專利名稱：：穩(wěn)定和可溶的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及減小抗體的聚集傾向的方法以及經(jīng)修飾以減小聚集傾向的抗體。本發(fā)明還涉及結(jié)合腫瘤壞死因子a(TNFa)的抗體。具體地，本發(fā)明涉及包含減少聚集的修飾的穩(wěn)定的可溶性抗體，包括scFv抗體和Fab片段，其包含就穩(wěn)定性、溶解度和低免疫原性進行了優(yōu)化的特定輕鏈和重鏈序列。此外，本發(fā)明涉及用于診斷和/或治療TNF介導(dǎo)的病癥的方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤壞死因子a(TNFα，也稱為惡病質(zhì)素)是由許多細胞類型(包括單核細胞和巨噬細胞)響應(yīng)內(nèi)毒素或其它刺激而產(chǎn)生的天然存在的哺乳動物細胞因子。TNFa為炎性、免疫學(xué)和病理生理學(xué)反應(yīng)的主要介質(zhì)(Grell，M.，等人(1995)Cell,83:793-802)。可溶性TNFa通過切割前體跨膜蛋白而形成(Kriegler等人(1988)Cel153:45-53)，并且分泌的17kDa多肽裝配成可溶性同三聚體復(fù)合物(Smith，等人(1987)，J.Biol.Chem.262:6951-6954;關(guān)于TNFA的綜述，參見Butler,等人(1986)，Nature320:584;01d(1986)，Science230:630)。此類復(fù)合物隨后結(jié)合見于多種細胞上的受體。結(jié)合產(chǎn)生一系列促炎癥效應(yīng)，包括(i)釋放其它促炎癥細胞因子例如白細胞介素(IL)-6、IL-8和IL-1，(ii)釋放基質(zhì)金屬蛋白酶和(iii)上調(diào)內(nèi)皮粘附分子的表達，且還通過將白細胞誘入血管外組織來放大炎癥和免疫級聯(lián)反應(yīng)。許多病癥與升高的TNFa水平相關(guān)，它們中的許多具有顯著的醫(yī)學(xué)重要性。已顯示，TNFa在許多人疾病中被上調(diào)，所述疾病包括慢性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病癥包括克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎、敗血癥、充血性心力衰竭、支氣管哮喘(asthmabronchiale)和多發(fā)性硬化。ATNFa轉(zhuǎn)基因小鼠組成型地產(chǎn)生高水平的TNFa并且產(chǎn)生自發(fā)的、破壞性的、類似RA的多關(guān)節(jié)炎(Keffer等人1991，EMBOJ.，10，4025-4031)。因此TNFa稱為促炎癥細胞因子。TNFa現(xiàn)被明確地確定為RA發(fā)病機制中的至關(guān)重要的因子，所述RA為慢性、進行性并且使患者虛弱的疾病，其特征在于多關(guān)節(jié)性關(guān)節(jié)炎癥和破壞，伴有發(fā)熱以及不舒服和疲勞的全身性癥狀。RA還導(dǎo)致慢性滑液炎癥，經(jīng)常進展成關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞。在患有RA的患者的滑液和外周血中都發(fā)現(xiàn)了升高水平的TNFa。當給患有RA的患者施用TNFa阻斷劑時，它們減少炎癥，改善癥狀以及延緩關(guān)節(jié)損傷(McKown等人(1999)，ArthritisRheum.42:1204-1208)。在生理上，TNFa還與免受特定感染的保護相關(guān)(Ceram1.等人(1988)，Immunol.Today9:28)。TNFa由已被革蘭氏陰性細菌的脂多糖激活的巨噬細胞釋放。這樣，TNFa顯示為牽涉與細菌性膿毒癥相關(guān)的內(nèi)毒素性休克的發(fā)展和發(fā)病機制的至關(guān)重要的內(nèi)源介質(zhì)(Michie等人(1989),Br.J.Surg.76:670-671.;Debets等人(1989),SecondViennaShockForum,p.463-466；Simpson等人(1989)Crit.CareClin.5:27-47；ffaage等人(1987).Lancetl:355-357;Hammerle等人(1989)SecondViennaShockForump.715-718;Debets等人(1989)，Crit.CareMed.17:489-497;Calandra等人(1990)，J.1nfect.Dis.161:982-987；Revhaug等人(1988)，Arch.Surg.123:162-170)。與其它器官系統(tǒng)一樣，還已顯示TNFα在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)的炎性和自身免疫性病癥(包括多發(fā)性硬化、格-巴二氏綜合征(Guillain-Barresyndrome)和重癥肌無力)以及神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病癥(包括阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病)中起著至關(guān)重要的作用。TNFa還牽涉視網(wǎng)膜和肌肉的相關(guān)系統(tǒng)的病癥，包括視神經(jīng)炎、黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、皮肌炎、肌萎縮側(cè)索硬化和肌營養(yǎng)不良癥，以及牽涉對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，包括外傷性腦損傷、急性脊髓損傷和中風(fēng)。肝炎是另一種TNFd相關(guān)炎性病癥，除其它觸發(fā)因子外，其還可由病毒感染(包括EB病毒、巨細胞病毒和肝炎A-E病毒)引起。肝炎在肝門和小葉區(qū)域引起急性肝炎癥，隨后引起纖維化和腫瘤進展。TNFa還可介導(dǎo)癌癥的惡病質(zhì)，其導(dǎo)致大部分癌癥發(fā)病率和死亡率(TisdaleM.J.(2004)，Lange·nbecksArchSurg.389:299-305)。TNFa在炎癥、細胞免疫應(yīng)答以及許多疾病的病理學(xué)中所起的關(guān)鍵作用已引發(fā)對TNFa拮抗劑的尋找。被設(shè)計用于治療TNFa介導(dǎo)的疾病的TNFa拮抗劑的一個種類是特異性結(jié)合TNFa，從而阻斷其功能的抗體或抗體片段?？?TNFa抗體的使用已顯示，TNFa的阻斷可逆轉(zhuǎn)歸因于TNFa的效應(yīng)，包括IL-l、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子的降低和組織破壞(Feldmann等人(1997),Adv.1mmunol.1997:283-350)。最近已商購可得的TNFa特異性抑制劑包括，抗TNFa的單克隆、嵌合小鼠-人抗體(英夫利昔單抗，Remicade；CentocorCorporation/Johnson&Johnson),其已在RA和克羅恩氏病的治療中顯不臨床功效。盡管已取得這些進展，但仍然需要用于治療TNFa-相關(guān)病癥例如RA的抗體的新型有效形式或其它抗體。特別地，存在對具有有效持續(xù)地治療關(guān)節(jié)炎及其它TNFa介導(dǎo)的病癥的最佳功能性質(zhì)的抗體的急迫需要。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含至少一個減少聚集的突變的抗體以及用于產(chǎn)生此類抗體的方法。在一個方面，本發(fā)明提供了減小抗體的聚集傾向的方法，所述方法包括，在參與抗體的可變輕鏈與可變重鏈之間的界面的殘基位置上引入一個或多個減小聚集的修飾，其中置換使可變輕鏈與可變重鏈之間的自由能減小至少0.5kcal/mol，從而相較于不具有減小聚集的修飾的親代抗體的聚集傾向，經(jīng)修飾的抗體的聚集傾向得到減小。在一個方面，本發(fā)明的方法包括，在抗體的可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)的界面中引入一個或多個氨基酸置換，其中一個或多個置換在這樣的殘基位置上，其被選擇以使VL與VH之間的自由能減小至少10%，從而使抗體的聚集傾向相較于親代抗體得到減小。在具體方面，抗體的可變輕鏈的序列與SEQIDNO:1的序列具有至少65%的同一性。在其它方面，可變重鏈序列與SEQIDN0:3的序列或SEQIDN0:4的序列具有至少85%的同一性。在某些方面，本發(fā)明的方法包括，修飾抗體的可變輕鏈中的AHo位置50上的殘基和/或AHo位置47上的殘基，從而使抗體的聚集傾向相較于親代抗體獲得減小。在其它方面，本發(fā)明的方法還包括，修飾可變重鏈的AHo位置12、103和144上的殘基。本發(fā)明還提供了具有減小的聚集傾向的抗體，其包含一個或多個減小聚集的修飾。在某些方面，本發(fā)明的抗體為Fab、Fab'、F(ab)'2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、或線性抗體。在其它方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗體的雙特異性或雙價分子。在其它方面，減小聚集的修飾在可變輕鏈的AHo位置50上。在具體的方面，減小聚集的修飾包括可變輕鏈的AHo位置50上的精氨酸(R)。在其它方面，減小聚集的修飾包括，在可變輕鏈的AHo位置50上的精氨酸(R)對賴氨酸(K)的置換。在其它方面，減小聚集的修飾在可變輕鏈的AHo位置47上。在具體的方面，減小聚集的修飾包括可變輕鏈的AHo位置47上的精氨酸(R)。在其它方面，減小聚集的修飾包括，在可變輕鏈的AHo位置47上的精氨酸(R)對賴氨酸(K)的置換。本發(fā)明還提供了特異于TNFa的穩(wěn)定的可溶性抗體，其包含針對穩(wěn)定性、可溶性、TNFa的體外及體內(nèi)結(jié)合以及低免疫原性進行了優(yōu)化的特定輕鏈和重鏈序列。所述抗體被設(shè)計用以診斷和/或治療TNFa介導(dǎo)的病癥。還公開了用于表達本發(fā)明的重組抗體、可變輕鏈和可變重鏈的核酸、載體和宿主細胞、用于分離它們的方法以及所述抗體在醫(yī)藥中的用途。本發(fā)明還提供了治療TNFa介導(dǎo)的病癥的方法，包括給有此需要的受試者施用包含本發(fā)明的抗-TNFa抗體的藥物組合物。在某些方面，TNFa介導(dǎo)的病癥為選自葡萄膜炎、白塞病(Bechet’sdisease)、視網(wǎng)膜炎、干眼、青光眼、Sj6rgen綜合征、糖尿病神經(jīng)病變、鞏膜炎、年齡相關(guān)黃斑變性和角膜炎的眼病`癥。根據(jù)下列某些優(yōu)選實施方案的更詳細描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案將變得顯然。附圖概述圖1顯示兩種不同的scFv分子34rFWl.4(黑色)和578rFWl.4(灰色)的殘基位置VL47(實線)和VL50(虛線)的滴定曲線。圖2A顯示在40°C下使用60mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖2B顯示在40°C下使用60mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_VLK50R_DHP在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖3A顯示在40°C下使用40mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖3B顯示在40°C下使用40mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_VLK50R_DHP在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖4A顯示在40°C下使用20mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖4B顯示在40°C下使用20mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_VLK50R_DHP在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖5A顯示在40°C下使用60mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖5B顯示在40°C下使用60mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_VL_K50R在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖6A顯示在40°C下使用40mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖6B顯示在40°C下使用40mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_VLK50R在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖7A顯示在40°C下使用20mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖7B顯示在40°C下使用20mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_VLK50R在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖8A顯示在40°C下使用60mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖8B顯示在40°C下使用60mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_K47R在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖9A顯示在40°C下使用20mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4在加速的條件下的穩(wěn)定性。圖9B顯示在40°C下使用20mg/ml的濃度溫育2周后通過SE-HPLC分析測定的34rFffl.4_K47R在加速的條件下的穩(wěn)定性。發(fā)明詳述本發(fā)明的總體目的是，提供在溶液中具有減小的聚集傾向的穩(wěn)定的可溶性抗體。在優(yōu)選實施方案中，所述抗體為scFv抗體或Fab片段。本發(fā)明的抗體優(yōu)選包含本文中公開的輕鏈和重鏈。本文中顯示的細節(jié)僅僅是示例性的和用于舉例論述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且提供了這樣的內(nèi)容，其被認為是對本發(fā)明的各個實施方案的原理和概念方面的最有用和易于理解的描述。在這點上，未打算比深刻理解本發(fā)明所必需的內(nèi)容更詳細地顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)內(nèi)容，說明書與附圖和/或?qū)嵤├黄鹗贡绢I(lǐng)域技術(shù)人員明白可如何在實踐中實現(xiàn)本發(fā)明的幾個形式。為了可更容易地理解本發(fā)明，如下定義某些術(shù)語。其它定義示于整個詳細描述中。除非在下列實施例中被清楚和明確地改變，或當含意的應(yīng)用使得闡釋(construction)無意義或基本上無意義，否則在任何闡釋中意欲以下列定義和解釋為準。在術(shù)語的闡釋使得其無意義或基本上無意義的情況下，定義應(yīng)當根據(jù)韋氏詞典，第3版，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的詞典，例如牛津生物化學(xué)和分子生物學(xué)詞典(Ed.AnthonySmith,OxfordUniversityPress,Oxford,2004)。如本文中所用，術(shù)語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”、“抗原結(jié)合多肽”或“免疫結(jié)合劑”)或單鏈?！翱贵w”包括，包含通過二硫鍵鏈間連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。每一個重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每一個輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為')和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)域CL。VdP'區(qū)還可被細分成其間插入了較保守的區(qū)域(稱為構(gòu)架區(qū)(FR))的高變區(qū)(稱為互補決定區(qū)(OTR))。每一個Vh和'包含3個⑶R和4個FR，從氨基端至羧基端按下列順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應(yīng)細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結(jié)合。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱“抗體部分”)是指抗體的保留特異性結(jié)合抗原(例如，TNF)的能力的一個或多個片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可通過全長抗體的片段來執(zhí)行。包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中的結(jié)合片段的實例包括，(i)Fab片段，由\、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包括通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)由Vh和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(V)單結(jié)構(gòu)域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341:544-546),其由Vh結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(O)R)或(vii)可任選地通過合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域'和Vh由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過合成的接頭連接它們，所述接頭使得它們能夠產(chǎn)生為單個蛋白質(zhì)鏈，其中\(zhòng)與Vh區(qū)域配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv));參見例如，Bird等人(1988)Science242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”中。此類抗體片段可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來獲得，以與完整抗體相同的方式就效用篩選所述片段?？乖Y(jié)合部分可利用重組DNA技術(shù)或通過完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割來產(chǎn)生。抗體可具有不同的同種型，例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgAl、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。術(shù)語“構(gòu)架”是指，本領(lǐng)域公認的抗體可變區(qū)的部分，其存在于多個分散的CDR區(qū)之間。此類構(gòu)架區(qū)通常稱為構(gòu)架I至4(FR1、FR2、FR3和FR4)并且提供用于在三維空間中保持重鏈或輕鏈抗體可變區(qū)中的3個CDR(以便CDR可形成抗原結(jié)合表面)的支架。此類構(gòu)架還可被稱為支架，因為它們?yōu)槎鄠€分散的CDR的呈現(xiàn)提供支持。免疫球蛋白超家族例如錨蛋白重復(fù)序列和纖連蛋白的其它⑶R和構(gòu)架可用作抗原結(jié)合分子(也參見，例如，美國專利N0.6，300，064,6,815，540和美國專利公開案N0.20040132028)。術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原(例如，TNF)上免疫球蛋白或抗體特異性結(jié)合的部位。表位通常以獨特的空間構(gòu)象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸。參見，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷，G.E.Morris,Ed.(1996)。術(shù)語“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”、“選擇性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指，抗體對預(yù)定抗原上的表位的結(jié)合。通常，抗體以大致小于10_7m，例如大致小于10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或更低的親和力(Kd)結(jié)合，如在BIAC0RE儀中使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)測定的。術(shù)語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。在某些實施方案中，本發(fā)明的一些抗體以小于約1(Γ7Μ，例如小于約1(Γ8Μ、1(Γ9Μ或ΙΟ,Μ或甚至更小的解離平衡常數(shù)(Kd)結(jié)合TNF，例如，如在BIAC0RE儀中使用表面等離子共振(SPR)技術(shù)測定的。如本文中所用，"同一性〃是指兩個多肽分子之間或兩個核酸之間的序列匹配。當兩個相比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單位占據(jù)時(例如，如果兩個DNA分子的每一個中的位置被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的位置被賴氨酸占據(jù))，那么各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分比同一性”是兩個序列共有的匹配位置的數(shù)目除以相比較的位置的數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個序列中的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。舉例來說，DNA序列CTGACT與CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個匹配)。一般而言，在將兩個序列比對以產(chǎn)生最大同一性時進行比較?？墒褂美鏝eedleman等人(1970)J.Mol.Biol.堅:443-453的方法(其可方便地用計算機程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)來執(zhí)行)提供這樣的比對。兩個氨基酸序列之間的百分比同一性還可使用已被整合入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和ff.Miller的算法(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17(1988))，利用PAMl20權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定。此外,兩個氨基酸序列之間的百分比同一性還可使用已被整合入GCG軟件包的GAP程序(可在畫.gcg.com上獲得)白勺Needleman和Wunsch(1.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法，利用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權(quán)重(gapweight)和I,2，3，4，5或6的長度權(quán)重(lengthweight)來測定。"相似"序列是指，當對齊時共有相同和相似氨基酸殘基的那些序列，其中相似殘基是比對的參照序列中的相應(yīng)氨基酸殘基的保守置換。在這一點上，參照序列中的殘基的"保守置換"是指，用在物理或功能上與相應(yīng)的參照殘基相似的殘基(例如具有相似尺寸、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)(包括形成共價鍵或氫鍵的能力)等的殘基)進行的置換。因此，“保守置換修飾的”序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個或多個保守置換的序列。兩個序列之間的〃百分比相似性〃是，兩個序列共有的包含匹配殘基或保守置換的位置的數(shù)目除以相比較的位置的數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個序列中的10個位置中有6個匹配并且10個位置中有2個包含保守置換,那么兩個序列具有80%的正相似性(positivesimilarity)。如本文中所用，術(shù)語“保守序列修飾”意欲指，未負面影響或改變包含氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。此類保守序列修飾包括核苷酸和氨基酸置換、添加和缺失。例如，可通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來引入修飾。保守氨基酸置換包括其中用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中進行了定義。這類家族包括，具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，特定抗體中的預(yù)測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選被來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸殘基替代。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸及氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域是公知的(參見，例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:412-417(1997))。如本文中所用的，〃氨基酸共有序列〃是指，可使用至少兩個(優(yōu)選更多個)比對的氨基酸序列的矩陣，并且在比對中允許存在缺口以便能夠確定各個位置上頻率最高的氨基酸殘基，而產(chǎn)生的氨基酸序列。共有序列是在每一個位置上包含最頻繁出現(xiàn)的的氨基酸的那個序列。如果兩個或更多個氨基酸殘基同等地出現(xiàn)在單個位置上，則共有序列包括兩個或所有這些氨基酸?？稍诓煌乃缴戏治龅鞍踪|(zhì)的氨基酸序列。例如，可在單個殘基水平、多個殘基水平、具有缺口的多個殘基等上顯示保守或可變性。殘基可顯示相同殘基的保守性或可在種類水平上是保守的。氨基酸種類的實例包括，極性且不帶電荷的R基(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R基(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負電荷的R基(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水性R基(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；和特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它種類對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且可使用結(jié)構(gòu)測定或評估可置換性的其它數(shù)據(jù)來定義。在該意義上，可置換的氨基酸可以指，在該位置上可被置換并且維持功能保守性的任何氨基酸。然而，應(yīng)注意，相同種類的氨基酸在其生物物理學(xué)性質(zhì)上可存在不同程度的變化。例如，應(yīng)注意，某些疏水性R基(例如，丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸)比其它疏水性R基(例如，纈氨酸或亮氨酸)更加親水(即，具有更高的親水性或更低的疏水性)。相對親水性或疏水性可使用本領(lǐng)域公認的方法(參見，例如，Rose等人，Science,229:834-838(1985)和Cornette等人，J.Mol.Biol.，195:659-685(1987))來測定。如本文中所用，當將一個氨基酸序列(例如，第一Vh或\序列)與一個或多個另外的氨基酸序列(例如，數(shù)據(jù)庫中的一個或多個VH或VL序列)比對時，可將一個序列(例如，第一Vh或\序列)中的氨基酸位置與一個或多個另外的氨基酸序列中的“相應(yīng)位置”相比較。如本文中所用，“相應(yīng)位置”代表當將序列最佳比對時，即當比對序列以獲得最高百分比同一性或百分比相似性時被比較的序列中的等同位置。術(shù)語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選為雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置于功能關(guān)系中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其被有效地連接于編碼序列。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的可變輕鏈和/或本發(fā)明的可變重鏈的分離的核酸分子。在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼:包含與SEQIDN0:2或SEQIDNO:14具有至少97%的同一性的輕鏈可變區(qū)的多肽；包含與SEQIDN0:5具有至少95%的同一性的重鏈可變區(qū)的多肽；或與SEQIDNO:10或SEQIDNO:17具有至少96%的同一性的抗體。術(shù)語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一個核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，其是指可將另外的DNA區(qū)段連接于其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接進入病毒基因組。某些載體能夠在它們被引入其中的宿主細胞中自主自制(例如，具有細菌復(fù)制起始點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞后被整合進入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。術(shù)語“宿主細胞”是指已向其中引入表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易于轉(zhuǎn)化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)或沙門菌屬(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)的成員，例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)。適當?shù)奈⑸锇ㄡ劸平湍?Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(Pichiapastoris)。適當?shù)膭游锼拗骷毎蛋–H0(中國倉鼠卵巢品系)和NSO細胞。術(shù)語“治療”、“醫(yī)治”和“醫(yī)療”是指本文中描述的治療性或預(yù)防性措施?！爸委煛钡姆椒ò?，給需要這樣的治療的受試者(例如，患有TNFa介導(dǎo)的病癥的受試者或最終可獲得這樣的病癥的受試者)施用本發(fā)明的抗體，以預(yù)防、治愈、延遲病癥或復(fù)發(fā)性病癥、減輕所述病癥的嚴重度，或改善所述病癥的一個或多個癥狀，或以使受試者的存活延長超過在這樣的治療不存在的情況下預(yù)期的時間。術(shù)語“TNF介導(dǎo)的病癥”通常是指，與TNF相關(guān)的疾病狀態(tài)和/或癥狀，包括其癥狀的發(fā)作、進展或持續(xù)需要TNF的參與的任何病癥。TNF介導(dǎo)的病癥的實例包括但不限于，年齡相關(guān)黃斑變性、新生血管性青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、晶體后纖維增生癥、乳腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸直腸癌、肝癌、卵巢癌、昏迷、卵巢雄性細胞瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜異位癥、纖維肉瘤、絨毛膜癌、頭頸癌、鼻咽癌、喉癌、肝母細胞瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、黑素瘤、皮膚癌、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、胰腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤(Schwannoma)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、成骨性肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌(urinarytractcarcinomas)、甲狀腺癌、腎母細胞瘤(Wilm'stumor)、腎細胞癌、前列腺癌、與斑痣性錯構(gòu)瘤病相關(guān)的異常血管增生、水腫(例如，與腦腫瘤相關(guān)的)、Meigs綜合征(Meigs’syndrome)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病和動脈粥樣硬化。TNF介導(dǎo)的病癥還包括干眼和TNFa相關(guān)炎性病況，例如眼部炎癥(ocularinflammation)、過敏性結(jié)膜炎、皮炎、鼻炎和哮喘,例如,包括由直接或間接導(dǎo)致TNFα相關(guān)炎性病況的TNFa活性引起的那些細胞變化。此外，TNF介導(dǎo)的病癥還包括眼部血管生成、白塞病、視網(wǎng)膜炎、青光眼、Sjlirgen綜合征、糖尿病神經(jīng)病變、鞏膜炎、角膜炎和葡萄膜炎。術(shù)語“有效劑量”或“有效量”是指，足以獲得或至少部分獲得期望的作用的量。術(shù)語“治療有效量”定義為足以治愈或至少部分停止已患有疾病的患者的疾病及其并發(fā)癥的量。對于該用途有效的量將取決于待治療的病癥的嚴重度和患者自已的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)。術(shù)語“受試者”是指任何人或非人動物。例如，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療患有TNF介導(dǎo)的病癥的受試者。本文中用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的編號系統(tǒng)對應(yīng)于由A.Honegger,J.Mol.Biol.309(2001)657-670定義的編號系統(tǒng)(AHo系統(tǒng))。AHo系統(tǒng)與由Kabat等人(Kabat,E.A.，等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationN0.91-3242)定義的最常用系統(tǒng)之間的換算表提供于A.Honegger,J.Mol.Biol.309(2001)657-670中。如本文中所用，術(shù)語“聚集”是指在液體溶液中導(dǎo)致形成寡聚體種類的單體分子之間的分子間相互作用/締合的過程?？稍跐饪s溶液中使用加速的穩(wěn)定性研究在脅迫條件下評估聚集。加速的穩(wěn)定性研究被設(shè)計用于通過使用極端貯存條件來增加化合物的分解、聚集或化學(xué)修飾的速率。通常在40°C和室溫下進行加速的穩(wěn)定性研究(也稱為脅迫研究)。此類穩(wěn)定性研究提供了關(guān)于暴露于超出正常標簽貯存條件的環(huán)境條件(也稱為脅迫條件)的影響的有價值的信息。高蛋白質(zhì)濃度的溶液被廣泛用于制藥工業(yè)。蛋白質(zhì)在高濃度下的溶液行為可因這些溶液中的熱力學(xué)非理想狀態(tài)而與基于稀釋溶液分析預(yù)測的溶液行為顯著不同。在此類系統(tǒng)中觀察到的非理想狀態(tài)與蛋白質(zhì)間相互作用(PPI)相關(guān)。不同類型的力在測定此類PPI的總體性質(zhì)和程度中起著至關(guān)重要的作用，并且其相對貢獻受溶質(zhì)和溶劑性質(zhì)影響。PPI的作用由這些分子間力驅(qū)動，以控制溶液特征，包括物理穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)自締合和聚集。濃縮的溶液是其中PPI通過增加寡聚化速率來影響溶液中的蛋白質(zhì)的那些溶液。濃縮的溶液可具有例如至少10mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。該過程的可溶性產(chǎn)物可通過分析法例如SE-HPLC來檢測。如本文中所用，術(shù)語“減少聚集的修飾”是指，與本文中描述的親代抗體相比較，減小抗體在液體溶液中聚集的傾向的修飾，例如氨基酸置換?！坝H代”抗體是包含與具有減小聚集的修飾的相應(yīng)抗體大體上相同的序列的抗體。例如，親代抗體可具有與修飾的抗體相同的CDR，可以除可變輕鏈序列中的AHo位置47和/或50上的殘基外，具有與修飾的抗體完全相同的序列，且還可在可變重鏈序列中的AHo位置12、103和144上相異。也可存在其它差異，只要親代抗體不包含存在于根據(jù)本發(fā)明方法而修飾的抗體中的減少聚集的修飾。如本文中所用，術(shù)語“界面”是指，抗體的兩個可變結(jié)構(gòu)域(重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域)之間的相互作用。界面包括直接或間接參與可變結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的氨基酸殘基。這樣的相互作用包括但不限于，兩個結(jié)構(gòu)域之間的所有類型的非鍵合相互作用，例如范德瓦爾斯力、氫鍵鍵合、靜電項(electrostaticterm)和疏水相互作用。除非另外明確地定義，否則本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但在下文中描述適當?shù)姆椒ê筒牧?。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例僅僅是舉例說明性的，而并非是限定性的。在下列分部分中更詳細地描述本發(fā)明的各個方面。應(yīng)理解，可隨意組合各個實施方案、參數(shù)選擇和范圍。此外，取決于具體的實施方案，可以不應(yīng)用選擇的定義、實施方案或范圍。在一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合TNFa，從而適合于在體內(nèi)阻斷TNFa的功能的抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是經(jīng)優(yōu)化的，其相對于親代抗體具有減少聚集的修飾，從而本發(fā)明的抗體相較于親代/未修飾的抗體具有減少的聚集傾向。此類修飾包括，參與可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)界面的特定殘基的氨基酸置換。在一些實施方案中，減少聚集的修飾包括至少一個氨基酸置換，所述氨基酸置換在計算機(insilico)建模方法中減少VL-VH界面的自由能(相較于親代抗體的VL-VH界面的自由能)，如本文中所描述的。此類修飾包括貢獻VL-VH界面的自由能的特定殘基的氨基酸置換)。在某些實施方案中，本發(fā)明的減少聚集的修飾包括VL鏈中的AHo位置50上的置換。在一個實施方案中，置換為AHo位置50上的精氨酸(R)。在另一個實施方案中，AHo位置50上的精氨酸(R)替代賴氨酸⑷。在其它實施方案中，本發(fā)明的減少聚集的修飾包括VL鏈中的AHo位置47上的置換。在一個實施方案中，置換為AHo位置47上的精氨酸(R)。在另一個實施方案中，AHo位置47上的精氨酸(R)替代賴氨酸⑷。在Honegger,A.和Pli3ckthim，A.(2001)JMol.Biol.309:657-670)中詳細地描述了AHo編號系統(tǒng)?？勺冚p鏈中的AHo位置50相應(yīng)于Kabat位置42。可變輕鏈中的AHo位置47相應(yīng)于Kabat位置39。在Kabat等人(Kabat,E.A.，等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationN0.91-3242)中詳細地描述了Kabat編號系統(tǒng)。AHo系統(tǒng)與Kabat等人定義的最常用的系統(tǒng)之間的換算表提供于A.Honegger,J.Mol.Biol.309(2001)657-670中。為兩個不同的用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的編號系統(tǒng)提供了下列換算表。在Kabat等人(Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationN0.91-3242)中進一步描述了Kabat編號系統(tǒng)。在Honegger,A.和Pluckthun,A.(2001)J.M·ol.Biol.309:657-670中進一步描述了AHo編號系統(tǒng)。重鏈可變區(qū)編號表1:重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基位置的換算表權(quán)利要求1.一種特異性結(jié)合人TNFa的抗體，其包含:a.包含SEQIDN0:2或SEQIDNO:14的序列的可變輕鏈；和b.包含SEQIDN0:5的序列的可變重鏈。2.權(quán)利要求1的抗體,其中所述可變輕鏈包含SEQIDN0:2的序列。3.權(quán)利要求1的抗體,其中所述可變輕鏈包含SEQIDNO:14的序列。4.權(quán)利要求1的抗體，其還具有包含SEQIDNO:7的序列的接頭。5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包含SEQIDNO:10的序列。6.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體包含SEQIDNO:17的序列。7.—種藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1的抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。8.一種治療TNFa介導(dǎo)的疾病的方法，包括給有此需要的受試者施用權(quán)利要求7的藥物組合物。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述TNFa介導(dǎo)的疾病是眼的病癥，其選自葡萄膜炎、白塞病、視網(wǎng)膜炎、干眼、青光眼、Sjftrgen綜合征、糖尿病神經(jīng)病變、鞏膜炎、年齡相關(guān)黃斑變性和角膜炎。10.權(quán)利要求8的方法，其中通過經(jīng)眼、鼻內(nèi)、經(jīng)耳、舌下、經(jīng)皮、局部、口服、經(jīng)鼻、直腸或胃腸外施用來施用所述藥物組合物。11.權(quán)利要求10的方法，其中以包含0.1至IOOmg抗體的單份或分份劑量施用所述藥物組合物。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述TNFa介導(dǎo)的疾病為葡萄膜炎，并且對所述受試者的眼局部施用所述藥物組合物。13.—種編碼權(quán)利要求1的抗體的分離的核酸分子。14.一種包含權(quán)利要求13的核酸分子的載體。15.—種包含權(quán)利要求14的載體的宿主細胞。16.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體為Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段或線性抗體。17.—種包含權(quán)利要求1的抗體的雙價或雙特異性分子。18.一種用于減少抗體的聚集傾向的方法，所述方法包括將一個或多個氨基酸置換引入抗體的可變輕鏈(VL)與可變重鏈(VH)的界面，其中所述一個或多個置換位于這樣的殘基位置上，所述殘基位置被選擇用于使VL與VH之間的自由能減少至少0.5kcal/mol,從而相較于親代抗體，減少抗體的聚集傾向。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體為Fab、Fab’、F(ab)’2、單鏈Fv(scFv)、Fv片段、雙特異抗體、單鏈雙特異抗體、串聯(lián)抗體或線性抗體。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體的可變輕鏈的序列與SEQIDNO:1的序列具有至少65%的同一性。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述修飾包含在可變輕鏈的AHo位置50和/或AHo位置47上的置換。22.權(quán)利要求21的方法,其中所述置換為可變輕鏈的AHo位置50上的精氨酸(R)和/或AHo位置47上的精氨酸(R)。23.權(quán)利要求22的方法，其中在可變輕鏈的AHo位置47和/或50上的賴氨酸(K)被精氨酸(R)置換。24.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體具有與SEQIDNO:1的序列具有至少85%的同一性的可變重鏈序列。25.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體具有與SEQIDN0:3的序列或SEQIDNO:4的序列具有至少85%的同一性的可變重鏈序列。26.權(quán)利要求18的方法，其還包含在可變重鏈的AHo位置12、103和144上的氨基酸置換。27.—種通過權(quán)利要求18的方法產(chǎn)生的抗體。全文摘要本發(fā)明提供了經(jīng)修飾以減少聚集傾向的抗體，以及產(chǎn)生此類抗體的方法。本發(fā)明還提供了特異于TNF的特別穩(wěn)定的可溶性scFv抗體和Fab片段，其包含就穩(wěn)定性、溶解度、TNF的體外和體內(nèi)結(jié)合以及低免疫原性進行優(yōu)化的特定輕鏈和重鏈序列。還公開了用于表達本發(fā)明的重組抗體的核酸、載體和宿主細胞、用于分離其的方法以及所述抗體在醫(yī)藥中的用途。文檔編號C07K16/24GK103154033SQ201180050388公開日2013年6月12日申請日期2011年10月24日優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日發(fā)明者L·博拉斯,D·尤里奇申請人:艾斯巴技術(shù)-諾華有限責(zé)任公司