專利名稱：日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白及其篩選方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及聯(lián)合蛋白質(zhì)學(xué)技術(shù)和血清學(xué)技術(shù)篩選日本血 吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白并以此作為日本血吸蟲病診斷的潛在靶點(diǎn)，尤其涉 及一種日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白及其篩選方法和用途。
背景技術(shù)：
血吸蟲病作為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題是世界上僅次于瘧疾的第二大寄生蟲 病。血吸蟲病歷史悠久分布廣泛，嚴(yán)重影響著人類的健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。估計(jì)全世界 有76個(gè)國家和地區(qū)流行血吸蟲病，被感染的人口達(dá)2億，受威脅人群5-6億，其中有癥狀的 約1. 2億，重癥和傷殘人數(shù)約2000萬，每年死亡2萬，嚴(yán)重影響著人類的健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的 發(fā)展。但是由于該病主要是在發(fā)展中國家的貧困地區(qū)流行，所以在很大程度上一直處于被 忽視的地位。日本血吸蟲作為三大主要血吸蟲之一，主要在中國以及東南亞等國家流行。血吸 蟲病的診斷在血吸蟲病防治活動(dòng)中處于中心環(huán)節(jié)，它是尋找并確定指示血吸蟲在機(jī)體存在 的直接或間接證據(jù)，為血吸蟲感染的臨床診斷提供依據(jù)。通過診斷結(jié)果還可以了解疾病的 傳播情況，有可能在感染的初期及時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨即采取相應(yīng)的措施有效地控制疾病的大規(guī)模 傳播。免疫學(xué)診斷方法因具有良好的特異性、敏感性以及實(shí)用性等優(yōu)點(diǎn)，而成為血吸蟲疫區(qū) 篩查目標(biāo)人群的一種有力的流行病學(xué)工具。另一方面，吡喹酮作為日本血吸蟲病目前唯一 有效的治療藥物被廣泛地用于現(xiàn)場防治中，化療也成為重要的血吸蟲病防治措施。但是由 于長期大規(guī)模的使用可能誘導(dǎo)血吸蟲產(chǎn)生抗藥性。療效考核和規(guī)范用藥是延緩抗藥性產(chǎn)生 的重要手段。目前，已有的診斷方法均不能有效區(qū)分現(xiàn)癥感染病人和吡喹酮治愈病人，不能 有效指導(dǎo)規(guī)范用藥，評(píng)價(jià)治療效果。因此，尋找具有療效考核價(jià)值的診斷抗原具有重要的現(xiàn)
眉、^C ο蟲卵是日本血吸蟲致病的主要原因，蟲卵抗原在調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)針對(duì)寄生蟲 S4J ^^^MBt^'MTM^M^ [Pearce EJ, MacDonald AS. Theimmunobiology of schistosomiasis. Nat Rev Immunol. 2002,2 :499-511]，有證據(jù)顯示化療后能在患者體內(nèi) 引起一系列血吸蟲特異性抗體水平的改變，尤其是可以引起特異性的抗蟲卵抗體水平的 變化[Mutapi F, Ndhlovu PD, et al. Changes in specific anti-egg antibody levels following treatment withpraziquantel for Schistosoma haematobium infection in children. Parasite Immunol. 1998,20 :595-600],吡喹酮還能改變可溶性蟲卵抗原 相關(guān)的免疫反應(yīng)[Martins-Leite P，Gazzinelli G，et al. Effect of chemotherapy withpraziquantel on the production of cytokines and morbidity associated withschistosomiasis mansoni. Antimicrob Agents Chemother. 2008，52 :2780-2786]，這 些抗體水平可以反應(yīng)宿主體內(nèi)現(xiàn)有的抗原水平。血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)是血清學(xué)診 斷中最為常用的抗原。但是粗抗中成分復(fù)雜，會(huì)對(duì)免疫診斷的特異性造成一定影響。而且大多數(shù)中國現(xiàn)場使用的免疫學(xué)診斷方法證明血吸蟲特異性抗體在患者治愈后至少一年內(nèi) 都維持一個(gè)高水平，在很多情況時(shí)間甚至更久，由此也導(dǎo)致了在糞檢蟲卵中的陰性病人經(jīng) 過血清學(xué)檢測后得到陽性結(jié)果，無法區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染的患者。
近期，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及代謝組等在內(nèi)的組學(xué)研究已經(jīng)成為了生 物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。組學(xué)研究的主要優(yōu)勢在于可以利用高通量的 實(shí)驗(yàn)技術(shù)而獲得信息量龐大的數(shù)據(jù)?；蚪M和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成果也為免疫組學(xué)研究 帶來了契機(jī)，免疫組學(xué)特別強(qiáng)調(diào)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，充分利用生物信 息學(xué)、生物芯片、系統(tǒng)生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、高通量篩選等技術(shù)，大規(guī)模開展免疫系統(tǒng)和免疫 應(yīng)答分子機(jī)理研究，發(fā)現(xiàn)新的免疫相關(guān)分子，為全面系統(tǒng)了解免疫系統(tǒng)和免疫應(yīng)答提供基 礎(chǔ)。基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的逐步釋放，尤其是2009年日本血吸蟲和曼氏血吸蟲基因組草圖 的公布，為利用質(zhì)譜鑒定血吸蟲蛋白質(zhì)提供了強(qiáng)有力的支撐。人們也用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分 析鑒定了大量血吸蟲生物學(xué)相關(guān)以及寄生蟲-宿主相互作用的蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 和血清學(xué)技術(shù)的結(jié)合則成為了鑒定血吸蟲蛋白中的抗體靶點(diǎn)中的一個(gè)有效工具。研究者借 助這一工具分析鑒定了埃及血吸蟲病患者治愈前后血清中成蟲抗原性蛋白質(zhì)組分[Mutapi F，Burchmore R，Mduluza T，et al. Praziquanteltreatment of individuals exposed to Schistosoma haematobium enhancesserological recognition of defined parasite antigens. J Infect Dis，2005，192 :1108-1118]以及牛血吸蟲成蟲膜蛋白及排泄分泌產(chǎn)物 [Perez-Sanchez R，Ramajo-Hernandez A，et al. Proteomic analysis of the tegument andexcretory-secretory products of adult Schistosoma bovis worms·]，包括糖酵角軍 相關(guān)的酶、分子伴侶以及肌肉蛋白等。但是，目前對(duì)于日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的免疫組 學(xué)研究還未見相關(guān)報(bào)道。了解吡喹酮對(duì)于日本血吸蟲蟲卵抗原組分的影響會(huì)有助于更好的 了解血吸蟲蟲卵相關(guān)的致病機(jī)理以及宿主-寄生蟲之間的相互作用，同時(shí)也可以為日本血 吸蟲病診斷靶點(diǎn)的選擇提供參考依據(jù)，滿足我國血吸蟲病防治現(xiàn)場應(yīng)用的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是鑒定日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性 蛋白組分，并以此作為日本血吸蟲病診斷的潛在靶點(diǎn)。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供上述日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫 原性蛋白的篩選方法，即聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和血清學(xué)方法篩選日本血吸蟲可溶性蟲卵抗 原中的免疫原性蛋白。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供上述日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫 原性蛋白的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，篩選一組日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，該 免疫原性蛋白選自SEQ ID NO :2-SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。日本血吸蟲重要可溶性蟲卵抗原(P40，編號(hào)=GI =226477156)的序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種上述日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性 蛋白的篩選方法，包含如下步驟
1)制備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原；2)將步驟1)制備的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原進(jìn)行雙向電泳分離，得到雙向凝 膠電泳圖譜；3)將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向電泳膠進(jìn)行免疫印跡雜交(Western blot)，再分別用加入適量吡喹酮治療前后日本血吸蟲病人的血清作為一抗與NC膜進(jìn)行反 應(yīng)；4)重復(fù)步驟2)和3)以確保結(jié)果的正確，從與治療前后血清反應(yīng)顯色后的NC膜上 挑出反應(yīng)強(qiáng)烈的點(diǎn)以及差異明顯的點(diǎn)，然后再反饋到相應(yīng)的雙向凝膠電泳圖譜上，選出與 NC膜對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)；5)對(duì)步驟4)選出的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜鑒定的日本血吸蟲蟲卵肽段 序列與日本血吸蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到一批日本血吸蟲蟲卵抗原中的免疫原性蛋白。步驟1)具體為日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹感染新西蘭兔，42天后將兔剖殺，取感染兔 的肝臟，剪碎后勻漿，銅篩過濾淘洗，離心分離蟲卵及兔肝臟碎片，收集干凈的蟲卵，用生理 鹽水清洗后置于液氮中保存。步驟2)具體為A)用等電聚焦儀進(jìn)行第一向等電聚焦，在20°C自動(dòng)進(jìn)行IPG干膠條水化和等電聚 焦，程序設(shè)置為30 ν 12h、500 ν IhUOOO ν lh、8000 ν 6h、500 ν 4h ；B)等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條在平衡緩沖液中，于搖床上振蕩平衡兩次，其中第 一種平衡液含二硫蘇糖醇，第二種平衡液由2. 5%碘乙酰胺取代；C)取出平衡后的膠條，重蒸水沖洗，濾紙吸干多余水分，在Hofer SE 600垂直電 泳槽上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用厚度為1. 0mm、濃度12. 5 %的聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳條 件先30mA/膠恒流電泳30min，然后加大到60mA/膠恒流電泳至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)膠最底端 0. 5cm為止；D)凝膠采用銀氨法，按蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行硝酸銀染色，固定lh， 敏化Ih，清洗池，銀染45min，清洗3次，每次3min，顯色5min，終止15min，獲得雙向凝膠電 泳圖譜。步驟3)具體為A)將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向電泳膠進(jìn)行Wfestern blot，進(jìn)行蛋白質(zhì)電 轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜完成后，把凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否完全；把濾膜染 色5-10分鐘，蛋白條帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗NC膜數(shù)次，至水不再變色，在NC膜 上做好標(biāo)記；B)加入適量的封閉液室溫下反應(yīng)過夜；次日，將已封閉好的NC膜沿著與標(biāo)記垂直 的方向切下合適寬度的條帶，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次；C)分別加入適量的吡喹酮治療前后日本血吸蟲病人混合血清以及非疫區(qū)正常人 混合血清，室溫下與NC膜反應(yīng)濁；D)棄去一抗，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG,室溫反應(yīng)Ih ；用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，用DAB顯色，出現(xiàn)條帶后，終
止反應(yīng)。
步驟5)具體為A)先切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)處的凝膠，再用重碳酸胺洗滌膠片，然后用乙腈抽提、再進(jìn) 行還原和烷基化。最后利用胰酶過夜進(jìn)行膠內(nèi)酶解，再用含三氟乙酸的60%乙腈抽提 三次，收集提取物低壓凍干；B)抽提的樣品與基質(zhì)進(jìn)行等量混合進(jìn)行肽指紋圖譜分析，儀器參數(shù)設(shè)定為發(fā) 射模式，200個(gè)集成光束，離子源電壓為Ι-Wkv，離子源為2-16. 27kv，延遲100納秒和 600-3500m/z的離子門；C)可溶性抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)的的肽指紋圖譜利用MS-FIT和Mascot軟件對(duì) SffISS-PROT和NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢分析。在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋 白作為日本血吸蟲病診斷靶點(diǎn)的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和血清學(xué)方法篩選血吸蟲病 診斷靶點(diǎn)，具體涉及利用雙向電泳、Western blot (2D-WB)以及質(zhì)譜的方法分析日本血吸蟲 可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，并以此作為日本血吸蟲病診斷的潛在靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明， 篩選出的這批免疫原性蛋白具有一定的診斷價(jià)值，可作為日本血吸蟲病的診斷靶點(diǎn)。


圖1是日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向凝膠電泳圖譜；圖2是日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原2D-WB (Western blot)分析示意圖；其中，圖2A 表示治療前血清；圖2B表示治療后血清；圖3是正常人血清對(duì)照示意圖(相對(duì)于圖2)；圖4是日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原雙向電泳圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)選取示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1篩選日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白一 .雙向電泳聯(lián)合Wfest blot的詳細(xì)步驟如下1.采集日本血吸蟲病患者吡喹酮治療前后血清。以血吸蟲病流行區(qū)安徽省安慶 市大觀區(qū)廟嶺村為現(xiàn)場調(diào)查點(diǎn)，采集實(shí)驗(yàn)所需要的血清樣本。隨機(jī)選擇該村常住居民為研 究對(duì)象，對(duì)其連續(xù)2天重復(fù)收集共2次新鮮糞樣，按Kato-Katz糞便厚涂片檢查法[Katz N，Chaves A，Pellegrino J. A simpledevice for quantitative stool thick-smear technique in Schistosomiasismansoni. 1972，Rev Inst Med Trop Sao Paulo 14 397-400]制作6張糞量為41. 7mg的涂片(二送六檢)，用浸有含孔雀綠透明液的透明玻璃 紙覆蓋并壓平，透明24h后鏡檢計(jì)數(shù)，讀片采用2人雙盲法讀片，再隨機(jī)選取15%的涂片由 第三為鏡檢人員復(fù)檢蟲卵計(jì)數(shù)，確保誤差在5%以內(nèi)，以進(jìn)行鏡檢質(zhì)量控制。感染度以每克 糞蟲卵數(shù)(EPG)表示，EPG = 6張涂片蟲卵的合計(jì)乘以4。然后對(duì)Kato-Katz 二送六檢的 陰性者進(jìn)行尼龍絹集卵孵化法糞檢，2送6檢，在25士3°C的溫度條件下孵化，孵化水用去氯 水，PH為7. 4左右，孵化后3、5、10小時(shí)各觀察一次毛蚴，陰性者12小時(shí)后再觀察一次，記錄結(jié)果。只要單次或6次重復(fù)加藤法和糞孵法任何一種檢測結(jié)果為陽性或均為陽性都判斷 為陽性結(jié)果。在征得上述兩種方法初始篩查后的陽性病人同意后，對(duì)他們進(jìn)行吡喹酮口服 治療，劑量為標(biāo)準(zhǔn)用量40mg/kg。在服藥五個(gè)月后再次用兩種方法篩查這批患者，將陰性結(jié) 果的人血清收集起來。在收集血清的同時(shí)也記錄包括村民姓名、性別、出生年月、職業(yè)、接觸 疫水方式等在內(nèi)的流行病學(xué)資料。2.可溶性蟲卵抗原的制備1000條日本血吸蟲尾蚴(安徽株)經(jīng)腹感染新西蘭 兔(日本血吸蟲尾蚴由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所釘螺房提供，新西蘭兔 購自于上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場)，42天后將兔剖殺，取感染兔的肝臟，剪刀剪碎后勻 漿，500目銅篩過濾淘洗，！^call分離液800g離心分離蟲卵及兔肝臟碎片，收集干凈的蟲 卵，用生理鹽水清洗后置于液氮中保存。3.將制備好的可溶性蟲卵抗原進(jìn)行雙向電泳分離，同時(shí)制備三張相同的雙向電 泳分離膠，其中每張膠的上樣量為800 μ g SEA，依次計(jì)劃在后續(xù)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中分別和治 療前血清、治療后血清以及正常人血清反應(yīng)。雙向電泳操作步驟如下用Ettan IPGphor 等電聚焦儀(Amersham，Piscataway，NJ)進(jìn)行第一向等電聚焦，主要IPGphor等電聚焦系 統(tǒng)指南禾口 Gorg 等[GorgA, Obermaier C, et al. The current state of two-dimensional electrophoresiswith immobilized pH gradients.Electrophoresis. 2000, 21 1037-1053]的方法進(jìn)行。在20°C自動(dòng)進(jìn)行IPG(pH3-10非線性膠條)干膠條水化和等 電聚焦，上樣量 100μ g。程序設(shè)置為30 ν 12h、500 ν IhUOOO ν lh、8000 ν 6h、500 ν 4h。等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條在平衡緩沖液中，于搖床上振蕩平衡兩次15minX2次， 其中第一種平衡液含二硫蘇糖醇(DTT)，第二種平衡液由2. 5%碘乙酰胺(IAA)取代。 取出平衡后的膠條，重蒸水沖洗，濾紙吸干多余水分，在Hofer SE 600垂直電泳槽上進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，用厚度為1. 0mm、濃度12. 5%的聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳條件先30mA/膠 恒流電泳30min，然后加大到60mA/膠恒流電泳至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)膠最底端0. 5cm為止。凝 膠參考 Hochstrasser 等人[Hochstrasser DF, PatchornikA, Merril CR. Development of polyacrylamide gels that improve theseparation of proteins and their detection by silver staining. Anal Biochem. 1998，173 :412-423]的銀氨法，按蛋白質(zhì)銀染試劑盒 的操作手冊(cè)進(jìn)行硝酸銀染色，固定lh，敏化lh，清洗池，銀染45min，清洗3次，每次3min，顯 色5min，終止15min，獲得雙向凝膠電泳圖譜。4.將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向電泳膠進(jìn)行Wfestern blot (蛋白免疫印 跡雜交)，連接電源，0. 22A，冰浴下進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，約1. 可完成電轉(zhuǎn)移。5.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜完成后，斷開電源，小心拆卸轉(zhuǎn)移裝置。把凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色， 檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否完全。把濾膜轉(zhuǎn)移到含有麗春紅S工作液的托盤中染色5-10分鐘，蛋 白條帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗NC膜數(shù)次，至水不再變色。用防水筆在NC膜上做好 標(biāo)記。6.加入適量的封閉液(3%的BSA)室溫下反應(yīng)過夜，封閉可能結(jié)合非相關(guān)蛋白的 位點(diǎn)，從而降低非特異性結(jié)合背景。7.次日，將已封閉好的NC膜置于干凈的玻璃板上，沿著與Marker(SE)垂直 的方向切下合適寬度的條帶。用PBST(PBS溶液加上Tween-20.，PBS溶液是指磷酸緩沖液 (Phosphate Buffer Solution))漂洗NC膜3次，再用TBS (Tris緩沖鹽溶液)漂洗1次。
8.分別加入適量的PZQ (吡喹酮)治療前后病人混合血清以及非疫區(qū)正常人混合 血清，室溫下與NC膜反應(yīng)2h。9.甩去一抗，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，每次lOmin。加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(Sigma)，室溫反應(yīng)lh。10.用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次。用DAB顯色，出現(xiàn)條帶后，終止反應(yīng)。11.雙向電泳和免疫印跡再重復(fù)兩次以確保結(jié)果的正確，從與治療前后血清反應(yīng) 顯色后的NC膜上挑出反應(yīng)強(qiáng)烈的點(diǎn)以及差異明顯的點(diǎn)，然后再反饋到相應(yīng)的雙向電泳圖 譜上，找出與NC膜對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，做好標(biāo)記。12.利用基質(zhì)輔助激光解析離子化串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-T0F/T0F)分析日 本血吸蟲可溶性蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽指紋圖譜數(shù)據(jù)。此項(xiàng)工作是由中科院上海生科院蛋白質(zhì)組研 究分析中心完成的。具體操作為先切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)處的凝膠，再用重碳酸胺洗滌膠片， 然后用乙腈抽提、再進(jìn)行還原和烷基化。最后利用胰酶過夜進(jìn)行膠內(nèi)酶解，再用含三氟 乙酸的60%乙腈抽提三次，收集提取物低壓凍干。抽提的樣品與基質(zhì)進(jìn)行等量混合進(jìn)行肽 指紋圖譜分析。儀器參數(shù)設(shè)定為發(fā)射模式，200個(gè)集成光束，離子源電壓為l_19kv，離子源 為2-16. 27kv，延遲100納秒和600-3500m/z的離子門。可溶性抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)的的肽指紋圖 譜利用MS-FIT和Mascot軟件對(duì)SWISS-PR0T和NCBhr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢分析。二 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過雙向電泳分離，我們獲得了重復(fù)性較好，分辨率較高的的日本血吸蟲日本血 吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向電泳圖譜(圖1)。這些蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量分布范圍較廣， 圖1中從左至右為等電點(diǎn)增加(pH 3-10)，從上至下位分子量增加(90kDa-17kDa)。為了能夠確定在日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中有哪些蛋白可以被吡喹酮治療前 后患者的混合血清識(shí)別，我們將上述的雙向電泳膠進(jìn)行了 Western blot轉(zhuǎn)膜，然后再分別 用治療前后血清作為一抗與硝酸纖維素膜進(jìn)行反應(yīng)，其結(jié)果如下圖2A和圖2B所示。日本 血吸蟲可溶性蟲卵抗原對(duì)應(yīng)的硝酸纖維素膜與兩種血清反應(yīng)經(jīng)顯色后，表明反應(yīng)強(qiáng)烈，且 治療前后血清所識(shí)別可溶性蟲卵抗原中的蛋白有一定差異。作為對(duì)照的非疫區(qū)正常人混合 血清與日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原無明顯反應(yīng)(見圖3)。將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原與治療前后血清反應(yīng)后的硝酸纖維素膜與之前仔 細(xì)進(jìn)行比對(duì)，挑選出了 84個(gè)反應(yīng)強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)點(diǎn)(見圖4)。然后日本血吸蟲可溶性蟲卵抗 原雙向電泳圖譜上挑選的這84個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，成功鑒定出了 67個(gè)日本血吸蟲 蟲卵蛋白，將質(zhì)譜鑒定的日本血吸蟲蟲卵肽段序列與日本血吸蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)， 得到了一批血吸蟲蟲卵特異性蛋白，我們根據(jù)這些鑒定出來的蛋白功能對(duì)它們進(jìn)行了分類 (見表1)。其中主要涉及的功能蛋白有伴侶蛋白，諸如HSP60和HSP70，以及主要蟲卵抗原 P40，而此類蛋白在曼氏血吸蟲蟲卵蛋白質(zhì)組分析也是屬于高峰度的蛋白；涉及能量代謝的 相關(guān)蛋白有磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等，其中GAPDH是這 批免疫原性蛋白中除了 HSP之外又一高豐度的蛋白，GAPDH是一種糖酵解的酶，據(jù)觀察這一 抗原的IgG抗體和感染抗性密切相關(guān)；另外還有一類馬達(dá)蛋白，諸如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白 重鏈和輕鏈以及微管蛋白。除了上述在血吸蟲蟲卵蛋白質(zhì)組中常見的蛋白之外，我們還發(fā) 現(xiàn)幾個(gè)首次在日本血吸蟲中功能未知的免疫原性蛋白，但在其他血吸蟲中有所報(bào)道，比如說參與能量代謝過程中的和曼氏血吸蟲烏頭酸水合酶同源蛋白，以及馬達(dá)蛋白中的肌鈣蛋白T。值得一提的是通過質(zhì)譜的鑒定還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要免疫相關(guān)分子烯醇酶(En。lase)，烯醇酶是在磷酸甘油酸脂轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐急嶂^程中起催化作用的，在埃及血吸蟲和牛血吸蟲的免疫原性蛋白中都發(fā)現(xiàn)了該蛋白的存在，另外在日本血吸蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的比較研究中也發(fā)現(xiàn)了這一重要的免疫相關(guān)蛋白，提示我們烯醇酶很可能在血吸蟲調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答中起到一定作用，因此有必要對(duì)血吸蟲中烯醇酶的功能做詳細(xì)研究。
表l被識(shí)別的日本血吸蟲蟲卵免疫原性蛋白分類
功能分類蛋白性質(zhì)
伴侶蛋白熱擊蛋一1 60(編號(hào)G工257215736)，
其序列女[I S[!Q[D NO3所示
熱擊蛋一1 70(編號(hào)G工2829289)，
其序列女[I S[!Q[D NO4所示
主要蟲卵抗原(P40)(編號(hào)G工
226477156)，其序歹0女口SEQ[D NOl
]聽示
_馬L達(dá)蛋白肌動(dòng)蛋白(編號(hào)G工226472934)，
其序列女[I S[!Q[D NO8所示
微管蛋白(編號(hào)G工226471718)，
其序列女[I S[!Q[D NO9所示
肌鈣蛋白T(編號(hào)G工226478018)，
其序列女[I S[!Q[D NO5所示
I譏球蛋白重鏈
I譏球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈2，光滑肌肉小異
構(gòu)體(編號(hào)G工226469350)，其序
歹0女口SEQ[D NO。L4，F(xiàn)；i)-；示
能量代謝烯醇酶(編號(hào)G工257123775)，其序
歹0女口SEQ[D NO2所示
頭酸水合酶
精氨酸激酶
磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶
3一磷酸甘油醛脫氫酶(編號(hào)G工
257209391)，其序歹0女口SEQ[D NO7
]聽示
二氫嘧啶酶
線粒體A／I’合成酶a亞基
226471614)，其序歹0女口SEO ID NOl l
I聽示
尿嘧啶一DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶
氨基酸轉(zhuǎn)氨酶支鏈
微管蛋白絡(luò)氨酸連接酶
粦酸甘油酸酯激酶l
轉(zhuǎn)運(yùn)通路鈣網(wǎng)織蛋白(編號(hào)G工226473210)，
其序列如SEQ ID NO12，／~；fi；示[OLOO]F~纖維蛋白溶酶[oioi] 鈣結(jié)合20kDa鈣結(jié)合蛋白(抗原Sm20)
防御相關(guān)磷酸酶2A抑制劑工2PP2A
其他功能ATt’合成酶氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)線粒體Fl復(fù)
合體p多肽
KH 剪切調(diào)節(jié)蛋白
尿苷二磷酸一半乳糖一4一表異構(gòu)酶
[OL08]
酯水解酶Cll，J千放閱讀框54同源蛋[oi io]當(dāng)
26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基6a
不均一核糖核酸核糖核蛋一I A2同源
蛋白l
根絲素(纖毛根絲卷曲螺旋蛋白)
牙本質(zhì)唾液磷蛋白(編號(hào)G工
226480886)，其序歹0女口SEQ ID NOlo
}聽示[oi 1 8] 未知功能S]CHGC04997蛋白
S]CHGC03722蛋白
SJCHGC05927蛋白(編號(hào)G工
76156667)，其序歹0女口SEQ ID NO6[oi22]l聽示
SJCHGC01885蛋白(編號(hào)G工
76154815)，其序歹0女口SEQ ID NO13[oi25]l聽示[oi26]未知蛋白
[oi 28] 實(shí)施例2利用免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)來驗(yàn)證篩選出的日本血吸蟲病診斷靶點(diǎn)[oi29] 一．實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟
1.從篩選出的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的免疫原性蛋白中挑選日本血吸蟲熱 擊蛋白60 (Sj HSP60)進(jìn)行原核表達(dá)并純化(具體操作方法參考默克pET原核表達(dá)手冊(cè))。2.將純化好的充足蛋白分別以 0. 625μ g/ml、0. 125μ g/ml、0. 25 μ g/ml、0. 5 μ g/ ml、l. 0μ g/ml、5. 0μ g/ml、10y g/ml、20y g/ml 和 30 μ g/ml 的濃度包被 96 孔酶標(biāo)板，4°C過夜。3.用PBST在洗板機(jī)上洗板3次，每次;3min ；每孔加入100 μ 1的BSA (牛血清 蛋白)，于37°C封閉池。4.用PBST在洗板機(jī)上洗板3次，每次;3min ；以100 μ 1/孔加入不同稀釋度的混合 病人血清(混合的10份確診病人的血清，安徽省)和混合正常人血清(混合的10份正常 人血清，非疫區(qū))，37°c反應(yīng)2h。5.用PBST在洗板機(jī)上洗板4次，每次!Bmin ；每孔加入100 μ 1的HRP標(biāo)記羊抗人 IgG (Sigma, 1 20000 稀釋)，37°C反應(yīng) lh。6. PBST在洗板機(jī)上洗板4次，每次;3min ；每孔加入100 μ 1底物顯色緩沖液，室溫 顯色后加入50 μ 1的2Μ H2SO4終止反應(yīng)。7.用酶標(biāo)儀讀取0D490nm的數(shù)值。二.實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了驗(yàn)證篩選出的這批免疫原性蛋白，我們從中挑選了 HSP60進(jìn)行克隆表達(dá)，并 評(píng)價(jià)了其純化產(chǎn)物的診斷價(jià)值，從日本血吸蟲病人血清中隨機(jī)分別挑選10份血清進(jìn)行混 合，OD值結(jié)果顯示在Sj HSP60抗原包被設(shè)定的9個(gè)濃度范圍內(nèi)，同時(shí)以10份混合的非疫 區(qū)正常人血清作為對(duì)照，1 μ g/ml和5 μ g/ml的效果最好，病人和正常人OD值相差一倍以上 (見表幻，表明該蛋白具有一定的診斷價(jià)值，目前正在用個(gè)體血清進(jìn)行大規(guī)模的評(píng)價(jià)。表2 ELISA檢測安徽血吸蟲病人血清中抗HSP60抗體的滴度
包被 0.06250.125 0.25 05 510 "20 30
pg/ml
病人 0.2775““0.257 0.2760.248““026 0.25050.2740.237"""0.222 正常人 0.158 0.169 0.1475 0.146 0.1345 0.124 0.1445 0.1265 0.14權(quán)利要求
1.一組日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，其特征在于，該免疫原性蛋白 選自SEQ ID NO :2-SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，其特征在于， 該日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的序列如SEQ ID N0:1所示。
3.—種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白的篩選方 法，其特征在于，包含如下步驟1)制備日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原；2)將步驟1)制備的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原進(jìn)行雙向電泳分離，得到雙向凝膠電 泳圖譜；3)將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向電泳膠進(jìn)行免疫印跡雜交，再分別用加入適量 吡喹酮治療前后日本血吸蟲病人的血清作為一抗與NC膜進(jìn)行反應(yīng)；4)重復(fù)步驟2)和3)以確保結(jié)果的正確，從與治療前后血清反應(yīng)顯色后的NC膜上挑出 反應(yīng)強(qiáng)烈的點(diǎn)以及差異明顯的點(diǎn)，然后再反饋到相應(yīng)的雙向凝膠電泳圖譜上，選出與NC膜 對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)；5)對(duì)步驟4)選出的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜鑒定的日本血吸蟲蟲卵肽段序列 與日本血吸蟲蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到一批日本血吸蟲蟲卵抗原中的免疫原性蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白的篩選方法，其 特征在于，步驟1)具體為日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹感染新西蘭兔，42天后將兔剖殺，取感染兔 的肝臟，剪碎后勻漿，銅篩過濾淘洗，離心分離蟲卵及兔肝臟碎片，收集干凈的蟲卵，用生理 鹽水清洗后置于液氮中保存。
5.如權(quán)利要求3所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白的篩選方法，其 特征在于，步驟2)具體為A)用等電聚焦儀進(jìn)行第一向等電聚焦，在20°C自動(dòng)進(jìn)行IPG干膠條水化和等電聚焦， 程序設(shè)置為:30v 12h、500v IhU OOOv lh、8 OOOv 6h、500v 4h ；B)等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條在平衡緩沖液中，于搖床上振蕩平衡兩次，其中第一種 平衡液含二硫蘇糖醇，第二種平衡液由2. 5%碘乙酰胺取代；C)取出平衡后的膠條，重蒸水沖洗，濾紙吸干多余水分，在HoferSE 600垂直電泳槽 上進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用厚度為1. 0mm、濃度12. 5%的聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳條件先 30mA/膠恒流電泳30min，然后加大到60mA/膠恒流電泳至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)膠最底端0. 5cm 為止；D)凝膠采用銀氨法，按蛋白質(zhì)銀染試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行硝酸銀染色，固定lh，敏化 lh，清洗池，銀染45min，清洗3次，每次3min，顯色5min，終止15min，獲得雙向凝膠電泳圖譜。
6.如權(quán)利要求3所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白的篩選方法，其 特征在于，步驟3)具體為A)將日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的雙向電泳膠進(jìn)行Wfestern blot，進(jìn)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn) 移，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜完成后，把凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移是否完全；把濾膜染色 5-10分鐘，蛋白條帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗NC膜數(shù)次，至水不再變色，在NC膜上做 好標(biāo)記；B)加入適量的封閉液室溫下反應(yīng)過夜；次日，將已封閉好的NC膜沿著與標(biāo)記垂直的方 向切下合適寬度的條帶，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次；C)分別加入適量的吡喹酮治療前后日本血吸蟲病人混合血清以及非疫區(qū)正常人混合 血清，室溫下與NC膜反應(yīng)濁；D)棄去一抗，用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG， 室溫反應(yīng)Ih ；用PBST漂洗NC膜3次，再用TBS漂洗1次，用DAB顯色，出現(xiàn)條帶后，終止反 應(yīng)。
7.如權(quán)利要求3所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白的篩選方法，其 特征在于，步驟5)具體為A)先切下差異蛋白質(zhì)點(diǎn)處的凝膠，再用重碳酸胺洗滌膠片，然后用乙腈抽提、再進(jìn)行還 原和烷基化。最后利用胰酶過夜進(jìn)行膠內(nèi)酶解，再用含三氟乙酸的60%乙腈抽提三次， 收集提取物低壓凍干；B)抽提的樣品與基質(zhì)進(jìn)行等量混合進(jìn)行肽指紋圖譜分析，儀器參數(shù)設(shè)定為發(fā)射模式， 200個(gè)集成光束，離子源電壓為l_19kv，離子源為2-16. 27kv，延遲100納秒和600-3500m/z 的離子門；C)可溶性抗原蛋白質(zhì)點(diǎn)的的肽指紋圖譜利用MS-FIT和Mascot軟件對(duì)SWISS-PR0T和 NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢分析。
8.—種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白作為日本 血吸蟲病診斷靶點(diǎn)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，該免疫原性蛋白選自SEQ ID NO2-SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還公開了上述日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白的篩選方法和用途，主要通過聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和血清學(xué)方法篩選日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，具體涉及利用雙向電泳、Westernblot(2D-WB)以及質(zhì)譜的方法分析日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原中的免疫原性蛋白，并以此作為日本血吸蟲病診斷的潛在靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/561GK102079781SQ201010155040
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者馮正, 盧艷, 張颋, 徐斌, 胡薇, 莫筱瑾, 陳紳波, 鞠川, 魏剛剛 申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所