的多肽(SEQIDNO:17),其cDNA序列示于SEQIDNO:18。SEQIDNO:17G7M/VoZ>^SerG!/>iy^/7Zj^77^///1s772rCyis/VafVoC>w_fVoArgSerneProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyLysProGlyLysProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlyProProGlylleCysAspProSerLeuCys(注意Pro為脯氨酸或羥脯氨酸)藉由重疊PCR制備合成序列(SEQIDNO:17),且將在兩側(cè)具有Notl和Xhol位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物復(fù)制進(jìn)入表達(dá)載體pSecTag2/Hygro(Invitrogen)中的相同位點(diǎn)。之后將763的scFv讀框復(fù)制至上述包含C端膠原蛋白支架的構(gòu)建體中的Ascl和Notl位點(diǎn)以制備763CSA2的表達(dá)構(gòu)建體。之后產(chǎn)生雙重特異性膠原蛋白支架抗體，763CSAOKT3。將OKT3的scFv的讀框復(fù)制至763—scFv-Col的C端于Agel和BamHI位點(diǎn)以制備763CSAOKT3的表達(dá)構(gòu)建體，其中將763的抗EGFR置于N端，且跟隨著膠原蛋白支架多肽(SEQIDNO:ll)和C端的OKT3的抗CD3scFv。之后構(gòu)建其它雙功能結(jié)合配偶體，h4D5CSA-Luc。藉由將氨基端的h4D5—scFv融合至在構(gòu)建763CSA的段落所述的包含C端膠原蛋白支架的表達(dá)載體，其中氨基端的h4D5—scFv源自人源化抗HER2/neuIgG(Carteretal.(1992)ProcNatlAcadSciUSA89,4285-4289)。之后將Gaussia熒光酶(美國(guó)專(zhuān)利No.6，232，107)讀框融合至h4D5—scFv-Col中的Agel和BamHI位點(diǎn)。各種scFv、scFv-Fc和CSA分子的各開(kāi)力文讀碼框(openreadingframe)包括這樣的序列，其編碼N端前導(dǎo)序列(leaders叫uence)以及以分泌、檢測(cè)和純化為目的的C端myc抗原決定位/聚組氨酸(polyhistidine)標(biāo)記。表1為藉由上述表達(dá)建構(gòu)載體所編碼的各種重組蛋白質(zhì)/抗體之相關(guān)信自表l、本研究中使用的各種抗體抗體標(biāo)耙形式結(jié)構(gòu)erb—scFv-ColEGFR-ECDCSA1圖4A,a部分erb—scFv-GPPIOEGFR-ECDCSA圖4A，b部分Col-erb—scFvEGFR匿ECDCSA圖4A，c部分erb—scFv-FcEGFR-ECDscFv-Fc圖4B，b部分erb—scFvEGFR-ECDscPv圖4B，c部分OKT3—scFv-ColCD3CSA圖4A,a部分OKT3IgGCD3IgG圖4B，a部分763—scFv-ColEGFRCSA圖4A,a部分763CSA2EGFRCSA圖4A，a部分763CSAOKT3EGFR和CD3雙重特異性CSA圖4A，d部分h4D5CSA-LucHER2/羅雙功能CSA圖4A，e部分357—scFv-ColTNF-aCSA圖4A，a部分357IgGTNF-aIgG圖4B,a部分膠原蛋白支架抗體實(shí)施例6重組蛋白質(zhì)的表達(dá)為了生成重組蛋白質(zhì)/抗體，根據(jù)制備商使用手冊(cè)使用Effectene(Qiagen)將前述scFv、scFv-Fc和CSA構(gòu)建體克隆至小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0細(xì)胞。在以潮霉素(hygromycin)篩選4周后，將每個(gè)穩(wěn)定的克隆(clone)培養(yǎng)于一震蕩燒瓶?jī)?nèi)以起始接種密度為5x105細(xì)胞/ml于包括2%胎牛血清的化學(xué)限定培養(yǎng)基(chemically-definedmedium)HyQCDM4NS0(Hyclone)中。培養(yǎng)維持在150rpm5天于37。C。為了使那些帶有表達(dá)載體的細(xì)胞編碼蛋白質(zhì)，每天加入維生素C(Sodiumascorbate)(80昭/ml)于培養(yǎng)基中，其中上述蛋白質(zhì)包含前述抗體區(qū)域和膠原蛋白支架區(qū)域，即膠原蛋白支架抗體(CSA)。實(shí)施例7重組蛋白質(zhì)的純化為了純化表1所列的CSA蛋白質(zhì)，提供每種過(guò)濾細(xì)胞培養(yǎng)基約2L至T-凝膠柱(1.5x8cm,Pierce),以包含0.5MKC的50mM的Tris-HCl作為援沖溶液(pH8),以60ml/d、時(shí)的流速。在以相同的緩沖溶液清洗后，以50mM的醋酸鈉緩沖溶液(pH4)洗提出蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物。在280nm監(jiān)測(cè)其UV吸收，并將其提供高峰部分置于硫酸鋅螯合SepharoseHighTrap柱(柱床體積中為l-ml,GEHealthcare),在60ml/小時(shí)的流速下以包含0.5MNaCl的50mM的Tris-HCl緩沖溶液(pH8)平衡。先以20mM的咪唑(imidazole)清洗，之后以0.25M的咪唑于相同的緩沖溶液洗提出鍵合的蛋白質(zhì)。最后的制備為以50mM,pH7.0的Hepes緩沖溶液進(jìn)行透析。之后使用具有MOPS的10%NuPAGEbis-Tris聚丙烯酰胺凝膠或7%SDS/Tris-醋酸聚丙烯酰胺凝膠以醋酸鈉作為電泳運(yùn)行緩沖溶液(runningbuffer)(Invitrogen)執(zhí)行SDS-PAGE。之后將蛋白質(zhì)以考馬斯亮藍(lán)(Coomassiebrilliantblue)R-250進(jìn)行染色。藉由密度儀利用Chemilmager5500(AlphaInn8)來(lái)定量蛋白質(zhì)條帶(band)的密度。三聚體化研究為了驗(yàn)證三重螺旋的本質(zhì)，將經(jīng)純化的erb—scFv-Col(lmg/ml)置于37°C，在DTT缺少或存在的情況下培養(yǎng)1小時(shí)。一份經(jīng)DTT處理過(guò)的樣本，更進(jìn)一步與50mMN陽(yáng)乙基順丁烯二酰亞胺(N-ethyl-maleimide，NEM)于室溫下反應(yīng)30分鐘，以永久地妨礙自由巰基(sulfhydryl)和三聚體的再形成。將每個(gè)樣本的蛋白質(zhì)取等量于7%SDS/Tris-醋酸聚丙烯酰胺凝膠以醋酸鈉作為電泳緩沖溶液進(jìn)行電泳。以考馬斯藍(lán)(Coomassieblue)進(jìn)行凝膠染色。發(fā)現(xiàn)經(jīng)純化的CSA為同源三聚體(homotrimer)或鏈內(nèi)二碌L/建六聚體(hexamer)，在輕孩i的還原環(huán)境下其可被分離成兩個(gè)三聚體。測(cè)試erb—scFv-Col的三聚體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。在含有2M尿素(urea)的50mMTris-HCl(pH8)中，經(jīng)純化的erb—scFv-Col于室溫下以缺少或存在10mMtris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)進(jìn)行處理。于室溫將還原的樣本以50mM的NEM進(jìn)行烷化(alkylate)。與SDS加樣緩沖溶液(loadingbuffer)混合之前將每個(gè)樣本取等量蛋白質(zhì)于35、45、55、65、75和85°C下加熱10分鐘。于非還原狀態(tài)下將樣本在10%NuPAGEbis-Tris聚丙烯酰胺凝月交和MOPS緩沖溶液進(jìn)行電泳。以考馬斯藍(lán)(Coomassieblue)進(jìn)行凝膠染色。結(jié)果顯示erb—scFv-Col三聚體具有高熱穩(wěn)定性。在經(jīng)65。C處理10分鐘之后仍然保留多于50%的三聚體。且發(fā)現(xiàn)了erb—scFv-Col膠原蛋白樣區(qū)域的三聚體結(jié)構(gòu)被羥脯氨酸化(prolylhydroxylate)。erb—scFv-Col或OKT3—scFv-Col的主要結(jié)構(gòu)包括人類(lèi)或小鼠的單鏈Fv處理區(qū)、人類(lèi)IgGl鉸鏈區(qū)、(Gly-Pro-Pro)K)膠原蛋白樣肽和XXI型膠原蛋白的NC1區(qū)。于小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞中表達(dá)erb—scFv-Col、OKT3—scFv-Col、erb—scFv-Fc和erb—scFv的重組抗體為可溶性分泌蛋白質(zhì)，且藉由先前提到的柱層析將其各別從培養(yǎng)基中純化。圖5A顯示這些純化抗體的SDS-PAGE分析。在非還原情況下，兩主要條帶被分解于erb—scFv-Col中(第2泳道)，而在OKT3—scFv-Col只有觀察到一個(gè)單一主要條帶(第3泳道)。erb—scFv-Col和OKT3_scFv-Col兩者的較低條帶遷移至125kD的位置，十分符合兩者scFv-Col單體(41kD)的三聚體形式所計(jì)算出的分子量。于erb—scFv-Col中(第2泳道)中顯現(xiàn)的上方條帶為三聚體的鏈內(nèi)二硫鍵合形成的二聚體。藉由將樣本培養(yǎng)于輕微還原的環(huán)境可證實(shí)此發(fā)現(xiàn)，如圖5B所示erb—scFv-Col的鏈內(nèi)二硫鍵合六聚體(250kD)被分離成兩個(gè)三聚體(125kD)。在圖5A中，在還原環(huán)境下以50mM的DTT在70。C處理樣本10分鐘，而將erb—scFv-Col的鏈內(nèi)二硫鍵合六聚體完全還原成三聚體形式，而只有一些erb—scFv-Col三聚體被更進(jìn)一步分離成單體(第7泳道)。有趣的是，OKT3—scFv-Col的三聚體結(jié)構(gòu)在這些還原環(huán)境下能不被分離成單體形式(第8泳道)。在非還原環(huán)境下，erb抗體的二價(jià)相似物(bivalentcounterpart),erb—scFv-Fc移動(dòng)成二聚體，其明確分子量為125kD(第4泳道)，而在鏈內(nèi)二硫鍵被還原之后，則展現(xiàn)近乎單體的形式，具有明確的分子量57kD(第9泳道)。這些結(jié)果意味著在erb—scFv-Col和OKT3—scFv-Col的膠原蛋白支架抗體分子中的膠原蛋白樣肽(Gly-Pro-Pro;h()可配裝成熱穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)下方)。在非還原或還原環(huán)境下，erb抗體的單價(jià)相似物，erb一scFv移動(dòng)成單一條帶，具有明確的分子量28kD?？梢燥@示于圖5中的erb—scFv-Col的鏈內(nèi)二硫鍵合形式的六聚體和三聚體結(jié)構(gòu)為特征以進(jìn)一步確定其三重螺旋的熱穩(wěn)定性。為了排除鏈內(nèi)二硫鍵對(duì)于膠原蛋白支架抗體三聚體化配裝的貢獻(xiàn)，首先使用還原劑TCEP于室溫將erb_scFv-Col中的半胱氨酸殘基完全還原，之后將其以NEM烷基化(alkylated)以避免二硫鍵再形成。將等量的非還原或還原/烷基化培養(yǎng)于包含2M尿素的Tris-HCl(50mM，pH8)中，于指示溫度下，且于非還原環(huán)境下藉由SDS-PAGE分析三重螺旋的分離，以評(píng)估膠原蛋白三重螺旋的熱穩(wěn)定性。如預(yù)期，于35。C鏈內(nèi)二硫鍵合六聚體形式立即被分離成三聚體(圖6A，比較第1泳道和第4泳道)。當(dāng)培養(yǎng)溫度升高時(shí)，三聚體顯著分離成單體(圖6A,第4-9泳道)。在2M尿素下，于還原/烷基化之后，測(cè)定erb—scFv-Col的中點(diǎn)轉(zhuǎn)換溫度(midpointtransitiontemperature,Tm)為66°C,在此溫度下一半的三聚體未經(jīng)折疊為單體(圖6A)。雖然erb—scFv-Col于高的培養(yǎng)溫度下部分降解，在非還原環(huán)境下的相同實(shí)驗(yàn)(圖6第1-3泳道)并沒(méi)有顯示六聚體或三聚體結(jié)構(gòu)的任何改變。此現(xiàn)象于其它實(shí)驗(yàn)一致，證明包含GPP的肽在于90。C加熱下敏感，且部分降解，且引入2.5M的guanidiumHC1減低Tm27°C。羥脯氨酸對(duì)于膠原蛋白三重螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是重要的。于純化的樣本實(shí)行氨基酸組成分析以調(diào)查于erb一scFv-Col中羥脯氨酸的存在。將經(jīng)純化的erb—scFv-Col以50mM醋酸進(jìn)行透析、在6NHC1，110°C進(jìn)行水解24小時(shí)的后以WatersPico'Tagsystem進(jìn)行氨基酸分析。在erb—scFv-Col的測(cè)定的氨基酸組成和根據(jù)演繹的cDNA序列的預(yù)測(cè)資料間，觀察到接近的配對(duì)(表2)。此外，羥脯氨酸衍生物的波峰位置于高效液相層析(High-PerformanceLiquidChromatograph,HPLC)洗提數(shù)據(jù)圖表中被檢測(cè)到，暗示f(Gly-Pro-Pro)10中的膠原蛋白Gly-X-Y三個(gè)為一組的Y位置的脯氨酸受到羥基化(第7圖)。根據(jù)(Gly-Pro-Pro)10中的十個(gè)完全羥基化的脯氨酸，erb—scFv-Col中的羥脯氨酸化程度被判定為61%(參見(jiàn)表2的Hyp殘基)。結(jié)果顯示在膠原蛋白支架抗體分子中的(Gly-Pro-Pro)K)對(duì)于脯氨酸-4-羥化酶而言為一種好的受質(zhì)，且對(duì)于膠原蛋白分子的生物合成而言，小鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞具有充足的脯氨酸羥化酶活性。52表2、表達(dá)于NS0細(xì)胞中的純化的erb—scFv-Col的氨基酸分析氨基酸erbscFv-Col計(jì)算而得'殘基Asx22.2±0.4b22Glx25.5±0.326Hyp6.1±0.410'Ser36.0±1.244Gly46.9±0.547His7.8±0.37Arg15.0±0.415Thr22.9±0.624Ala27.6±0.326Pro32.4±1.328Tyr12.8±0.514Val16.1±1.014Met4.6±0.73Cys5.8±1.89lie13.2±0.612Leu22,5±1.120Phe11.2±0.410Lys14.6±0.912a經(jīng)計(jì)算的氨基酸殘基為根據(jù)在移除信號(hào)序列后的erb—scFv-Col的演繹的氨基酸序列。b所顯現(xiàn)的數(shù)值為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。e當(dāng)脯氨酸殘基于膠原蛋白GXY三個(gè)為一組的序列的Y位置時(shí)的預(yù)測(cè)在培養(yǎng)基懸浮物中的三聚體可溶抗體的高程度存在指可將包括抗體區(qū)和支架區(qū)的單體三聚體化和進(jìn)行分泌。在相同的多肽如支架區(qū)中的抗體區(qū)的存在不能阻止三聚體化，不能阻止可溶抗體的形成，也不能阻止分泌抗體和培養(yǎng)基中。因此本發(fā)明允許抗體三聚體化、形成可溶性抗體并且分泌可溶性三聚體抗體。實(shí)施例9結(jié)合研究使用BIAcoreX生物傳感器(BIACORE，Inc.,Uppsala，Sweden)于緩沖液HBS陽(yáng)EP(10mMHEPES,pH7.4,150mMNaCl，3mMEDTA，0.005%surfactantP20)中測(cè)量erb抗體的變體對(duì)EGFR-ECD的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將EGFR-ECD固定于CI感應(yīng)芯片經(jīng)由胺(amine)連結(jié)至1700反應(yīng)單位(responseunits,RU)的程度以及在10ju1/分鐘的流速下注入不同濃度的經(jīng)純化的抗體。藉由注入5pll0mM甘氨酸-鹽酸(glycine-HCl)(pH3.5)復(fù)原表面。在每個(gè)濃度取得感應(yīng)譜(sensorgram)并使用程序BIAEvaluation3.2來(lái)洗提感應(yīng)譜。結(jié)合數(shù)據(jù)與1:1Langmuir結(jié)合模型配合來(lái)計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù)KD，其被定義為解離率(dissociationrate)(koff)/結(jié)合率(associationrate)(kon)的比值。結(jié)果顯示于表3。表3、erb抗體的各種形式與固定化的EGFR-ECD結(jié)合的結(jié)合動(dòng)力學(xué)抗體W10-4M-VnMerb_scFv-Col1.728.224.78erb—scFv-Fc0.90994.4104erbscFv0.157414960如表3所示，erb—scFv-Col對(duì)EGFR-ECD的結(jié)合親合力分別幾乎為二價(jià)(erb—scFv-Fc)和單價(jià)(erb—scFv)mAb的20和1000倍?？贵w結(jié)合分析證明膠原蛋白支架抗體分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)不改變scFv區(qū)的結(jié)合活性。使用表面等離振子共振技術(shù)(surfaceplasmonresonance)和細(xì)胞流式儀來(lái)檢查scFv結(jié)合活性是否分別保留于erb—scFv-Col和OKT3—scFv-Col。因此，藉由膠原蛋白支架抗體分子中的三價(jià)scFv而增加的抗原結(jié)合親合力和藉由其的二價(jià)和單價(jià)相似物而增加的抗原結(jié)合親合力進(jìn)行比較。三個(gè)erb抗體變形，erb—scFv-Col、erb—scFv-Fc和erb—scFv對(duì)EGFR-ECD的互相影響以表面等離子共振技術(shù)進(jìn)行研究，而平衡結(jié)合常數(shù)KD則被測(cè)定為分離和結(jié)合率常數(shù)的比值(koff/kon)。單價(jià)erb—scFv結(jié)合EGFR-ECD配體的KD為10-6M的等級(jí)，而二價(jià)erb_scFv-Fc和三價(jià)erb—scFv-Col結(jié)合EGFR-ECD配體的KD分別為10々M和10力的等級(jí)(圖8和表3)。三價(jià)erb膠原蛋白支架抗體的親合力增加分別超過(guò)其二價(jià)和單價(jià)相似物近乎20和1000倍。尤其是，erb—scFv-Col的解離率常數(shù)(koff)為8.22xl(rV1，而erb_scFv-Fc的解離率常數(shù)(koff)為94.4xlO—V1，代表于三價(jià)形式對(duì)解離率顯示出11倍的改善。藉由流式儀分析，<吏用4元體置才奐分一斤(antibodydisplacementassay)以々包和濃度的OKT3-FITC(0.25|ag/ml)作為竟?fàn)幷?，?lái)測(cè)定對(duì)于和人類(lèi)CD3(+)T細(xì)胞細(xì)胞表面上CD3結(jié)合的OKT3—scFv-Col和OKT3IgG的功能親合力。所有下述的步驟皆在4。C下實(shí)施。將人類(lèi)T細(xì)胞于1x106細(xì)胞/ml的密度懸浮于FCM緩沖溶液中(包含具有2%胎牛血清和0.1。/。疊氮化鈉(sodiumazide)磷酸緩沖生理食鹽7JC)。以小鼠總、IgGs(totalIgGs)(2ng/ml,JacksonImmunoResearchLaboratories)處理細(xì)胞30分鐘，之后將細(xì)胞和連續(xù)稀釋的OKT3—scFv或OKT3抗體一起培養(yǎng)1小時(shí)。直接加入固定飽和量的FITC-連結(jié)的OKT3(0.25jig/ml,purchasedfromeBioscience，Inc.)的固定飽和量。在培養(yǎng)1小時(shí)后，將細(xì)胞以FCM緩沖溶液清洗以及藉由流式細(xì)胞儀于FACScan(BectonDickinson,SanJose,CA)上進(jìn)行免疫熒光分析。結(jié)果顯示為最大熒光強(qiáng)度的抑制百分比，其被定義為藉由將具有OKT3-FITC的T細(xì)胞進(jìn)行染色于缺少阻斷抗體(blockingantibodies)的情況下，所獲得的平均熒光強(qiáng)度。計(jì)算出各mAb抑制一半的最高熒光強(qiáng)度(IC50)所需的濃度。評(píng)估OKT3IgG和OKT3—scFv-Col對(duì)人類(lèi)CD3(+)T細(xì)胞的結(jié)合親合力為OKT3IgG為1.33nM，OKT3—scFv-Col為0.45nM。因此IQo值指三價(jià)OKT3IgG對(duì)于CD3(+)T細(xì)胞的親合力，為約大于二價(jià)OKT3IgG三倍(圖9)。此結(jié)果指出OKT3—scFv-Col結(jié)合至人類(lèi)CD3強(qiáng)于天然的鼠科OKT3mAb。因此，使用表面等離子共振技術(shù)獲得的結(jié)合分析結(jié)果和細(xì)胞結(jié)合分析展現(xiàn)和二價(jià)相似物相比，三價(jià)erb和OKT3CSA顯著改善了結(jié)合親合力。結(jié)合分析也顯示在納摩爾(nanomolar)的范圍中，本發(fā)明三價(jià)可溶抗體可顯現(xiàn)出結(jié)55合親合力。因此，以本發(fā)明可達(dá)成對(duì)于配體具有高親合力的可溶三聚抗體。實(shí)施例10穩(wěn)定性和藥物動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetic)分析為了血清穩(wěn)定性分析，藉由培養(yǎng)人類(lèi)血清于37。C來(lái)測(cè)量erb—scFv—Col、erb一scFv-Fc或erb—scFv的多種形式的穩(wěn)定性。藉由定量EILSA來(lái)測(cè)量在培養(yǎng)時(shí)間的不同時(shí)期之后存留的活化抗-EGFR的量。以使用重組EGFR-ECD(當(dāng)作捕才足試劑(capturereagent))和抗-c隱mycmAb(9E10，SigmaChemicalCo.),之后再以HRP結(jié)合的親合力純化的多林山羊抗小鼠IgG和化學(xué)發(fā)光受質(zhì)(chemiluminescentsubstrate)(PierceBiotechnology,Inc.)來(lái)執(zhí)行ELISA。為了藥物動(dòng)力學(xué)分析，使用三只BALB/c棵鼠來(lái)分析erb_scFv_Col清除(clearance)。簡(jiǎn)單而言，在事先采血之后，對(duì)每只小鼠皮下(subcutaneously，s.c,)注射25昭(2mg/體重Kg)的erb—scFv-Col。在接下來(lái)的70小時(shí)中，收集周期性的血液樣本并且藉由EILSA來(lái)評(píng)估它們erb—scFv—Col的含量。膠原蛋白區(qū)的三重螺旋結(jié)構(gòu)通常使膠原蛋白抵抗無(wú)特異性的蛋白分解酵。研究并且將erb—scFv-Col的穩(wěn)定性和erb—scFv-Fc和erb—scFv的穩(wěn)定性進(jìn)行比較，藉由于37。C在人類(lèi)血清中各自培養(yǎng)其各純化抗體的變異型于各種時(shí)間。藉由ELISA測(cè)定各種erb抗體的免疫反應(yīng)性(immunoreactivity)。如圖10A所示，erb_scFv-Col比erb—scFv-Fc更穩(wěn)定，于生理溫度下的人類(lèi)血清中培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)，仍保留其起始結(jié)合活性的60%。erb—scFv-Fc于人類(lèi)血清中快速降解，在培養(yǎng)1小時(shí)內(nèi)只保留少于其起始活性的40%。結(jié)果指出erb一scFv-Col的三重螺旋膠原蛋白樣肽和erb—scFv-Fc的Fc區(qū)比起erb—scFv更能抵抗血清蛋白質(zhì)分解酶的降解。因此，本發(fā)明的可溶三聚體抗體比起單體或二聚體抗體具有更高的血清穩(wěn)定性。圖10B顯示erb—scFv-Col于小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)的圖式。在單一靜脈內(nèi)給予2mg/kg的erb—scFv-Col后，測(cè)定兩間隔的模型的動(dòng)力學(xué)。免疫反應(yīng)性的血漿濃度(plasmalevel)以0.21小時(shí)的分布期半衰期(tl/2a)和4.78小時(shí)的末端排除期(terminaleliminationphase)半衰期(tl/2卩)雙形式(biphasically)降解。T細(xì)月包增殖(proliferation)分析和混合'淋巴細(xì)月包反應(yīng)(MixedLymphocyteReaction)實(shí)行溴化脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)細(xì)胞增殖分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將人類(lèi)外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell)置于黑色96孔平底組織培養(yǎng)板(flatbottomtissuecultureplate)中，在100pi包括10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中具有2x105細(xì)胞/孔，于37。C在10倍連續(xù)稀釋的OKT3(eBioscience,Inc.)或OKT3—scFv-Col存在下培養(yǎng)66小時(shí)。之后將細(xì)胞以10pM的BrdU進(jìn)行脈沖6小時(shí)。在移除培養(yǎng)基后，以FixDenat混合細(xì)胞和將DNA變性于一個(gè)步驟。之后將細(xì)胞和過(guò)氧化酶(peroxidase)標(biāo)定抗-BrdU抗體(anti-BrdUPOD,Fabfragments)于室溫一起培養(yǎng)1.5小時(shí)。使用微盤(pán)式發(fā)光儀(microplate-luminometer)(Hidex,CHAMELEONdetectionplatform,Finland沐進(jìn)行化學(xué)發(fā)光^r測(cè)和定量。于單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)評(píng)估T細(xì)胞增殖和免疫抑制(immunosuppression)，如下。/人兩個(gè)<建康的捐獻(xiàn)者(刺激者(stimulator)和反應(yīng)者(responder))獲得人類(lèi)外周血單核細(xì)胞。于37。C在包含5。/。0)2的潮濕的空氣中，以25嗎/ml絲裂霉素C(Sigma-Aldrich)于完全培養(yǎng)基(RPMI1640補(bǔ)充10%人類(lèi)AB血清(humanABserum)、2mM谷氨酰胺(glutamine)、50nM2-石克醇乙醇(2-mercaptoethano1)和青霉素(penicillin)和鏈霉素(streptomycin)各100單位/ml)處理刺激者或反應(yīng)者細(xì)胞30分鐘，接著在RPMI1640中清洗三次。將反應(yīng)者細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或和經(jīng)絲裂霉素C處理的刺激者或絲裂霉素C反應(yīng)者細(xì)胞以1:1的比例混合，以200|il的完全培養(yǎng)基中具有2x105細(xì)胞/孔進(jìn)行培養(yǎng)。在反應(yīng)者細(xì)胞置入后，立即以不同濃度加入經(jīng)純化的OKT3—scFv-Col或OKT3于培養(yǎng)基中。5天后將細(xì)胞以10(iM的BrdU進(jìn)行脈沖和在24小時(shí)后收取細(xì)胞。之后以上述方法進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。為了確認(rèn)是否OKT3—scFv-Col靠增加對(duì)于CD3(+)T細(xì)胞可存在大于其所源自的OKT3IgG的免疫抑制活性，OKT3—scFv-Col和OKT3IgG皆對(duì)T細(xì)胞有分裂活性處理于單方向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中。在混合的外周血單核細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)中(絲裂霉素C處理的刺激者和反應(yīng)者)，培養(yǎng)5天而沒(méi)有抗體處理，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)發(fā)展如同種異體(allogeneic)刺激的T細(xì)胞活化(圖11B,實(shí)心方框)。以O(shè)KT3IgG處理混合的外周血單核細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)，更進(jìn)一步刺激了T細(xì)胞的增殖(圖IIB，實(shí)心圓)。相對(duì)的，OKT3—scFv-Col在一劑量依據(jù)方法中抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，在100ng/ml的濃度達(dá)到背景程度(圖IIB，空心圓)。這些結(jié)果指出OKT3—scFv-Col，當(dāng)體外存在減低的有絲分裂，OKT3一scFv-Co1為T(mén)細(xì)胞增殖的的有效的免疫抑制劑。細(xì)胞因子測(cè)量藉由外延的T細(xì)胞受體(TCR)-CD3經(jīng)由結(jié)合具有FcR的細(xì)胞交聯(lián)而引起鼠科OKT3的有絲分裂。因此，最近已努力發(fā)展非有絲分裂形式的抗-CD3，藉由改變對(duì)Fc受體的結(jié)合。如膠原蛋白支架抗體分子的模型，藉由以膠原蛋白樣肽取代OKT3IgG的Fc區(qū)產(chǎn)生OKT3—scFv-Col以測(cè)試是否其為非有絲分裂。將人類(lèi)外周血單核細(xì)胞以在O.lml包括10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中具有2x105細(xì)胞/孔，于37。C在10倍稀釋的OKT3(eBioscience，Inc.)或OKT3—scFv-Col存在下進(jìn)行培養(yǎng)。收集懸浮物于不同的時(shí)間點(diǎn)，以及使用人類(lèi)細(xì)胞因子免疫分析試劑盒(eBioscience，Inc.)來(lái)測(cè)量多種細(xì)胞因子。測(cè)量OKT3IgG和OKT3—scFv-Col激發(fā)T細(xì)胞增殖和釋放發(fā)炎和其它細(xì)胞因子(IL-2、IFN-a和TNF-a)的能力。如預(yù)期，OKT3IgG在非常低的劑量即誘發(fā)T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生，但甚至高濃度OKT3一scFv-Co1仍無(wú)誘發(fā)可^r測(cè)的T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖IIA和12)。因此這些結(jié)果證明，不像OKT3IgG，OKT3—scFv-Col不具有T細(xì)胞活化特性。結(jié)果指出和鼠科OKT3IgG相比，給予OKT3—scFv-Col則產(chǎn)生可忽略的細(xì)胞因子釋放。這些結(jié)果證明于刺激T細(xì)胞增殖中，當(dāng)具有可忽略的有絲分裂活性時(shí)，OKT3—scFv-Col在免疫抑制T細(xì)胞增殖為更有效。因此本發(fā)明的三聚體可溶抗體具有減低的有絲分裂。通常，在抗癌和免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用中，膠原蛋白支架抗體對(duì)于治療性抗體設(shè)計(jì)而言為理想的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例11異源區(qū)對(duì)C端支架區(qū)的附著較早的研究報(bào)導(dǎo)可藉由體外2(TC下，III型膠原蛋白C端或N端鄰接至膠原蛋白樣肽的二硫群的氧化還原移動(dòng)步驟(redox-shufflingprocess)獲得鏈內(nèi)二硫鍵合(Gly-Pro-Pro)K)三重螺旋(Franketal.,(2003)JBiolChem278:7747-7750)。為了調(diào)查是否(Gly-Pro-Pro)K)可體內(nèi)驅(qū)動(dòng)C端融合配偶體的三聚體化，產(chǎn)生膠原蛋白支架抗體分子，Col-erb—scFv,其由N端合成膠原蛋白支架基因編碼序列為T(mén)CPPCPRSIP(GPP)1()GICDPSLC的肽和C端erb—scFv所組成(圖13A)。結(jié)果顯示純化的Col-erb_scFv具有依結(jié)構(gòu)特征，和在erb—scFv-Col中觀察到的相似，除了在Col-erb_scFv中的六聚體，少于erb—scFv-Col之外(圖13B)。因此(Gly-Pro-Pro),。肽可藉由自身驅(qū)動(dòng)scFv的N端或C端配偶體三聚體化。實(shí)施例12驅(qū)動(dòng)膠原蛋白支架抗體的需求產(chǎn)生膠原蛋白支架抗體分子，erb—scFv-GPP,o以證明膠原蛋白樣肽，包括(GPP)h)，藉由其可驅(qū)動(dòng)非共價(jià)鍵合三聚體融合蛋白質(zhì)的形成，而不需其它任何三聚體化區(qū)或鏈內(nèi)交聯(lián)氨基酸殘基(例如半胱氨酸和賴(lài)氨酸)的表達(dá)于其中的幫助或膠原蛋白樣區(qū)位于側(cè)邊。erb—scFv-GPP,o的編碼區(qū)包括erb—scFv的N端核苷酸序列和C端合成膠原蛋白基因，其編碼的序列為GSP(GPP)10GPSSGG的肽(第14A圖)。如圖14B所示，erb—scFv-GPPk)形成熱穩(wěn)定三聚體，具有和erb一scFv-Col的還原/烷基化鏈內(nèi)二硫鍵合結(jié)構(gòu)相似的熔點(diǎn)(圖6A)。其間，erb—scFv-GPP10保持對(duì)于EGFR-ECD的強(qiáng)的親合力，意指erb—scFv為正確地被折疊(圖14C)。實(shí)施例13具有不同膠原蛋白樣肽作為膠原蛋白區(qū)的膠原蛋白支架抗體分子的制備使用源自于Vectibix(panitumumab;Amgen，ThousandOaks，CA，USA)的scFv，一種治療性全人類(lèi)抗EGFRmAb來(lái)構(gòu)建兩種不同形式的膠原蛋白支架抗體763—scFv-Col和763CSA2，其分別具有不同的膠原蛋白樣肽，(GPP)10(圖15A)和(GPP)sGKPGKP(GPP)6(圖16A)做為支架區(qū)。由SDS-PAGE分析得知兩種膠原蛋白支架抗體皆配裝為三聚體(圖15B和16B)。在濃度和親源panitumumab相等時(shí)，763—scFv-Col有效阻止EGFR傳送信號(hào)(圖15C)。其間，763CSA2保持對(duì)EGFR(由人類(lèi)表皮癌A431細(xì)胞抹純化)的強(qiáng)親合力，意指erb—scFv被正確地折疊(第16C圖)。實(shí)施例14雙重特異性膠原蛋白支架抗體分子的制備產(chǎn)生雙重特異性膠原蛋白支架抗體分子，763CSAOKT3以證明自身三聚體化膠原蛋白支架為更多方面適用，其允許融合配偶體同時(shí)附著于兩端(圖17A)。藉由Western印跡檢驗(yàn)包含分泌的763CSAOKT3的培養(yǎng)基，59763CSAOKT3來(lái)自四種不同的穩(wěn)定復(fù)制。763CSAOKT3分子#:配裝成三聚體結(jié)構(gòu)，且其可更進(jìn)一步被聚合成六聚體，推測(cè)其藉由于兩個(gè)三聚體中的C端半胱氨酸的間的鏈內(nèi)二硫鍵交聯(lián)(圖17B)。在純化的后，于非還原環(huán)境下，763CSAOKT3的主要形式為三聚體(圖17C，第1泳道)。上述結(jié)果具有一個(gè)重要后果，如可展開(kāi)自身三聚體化膠原蛋白支架以構(gòu)建可同時(shí)和兩個(gè)龐大配偶體互相作用(每端具有結(jié)合數(shù)價(jià)至3或6)。如圖18所示，雙重特異性763CSAOKT3可與A431(具有EGFR)和人類(lèi)CD3(+)T細(xì)胞交聯(lián)。因此，763CSAOKT3可作為T(mén)細(xì)胞銜接器(engager),重新指導(dǎo)(redirecting)T細(xì)胞細(xì)胞毒性以抵抗各種EGFR表達(dá)的癌細(xì)胞。實(shí)施例15雙功能膠原蛋白支架抗體分子的制備產(chǎn)生雙功能膠原蛋白支架抗體分子，h4D5CSA-Luc，如圖19A所示。藉由層析純化包含分泌的h4D5CSA-Luc的培養(yǎng)基。h4D5CSA-Luc分子被配裝成三聚體結(jié)構(gòu)，且其可更進(jìn)一步被聚合成六聚體，推測(cè)其藉由于兩個(gè)三聚體中的C端半胱氨酸的間的鏈內(nèi)二硫鍵交聯(lián)(圖19B)。執(zhí)行生物熒光ELISA以證明h4D5CSA-Luc保持HER2/neu結(jié)合和生物焚光活性?xún)烧?。如圖19C所示，純化的h4D5CSA-Luc留存于以HER2/neu涂布的孔中，HER2/neu過(guò)量表達(dá)人類(lèi)卵巢SKOV-3癌細(xì)胞在濃度依據(jù)方法中保持活性以催化熒光素(coelenterazine)和發(fā)出光線(xiàn)。上述結(jié)果具有一個(gè)重要后果，如可展開(kāi)自身三聚體化膠原蛋白支架以構(gòu)建可與結(jié)合配偶體互相作用(每端具有結(jié)合數(shù)價(jià)至3或6)，且此相互作用可直接藉由將雙功能膠原蛋白支架抗體的C端熒光酶區(qū)和生物熒光受質(zhì)一起培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)。h4D5CSA-Luc可作為分子診斷或光學(xué)造影的試劑。實(shí)施例16抗TNF-a膠原蛋白支架抗體的制備將源自于雜交瘤357-101-4細(xì)胞抹(ECACCNo.92030603)的scFv,具有前中和活性的小鼠抗人類(lèi)TNF-amAb用于構(gòu)建膠原蛋白支架抗體分子，357scFv-Col。純化的357—scFv-Col具有和于scFv-Col觀察到的相似結(jié)構(gòu)特征(圖20)。比較357—scFv-Col和357IgG中和L929細(xì)胞的TNF-a誘發(fā)細(xì)胞凋亡(apoptosis)的程度。如圖20所示，357_scFv-Col具有的中和性約強(qiáng)于二價(jià)357IgG4倍。雖然本發(fā)明已以?xún)?yōu)選實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行些許的更動(dòng)和潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求書(shū)所界定者為準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)1.Bachinger，H.P.,Bruckner,P.,Timpl，R.，Prockop,D.J.和Engel，J.(1980).Foldingmechanismofthetriplehelixintype-Illcollagenandtype-IllpN-collagen.Roleofdisulfidebridgesandpeptidebondisomerization.EurJBiochem106，619-632.2.Berg，R.A.禾口Prockop，D.J.(1973).Thethermaltransitionofanon勿droxylatedformofcollagen.Evidenceforaroleforhydroxyprolineinstabilizingthetriple-helixofcollagen.BiochemBiophysResCommun52，115-120.3.Binz,H.K.，Amstutz,R,Kohl,A,，Stumpp,M.T"Briand，C.，F(xiàn)orrer,P.,Grutter，M.G.和Pluckthun,A.(2004).High-affinitybindersselectedfromdesignedankyrinrepeatproteinlibraries.NatBiotechnol22，575-582.4.Binz,H.K.,Amstutz，R和Pluckthun,A.(2005).Engineeringnovelbindingproteinsfromnonimmunoglobulindomains.NatBiotechnol23，1257-1268.5.Boudko，S,,Frank,S.，Kammerer,R.A.，Stetefeld,J.，Schulthess,T,,Landwehr,R.,Lustig,A.，Bachinger,H.R和Engel，J.(2002).Nucleationandpropagationofthecollagentriplehelixinsingle-chainandtrimerizedpeptides:transitionfromthirdtofirstorderkinetics.JMolBiol317,459-470.6.Carter,P.,Presta,L.，Gorman,C.M.,Ridgway,J.B.，Henner，D.,Wong,W.L.,Rowland,A.M.，Kotts,C.,Carver,M.E.和Shepard，H.M.(1992).Humanizationofananti-pl85HER2antibodyforhumancancertherapy.ProcNatlAcadSciUSA89,4285-4289.7.Chopra,R.K.和Ananthanarayanan，V.S.(1982).Conformationalimplicationsofenzymaticprolinehydroxylationincollagen.ProcNatlAcadSciUSA79，7180-7184.8.Chou,M.Y.禾口Li，H.C.(2002).GenomicorganizationandcharacterizationofthehumantypeXXIcollagen(COL21A1)gene.Genomics79，395-401.9.Dubel,S.,Breitling,F.,Konte腿nn，R.,Schmidt,T"Skerra,A.和Little,M.(1995).BifUnctionalandmultimericcomplexesofstreptavidinflisedtosingle-chainantibodies(scFv).JImmunolMethods178，201-209.10.Engd，J"Chen,H.T.，Prockop,D.J.和Klump，H.(1977).Thetriplehelixinequilibriumwithcoilconversionofcollagen-likepolytripeptidesinaqueousandnonaqueoussolvents.Comparisonofthethermodynamicparametersandthebindingofwaterto(L-Pro-L-Pro-Gly)nand(L-Pro-L-Hyp-Gly)n.Biopolymers16，601-622.11.Fietzek,P.P.和Kuhn,K.(1976).Theprimarystructureofcollagen.IntRevConnectTissueRes7，1-60.12.Frank,S.，Boudko,S.，Mizuno,K.,Schulthess，T.,Engel,J.和Bachinger,H.P.(2003).Collagentriplehelixformationcanbenucleatedateitherend.JBiolChem278,7747-7750.13.Frank,S.,Kammerer,R.A.,Mechling,D.,Schulthess,T"Landwehr，R.，Bann，J.,Guo,Y"Lustig,A.,Bachinger，H.P.和Engel,J.(2001).Stabilizationofshortcollagen-liketriplehelicesbyproteinengineering.JMolBiol308,1081-1089.14.Graversen,J.H.,Jacobsen，C.，Sigurskjold，B.W.，Lorentsen,R.H.,Moestrup,S.K.，Thogersen，H.C.和Etzerodt,M.(2000).Mutationalanalysisofaffinityandselectivityofkringle-tetranectininteraction.Graftingnovelkringleaffinityontpthetrtranectinlectinscaffold.JBiolChem275,37390-37396.15.Hakansson，K.，Lim,N.K"Hoppe,H.J.和Reid，K.B.(1999).Crystalstructureofthetrimericalpha-helicalcoiled匿coilandthethreelectindomainsofhumanlungsurfactantproteinD.Structure7，255-264,16.Hakansson,K.和Reid,K.B.(2000).Collectinstructure:areview.ProteinSci9,1607-1617.17.Harbury，P.B.,Zhang,T.,Kim,P.S.和Alber,T.(1993).Aswitchbetweentwo-，three-禾口four-strandedcoiledcoilsinGCN4leucinezippermutants.Science62262,1401-1407.18.Holler,N,，Tardivel,A.,Kovacsovics-Bankowski,M.,Hertig,S.，Gaide，O.,Martinon,F.,Tinel,A.,Deperthes,D.，Calderara,S.,Schulthess,T,，etal.(2003).TwoadjacenttrimericFasligandsarerequiredforFassignalingandformationofadeath-inducingsignalingcomplex.MolCellBiol23，1428-1440.19.Holliger，R和Hudson,P.J.(2005).Engineeredantibodyfragmentsandtheriseofsingledomains.NatBiotechnol23,1126-1136.20.Hoppe,H.J.,Barlow,RN.和Reid,K.B.(1994).Aparallelthreestrandedalpha-helicalbundleatthenucleationsiteofcollagentriple-helixformation,FEBSLett344，191-195.21.Ito，W.和Kurosawa,Y.(1993).DevelopmentofanartificialantibodysystemwithmultiplevalencyusinganFvfragmentfUsedtoafragmentofproteinA.JBiolChem268，20668-20675.22.Kivirikko,K.I"Myllyla,R.和Pihlajaniemi,T.(1992).Hydroxylationofprolineandlysineresiduesincollagensandotheranimalandplantproteins.InPost-TranslationalModificationsofProteins(Harding,J.J.和Crabbe,M.J.C.,Eds.).CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)L.,1-51.23.Li,H.C.,Huang,C.C.，Chen,S.F.和Chou，M.Y.(2005).AssemblyofhomotrimerictypeXXIminicollagenbycoexpressionofprolyl4-hydroxylaseinstablytransfectedDrosophilamelanogasterS2cells.BiochemBiophysResCommun336,375-385.24.Lynn，A.K.,Yannas,I.V.和Bonfield，W.(2004).Antigenicityandimmunogenicityofcollagen.JBiomedMaterResBApplBiomater71,343-354.25.Mazzorana,M.，Cogne,S.,Goldschmidt，D,和Aubert-Foucher，E.(2001).CollagenoussequencegovernsthetrimericassemblyofcollagenXII,JBiolChem276,27989-27998.26.Mohs,A.,Silva，T.,Yoshida,T"Amin,R.,Lukomski,S.，Inouye,M,和Brodsky，B.(2007).Mechanismofstabilizationofabacterialcollagentriplehelixintheabsenceofhydroxyproline.J.Biol.Chem.282,29757—29765.27.Nord，K.，Gunneriusson,E"Ringdahl,J.,Stahl，S.,Uhlen,M.和Nygren，P.A.(1997).Bindingproteinsselectedfromcombinatoriallibrariesofanalpha-helicalbacterialreceptordomain.NatBiotechnol15,772-777.28.Persikov,A.V.，Xu，Y.和Brodsky,B.(2004).Equilibriumthermaltransitionsofcollagenmodelpeptides.ProteinSci.13:893—902.29.Persikov,A.V"Ramshaw,J.A.M.，Kirkpatrick,A.，andBrodsky,B.(2000).Aminoacidpropensitiesforthecollagentriple-helix.Biochemistry39,14960-14967.30.Prockop,D.J.和Kivirikko,K.I.(1995》Collagens:molecularbiology,diseases和potentialsfortherapy.AnnuRevBiochem64，403-434.31.Queen,C.,Schneider,W.P.,Selick，H.E.,Payne,P.W.,Landolfi,N,F.,Duncan,J.F.,Avdalovic,N.M,，Levitt,M.,Junghans，R.P.和Waldmann,T.A.(1989).Ahumanizedantibodythatbindstotheinterleukin2receptor.ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033.32.Rheinnecker，M.，Hardt，C.，Ilag，L.L.,Kufer,P"Gruber,R.，Hoess,A.,Lupas,A.,Rottenberger,C.，Pluckthun,A.和Pack,P.(1996》Multivalentantibodyfragmentswithhighfunctionalaffinityforatumor-associatedcarbohydrateantigen.JImmunol157，2989-2997.33.Riechmann,L.,Clark,M.，Waldmann,H,和Winter,G.(1988).Reshapinghumanantibodiesfortherapy.Nature332,323-327.34.Rosenbloom，J,,Harsch,M.和Jimenez,S.(1973).Hydroxyprolinecontentdeterminesthedenaturationtemperatureofchicktendoncollagen.ArchBiochemBiophys158,478-484.35.Sakakibara,S.,I匪ye，K.,Shudo,K.，Kishida,Y.，Kobayashi,Y.和Prockop，D.J.(1973).Synthesisof(Pro-Hyp-Gly)nofdefinedmolecularweights.Evidenceforthestabilizationofcollagentriplehelixbyhydroxypyroline.BiochimBiophysActa303,198-202.36.Shaw,L.M.和Olsen,B.R.(1991》FACITcollagens:diversemolecularbridgesinextracellularmatrices.TrendsBiochemSci16，191-194.37.Sheriff,S.,Chang,C.Y.和Ezekowitz,R.A.(1994).Humanmannose隱bindingproteincarbohydraterecognitiondomaintrimerizesthroughatriplealpha-helicalcoiled-coil.NatStructBiol1,789-794.38.Skerra,A.(2000).Lipocalinsasascaffold.BiochimBiophysActa1482,64337-350.39.Weis,W.I.和Drickamer,K.(1994).TrimericstructureofaC隱typemannose-bindingprotein.Structure2,1227-1240.40,Yang,W"Chan，V.C.，Kirkpatrick,A.,Ramshaw，J.A.和Brodsky,B.(1997).Gly-Pro-ArgconfersstabilitysimilartoGly-Pro-Hypinthecollagentriple-helixofhost-guestpeptides.JBiolChem272，28837-28840.序列表<110>財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院<120>三聚體可溶抗體與其產(chǎn)生及使用的方法〈160〉18<210〉1〈211>242<212〉蛋白質(zhì)〈213〉人工序歹lj(artificialsequence)<400>1應(yīng)VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSY馬群RQAPGKGLEWVSDIGASGSAT60SYADSVKGRFTIS畫(huà)S匿LYLQ麗SLRAEDTAVYYCAKSTTTFDYWGQGTLVTVSSGG120GGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKL180LIYDASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYADYPTTFGQGTKVEI240KR242〈210〉2〈211〉726〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2atggccgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctg60agactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagct3tgCC3tg3gctgggtccgc120caggctccagggaaggggctggagtgggtctcagatattggtgcttctggttctgctaca180tcttacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacg240ctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaa300tctactactacttttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagcggtgga360ggcggttcaggcggsggtggcagcggcggtggcgggtcgacggacatccagstgscccag420tctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaeigt480cagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctc540ctgatctatgatgcatccgctttgcaaagtggggtcccatcaeiggttcagtggcagtgga600tctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttac660tactgtcaacagtatgctgattatcctactacgttcggccaagggaccaaggtggaaatc720a肌cgg726〈210〉3<211〉240〈212〉蛋白質(zhì)〈213〉人工序列〈400〉3VQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYN60QKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDD跳LDYWGQGTTVTVSSGG120GGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSY麗WYQQKSGTSP訓(xùn)I180YDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLELKR240〈210〉4〈211〉720〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉4gtccagctgcggctg咖tggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcc60tgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcct120ggac鄉(xiāng)gtctgg3atgg3ttggatacattaatcctagccgtggttatac180cagaagttcaagg織aggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatg240caactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaag300gatcattactgccttgactactggggcc犯gggaccacggtcaccgtctcctcaggtgga360ggcggttcaggcggsggtggctctggcggtggcggatcggacattgtgctaacccagtct420ccagcaatcatgtctgcatctCC3gggg3gaaggtcaccatgacctgcagtgccagctca480ELgtgt^gttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctccccc^aagatggatt540tatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctggg600acctcttactctctcacaatC3gCggC3tgatgctgccacttattactgc660cagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagctga_aacga_720<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉10gaaattgtgctgacccagtctccaccgatcatgtctgcttctccaggggagaaggtcacc60atgacctgcagtgccagctcaagtgtaagtttcatgtactggtsccagcagaagccagga120tcctcccccagactcctgatttatg3cgcatccatcctggcttctggagtccctgttcgc180ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctg犯240gatgttgccacttattactgccaacaatggagtgattactcacccaggacgttcggtgga300ggcaccaagctggaaattgggggsggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcgga360tcggtg肌actgcagg叫tctggagg鄉(xiāng)ctgggtgc肌cCtgg3gg8tCcatgaaactc420tcctgtattgcctctggattcactttcagttg認(rèn)tgggtccgccagtct480cc卿g卿gggcttgagtgggttgctg肌gttagattgcaatctgataatttt3C肌CSL540csttatgcggagtctgtgaa鄉(xiāng)gaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtggt600gtctacctgc^3tga3caacttaggagctgcatttattattgtaccccg660tttgcttattggggcc卿ggaccacggtcaccgtctcct702〈210〉11〈211〉73〈212〉蛋白質(zhì)〈213>人工序列〈400〉11EPKSCDKTHTCPPCPRSIPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGICDPSLCFSV60IARRDPFRKGPNY73〈210〉12〈211〉219〈212〉DNA<213〉人工序列〈400>12gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaagatctattcctggg60ccaxxtggtcccccaggtcctccaggacccccagggcccccaggcccccccgggccgcct120<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>cccccagggcccccaggcccccccgggccgcctggacccccagggccaccaggcccccca120ggcatctgcgacccatcactatgt144〈210〉17〈211〉66〈212〉蛋白質(zhì)<213〉人工序列〈400〉17EPKSGDKTHTCPPCPRSIPGPPGPPGPPGPPGPPGKPGKPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGI60CDPSLC66<210>18<211>198〈212〉DNA<213>人工序列<400〉18gagcccaaatctggtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaagatctattcctggg60ccacctggtcccccaggtcctccaggacccccagggcccccaggtaaacctggaaaacca120gggcccccaggcccccccgggccgcctggacccccagggccaccaggccccccaggcatc180tgcgacccatcactatgt198權(quán)利要求1.一種三聚體可溶抗體，至少包含三條多肽，其中各條多肽至少包括(a)由至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列所構(gòu)成的膠原蛋白支架區(qū)；其中G為甘氨酸，X與Y為任意氨基酸，其中至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O，其中至少6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-O，并且其中P為脯氨酸而O為羥脯氨酸；以及(b)抗體區(qū)；其中所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)互相作用而形成該三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少107M-1的親合力，特異性結(jié)合至配體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)CD3。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)TNF-a。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三聚體可溶抗體，其中該三聚體可溶抗體具有雙重特異性，并以至少1(^M"的親合力，特異性結(jié)合至該人類(lèi)CD3。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該多肽還包括標(biāo)記多肽的編碼序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的三聚體可溶抗體，其中該標(biāo)記多肽為熒光酶多肽或綠色熒光多肽。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該膠原蛋白支架區(qū)包括(G-P-P/0)k)的序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中所有G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該膠原蛋白區(qū)包括(G-P-P/0)5GKPGKP(G-P-P/0)6的序列。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體，其中該各條多肽包括兩個(gè)抗體區(qū)。12.—種核酸，含有可產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體的基因編碼。13.—種表達(dá)載體，當(dāng)將其并入宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚體可溶抗體。14.一種宿主細(xì)胞，包括根據(jù)權(quán)利要求13所述的表達(dá)載體。15.—種產(chǎn)生三聚體可溶抗體的方法，包括(a)將含有膠原蛋白支架區(qū)基因碼的第一核酸，讀框融合(in-framefusion)至含有抗體區(qū)基因碼的第二核酸，其中該膠原蛋白支架區(qū)包括10-30個(gè)G-X-Y重復(fù)序列(G為甘氨酸，X與Y則為任意氨基酸)，且至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P;以及(b)利用細(xì)胞表達(dá)由該膠原蛋白支架區(qū)與該抗體區(qū)所構(gòu)成的重組蛋白復(fù)合物，該細(xì)胞可將至少6個(gè)G-P-P中位于Y位置的P予以羥脯氨酸化；其中，所述三條多肽上經(jīng)羥脯氨酸化后的膠原蛋白支架區(qū)，彼此交互反應(yīng)形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少1(^M"的親合力，特異性結(jié)合至配體。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的產(chǎn)生三聚體可溶抗體的方法，其中該配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體、人類(lèi)CD3或人類(lèi)TNF-a。17.—種調(diào)節(jié)配體的生物活性的方法，包括將三聚體可溶抗體與該配體一起培養(yǎng)，而該三聚體可溶抗體包括三條多肽，其中各條多肽包括(a)膠原蛋白支架區(qū)，包括至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列；其中G為甘氨酸，X與Y為任意氨基酸，其中至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O，其中至少6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-O，并且其中P為脯氨酸，而O為羥脯氨酸；以及(b)抗體區(qū)，其中所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)相互作用而形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少1(^M"的親合力特異性結(jié)合至配體，其中該特異性結(jié)合調(diào)節(jié)了該配體的生物活性。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的調(diào)節(jié)配體的生物活性的方法，其中該配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體、人類(lèi)CD3或人類(lèi)TNF-a。19.一種沖企測(cè)配體的方法，包括(1)將三聚體可溶抗體與該配體一起培養(yǎng)，該三聚體可溶抗體包括三條多肽，其中各條多肽包括(a)膠原蛋白支架區(qū)，包括至少I(mǎi)O個(gè)G-X-Y重復(fù)序列；其中G為甘氨酸，X與Y為任意氨基酸，其中至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-P或G-P-O,其中至少6個(gè)G-X-Y重復(fù)序列為G-P-O,并且其中P為脯氨酸，而O為羥脯氨酸；以及(b)抗體區(qū)，其中所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)互相作用而形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少1(^M"的親合力特異性結(jié)合至配體；以及(2)檢測(cè)該三聚體可溶抗體對(duì)該配體的結(jié)合。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的檢測(cè)配體的方法，其中所述各條多肽包括熒光酶多肽或綠色熒光多肽。21.—種三聚體可溶抗體，包括三條多肽，其中各條多肽包括(a)膠原蛋白支架區(qū)，包括至少10個(gè)G-X-Y重復(fù)序列；其中G為甘氨酸，X與Y為任何氨基酸，其中至少6個(gè)位于Y位置的氨基酸為羥脯氨酸；以及(b)抗體區(qū)，其中所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)互相作用而形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少107M"的親合力特異性結(jié)合至配體。22.根據(jù)權(quán)利要束21所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)CD3。24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)TNF-a。25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的三聚體可溶抗體，其中該多肽還包括標(biāo)記蛋白的序列。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的三聚體可溶抗體，其中該標(biāo)記蛋白為熒光酶多肽或綠色熒光多肽。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的三聚體可溶抗體，其中該三聚體可溶抗體包括SEQIDNO:7。28.—種三聚體可溶抗體，包括三條多肽，其中各條多肽包括(a)膠原蛋白支架區(qū)，包括至少6個(gè)G-P-O重復(fù)序列；其中G為甘氨酸，P為脯氨酸，而O為羥脯氨酸；以及(b)抗體區(qū)，其中所述三條多肽的膠原蛋白支架區(qū)互相作用而形成三聚體可溶抗體，該三聚體可溶抗體以至少107M"的親合力特異性結(jié)合至配體。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子受體。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)CD3。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的三聚體可溶抗體，其中該配體為人類(lèi)TNF-a。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的三聚體可溶抗體，其中該多肽還包括標(biāo)記蛋白的序列。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的三聚體可溶抗體，其中該標(biāo)記蛋白為焚光酶多肽或綠色熒光多肽。全文摘要本發(fā)明涉及膠原蛋白支架，其中此支架包含可自我形成三聚體化(self-trimerization)的膠原蛋白(collagenous)區(qū)或膠原蛋白樣(collagen-like)區(qū)。當(dāng)一個(gè)或多個(gè)異源(heterologous)區(qū)，例如抗體區(qū)，與此膠原蛋白支架相互融合成一蛋白質(zhì)復(fù)合物(complex)，該膠原蛋白支架可驅(qū)動(dòng)異源區(qū)的三聚體化。本發(fā)明亦揭露產(chǎn)生與利用此蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法。文檔編號(hào)C07K19/00GK101445559SQ20081018127公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2008年11月18日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者周民元,李秀娟,范佳玉,黃娟娟申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院