專利名稱：鐵調(diào)素的結(jié)合蛋白的制作方法
鐵調(diào)素的結(jié)合蛋白撞要本發(fā)明涉及針對鐵調(diào)素(Hepcidin)的新的、特異性結(jié)合的治療和/或診斷蛋白，所述蛋白優(yōu)選地是脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白。本發(fā)明還涉及編碼這樣的蛋白的核酸分子和生成方法以及這樣的蛋白和核酸分子的用途。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及包含這樣的脂質(zhì)運載蛋白的藥物和/或診斷組合物，包括這些蛋白的用途。
背景技術(shù)：
鐵調(diào)素，一種通常以由20或25個氨基酸形成的兩種形式存在的肽激素，由大量細胞響應(yīng)于鐵加載和炎癥而表達和分泌。鐵調(diào)素主要在肝臟的肝細胞中產(chǎn)生，在鐵動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)中起到主要作用，作為一種抗菌肽以及直接或間接參與大多數(shù)鐵缺乏/過載綜合癥的發(fā)展。鐵調(diào)素的一個主要作用是內(nèi)化和降解鐵輸出體膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(feiroportin)，所述膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白在所有輸出鐵的細胞上表達。鐵調(diào)素直接結(jié)合至膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白。因此，高水平的鐵調(diào)素導(dǎo)致小腸鐵吸收和從巨噬細胞和肝細胞的鐵釋放的抑制，然而低濃度的鐵調(diào)素導(dǎo)致從這些細胞的鐵釋放的加速。鐵調(diào)素也可能在炎癥性貧血和缺鐵性貧血的發(fā)病機理中發(fā)揮作用。炎癥性貧血，也稱為慢性疾病貧血(ACD)或慢性障礙貧血，目前在住院患者中是最常見的貧血，并且是一種許多感染性、非感染性 炎癥和腫瘤障礙并發(fā)的常見綜合癥。ACD是一種正常紅血球的、正常色素的貧血，以鐵和鐵結(jié)合能力(轉(zhuǎn)鐵蛋白)減少、鐵蛋白增加和骨髓巨噬細胞中存在鐵為特征，表明從其儲存中調(diào)動鐵的功能受損。然而在炎癥性貧血中，鐵調(diào)素水平增加，在缺鐵性貧血中，發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)素水平較低。因此，鐵調(diào)素可以用作區(qū)分這些疾病的標(biāo)記物。鐵調(diào)素也可以是用于篩選、預(yù)后和監(jiān)控遺傳性血色素沉著癥及鐵加載貧血的一個有用標(biāo)記物。鐵調(diào)素水平進一步可用于監(jiān)測EPO治療和預(yù)測對EPO的響應(yīng)。分離、分析和量化鐵調(diào)素的方法以及用于治療與鐵調(diào)素相關(guān)的疾病和病癥的制劑已經(jīng)被描述于國際專利申請 W02008/011158、W02008/097461、W02009/094551A1、W02009/139822、W02009/058797和W02010/017070中。然而，在以前的描述中沒有具有本發(fā)明提供的蛋白所賦有的特征的鐵調(diào)素結(jié)合蛋白。發(fā)明概沭本發(fā)明的一個實施方案涉及一種能夠以測定的Kd為約IOnM或更低的親和力結(jié)合鐵調(diào)素的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。更優(yōu)選地，脂質(zhì)運載蛋白可以具有測定的Kd為約InM或更低的親和力。在另一個實施方案中，脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白能夠中和人鐵調(diào)素-25的生物活性，優(yōu)選地具有約SOnM或更低的IC50值，如通過用于鐵調(diào)素誘導(dǎo)的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解的基于細胞的測定所測得。在特定的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白包含選自SEQ IDNO: 1-14的氨基酸序列。在另一個實施方案中，突變蛋白與野生型人脂質(zhì)運載蛋白(包括人脂質(zhì)運載蛋白2)的序列具有至少75%的同一性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白與選自有機分子、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、有色標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顯色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、半抗原、地高辛、生物素、細胞抑制劑、毒素、金屬絡(luò)合物、金屬和膠體金的化合物綴合。所述突變蛋白可以在其N端和/或C端融合至融合配偶體，所述融合配偶體是蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或肽。在另一個實施方案中，突變蛋白與延長突變蛋白的血清半衰期的化合物綴合。進一步優(yōu)選地，突變蛋白與選自聚亞烷基二醇分子、羥乙基淀粉、免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的G3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的Ch4結(jié)構(gòu)域、白蛋白結(jié)合肽和白蛋白結(jié)合蛋白的化合物
三雙口 ο在另一個實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白是鐵調(diào)素的拮抗劑。所述鐵調(diào)素可以是成熟人鐵調(diào)素。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白選自以下蛋白的突變蛋白:視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)、載脂蛋白D (APO D)、嗜中性粒細胞明月父酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、淚脂質(zhì)運載蛋白(TLPC)、α 2_微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)、24p3/uterocalin (24p3)、von Ebners 腺蛋白 I (VEGPl)、von Ebners 腺蛋白 2 (VEGP2)和主要變應(yīng)原Can fl前體(ALL-1)。在相關(guān)的實施方案中，所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白選自人嗜中性粒細胞明股酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(hNGAL)、人淚脂質(zhì)運載蛋白(hTLPC)、人載脂蛋白D (APO D)和歐洲粉蝶(Pieris brassicae)的膽汁三烯結(jié)合蛋白。在另一個實施 方案中，本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其阻止人鐵調(diào)素-25誘導(dǎo)的受試者的血清鐵水平降低。本發(fā)明還涉及一種治療與鐵調(diào)素水平改變相關(guān)的疾病或障礙的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用含有本文所述的突變蛋白的藥物組合物。在相關(guān)的實施方案中，所述疾病或障礙涉及鐵動態(tài)平衡的障礙或與鐵調(diào)素水平提高相關(guān)的炎性病癥。


圖1示出了用于成熟Lcn2氨基酸序列中的20個氨基酸位置36、40、41、49、52、68、
70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 (有下劃線和編號的)的同時隨機誘變的PCR組裝策略。這20個位置被分為四個序列子集。對于每個子集中的氨基酸的隨機化，合成了寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19)，其中在突變的密碼子處采用核苷酸的NNK混合物。N是指所有四個堿基A、C、G和T的混合物，而K是指僅有兩個堿基G和T的混合物，因此這樣一種三聯(lián)體編碼所有20個自然氨基酸以及琥珀終止密碼子TAG，其在用于噬菌粒生成和基因表達的大腸桿菌supE菌株XLl-blue(Bullock 等人.,BioTechniques5 (1987), 376-378)或 TGl (Sambrook 等人.,MolecularCloning.A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press)中被翻譯成谷氨酸胺。在組裝反應(yīng)中還使用了四個額外的寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQID NO: 22,SEQ ID NO: 23)，所述寡脫氧核苷酸具有對應(yīng)于非編碼鏈(以3’-5’方向?qū)懺贒NA雙鏈序列之下)并且填充上述寡脫氧核苷酸之間的間隔的固定核苷酸序列。兩個較短的側(cè)翼寡脫氧核苷酸(SEQ ID N0:24和SEQ ID NO:25)，其被過量添加并攜帶生物素基團，用作該組裝的完全合成的基因片段的PCR擴增引物。所述兩個側(cè)翼引物各包含BstXI限制性位點(CCANNNNNNTGG)，從而經(jīng)酶消化產(chǎn)生相互不兼容的突出。這種特殊的限制性位點的排列使其能夠特別高效地連接和克隆該合成基因。相對于原始的Lcn2序列，用氨基酸Gln28替代His對于引進第一個BstXI位點是必要的，而第二個自然存在于Lcn2的cDNA中。此外，未配對的殘基Cys87在基因組裝期間被Ser替換。在一鍋式PCR后，生成的基因片段被插入到提供Lcn2結(jié)構(gòu)基因的缺失部分的載體中。此圖示還分別描述了在被兩個BstXI限制性位點側(cè)翼的盒的上游和下游的兩個短引物(SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33)，其用于雙鏈DNA測序。圖2示出了合成的Lcn2基因的庫的核苷酸序列(只示出了被兩個BstXI限制性位點側(cè)翼的中央的盒，如圖1所示)。這個基因片段由Sloning BioTechnology GmbH制得。相比于圖1中描述的DNA庫有兩處不同。第一，只要有可能，對全部非突變氨基酸位置進行了針對大腸桿菌表達的密碼子優(yōu)化。第二，在20個隨機化位置處采用了 19個不同三聯(lián)體(GAC、TTC、CTG、CAC、AAT、AGC、ACC、GCA、ATG、CCT、GTT、TGG、GAG、CAA、ATC、GGA、CGT、GCA、TAC)的混合物，每一個編碼除Cys外的不同氨基酸，所述20個隨機化位置與圖1中描述的相同。這里的氨基酸編號與Sloning BioTechnology GmbH使用的內(nèi)部方案相對應(yīng)，由此Glyl號是直接跟隨上游BstXl限制性位點的第一個氨基酸密碼子。圖3A描述了人鐵調(diào)素(hHepcidin)特異的基于NGAL的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的某些氨基酸序列與野生型NGAL脂質(zhì)運載蛋白的多肽序列相比較的比對。所述NGAL衍生的鐵調(diào)素結(jié)合突變蛋白包含殘基I到178，這意味著它們具 有成熟野生型蛋白的長度。殘基179到186是鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽(Strep-tag )的序列，用于生成的突變蛋白的分離。圖3B描述了人鐵調(diào)素(hHepcidin)特異的基于NGAL的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的某些氨基酸序列與野生型NGAL脂質(zhì)運載蛋白的多肽序列相比較的比對。所述NGAL衍生的鐵調(diào)素結(jié)合突變蛋白包含殘基I到178，這意味著它們具有成熟野生型蛋白的長度。殘基179到186是鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽(Strep-tag )的序列，用于生成的突變蛋白的分離。圖4A示出了經(jīng)由接頭(淡灰色的粗斜體)融合至ABD結(jié)構(gòu)域(粗體)和鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽Str印-tag (斜體MASEQ ID NO:1的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的氨基酸序列(SEQID NO:15)。圖4B示出了由載體phNGAL98編碼、融合至鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽Str印-tag (斜體)和N端T7標(biāo)簽(粗斜體)的脂質(zhì)運載蛋白hNGAL的氨基酸序列(SEQ ID N0:34)。此多肽由phNGALlOl編碼。圖5示出了選定的Lcn2突變蛋白的直接ELISA的結(jié)果。圖6示出了選定的Lcn2突變蛋白的競爭性結(jié)合測定的結(jié)果。圖7示出了通過表面等離子體共振(SPR)測定的人和稱猴(cynomolgus)鐵調(diào)素-25的選定的突變蛋白的親和力。圖8示出了抗鐵調(diào)素-25脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的體外中和活性。圖9不出了針對鐵調(diào)素的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白中和注入小鼠體內(nèi)的人鐵調(diào)素。圖10 示出了 SEQ ID NO: 14-PEG 和 SEQ ID NOil-ABD (等于 SEQ ID NO: 15)的藥代動力學(xué)參數(shù)。發(fā)明詳沭一方面，本發(fā)明涉及針對或特異于鐵調(diào)素的新的特異性結(jié)合蛋白。本發(fā)明的蛋白可以用于治療和/或診斷目的。如本文使用地，如果能夠區(qū)分靶標(biāo)與一個或多個參照靶標(biāo)，本發(fā)明的蛋白“特異性結(jié)合”靶標(biāo)(這里為鐵調(diào)素)，因為結(jié)合特異性不是絕對的，而是相對的特性。例如，“特異性結(jié)合”可以例如根據(jù)蛋白質(zhì)印跡法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-試驗、FACS, IHC和肽掃描測定。針對或特異于鐵調(diào)素的本發(fā)明的蛋白，包括任意數(shù)量的基于定義蛋白骨架的特異性結(jié)合蛋白突變蛋白。本文使用的“突變蛋白”、“突變的”實體(不管是蛋白質(zhì)或核酸)或“突變體”，是指相對于天然存在的嘢生型)核酸或蛋白“參照”骨架，分別地交換、缺失或插入一個或多個核苷酸或氨基酸。本發(fā)明的蛋白可以為脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白，優(yōu)選地，脂質(zhì)運載蛋白選自視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)、載脂蛋白D (APO D)、嗜中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、淚脂質(zhì)運載蛋白(TLPC)、α 2_微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)、24p3/uterocalin (24p3)、von Ebners 腺蛋白 I (VEGPl)>von Ebners 腺蛋白 2 (VEGP2)和主要變應(yīng)原Can Π前體(ALL-1)。如本文使用地，脂質(zhì)運載蛋白被定義為重量為約18_20kDA的單體蛋白，其具有圓柱形β折疊片超二級結(jié)構(gòu)區(qū)，所述結(jié)構(gòu)區(qū)包含通過在一端的多個(優(yōu)選為4個)環(huán)逐對連接的多個(優(yōu)選為8個)β鏈，從而由此限定結(jié)合口袋。在脂質(zhì)運載蛋白家族成員中，正是所述環(huán)在本應(yīng)剛性的脂質(zhì)運載蛋白骨架中的這種多樣性產(chǎn)生多種不同的結(jié)合模式，每一種模式能容納不同大小、形狀和化學(xué)特征的靶標(biāo)(例如上文的Flower, D.R.(1996);上文的 Flower, D.R.等人(2000),或 Skerra, A.(2000) Biochim.Biophys.Actal482, 337-350中的綜述)。事實上，蛋白的脂質(zhì)運載蛋白家族已經(jīng)天然進化到結(jié)合范圍廣泛的配體，具有非常低水平的整體序列保守性(通常具有少于20%的序列同一性)，但保留高保守性的整個折疊模式。不同脂質(zhì)運載蛋白位置間的對應(yīng)關(guān)系為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，見，美國專利N0.7，25，0297。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的蛋白是脂質(zhì)運載蛋2 (Lcn2 ;也被稱為人嗜中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白，hNGAL或siderocalin)的突變蛋白。本文使用的術(shù)語“人嗜中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白”或“hNGAL”或“脂質(zhì)運載蛋白2”或“Lcn2”是指具有SWISS-PROT/UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號P80188的成熟hNGAL或SEQ ID NO: 35中所示的成熟hNGAL。這種蛋白的成熟形式具有全序列的氨基酸21至198，因為氨基酸1_20的信號肽被切掉。該蛋白質(zhì)進一步在成熟蛋白的位置76至175處的氨基酸殘基之間有二硫鍵形成。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其具有圓柱形β折疊片超二級結(jié)構(gòu)區(qū)，所述結(jié)構(gòu)區(qū)包含通過在一端的4個環(huán)逐對連接的8個β鏈，從而由此定義結(jié)合口袋，其中所述4個環(huán)中至少三個中每一個的至少一個氨基酸被誘變，并且其中所述脂質(zhì)運載蛋白以可檢測的親和力有效地結(jié)合作為給定非天然靶標(biāo)的鐵調(diào)素。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白在對應(yīng)于NGAL的線性多肽序列的位置36、40、41、49、52、
68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、和/或134的位置處具有一個或多個例如 1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個氨基酸替換。在本文中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在特定位置處具有突變的脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白的特定組，其顯示了對鐵調(diào)素的可檢測親和力以及特異性。適合突變的氨基酸位置包括人脂質(zhì)運載蛋白2的線性多肽序列的序列位置96、100和106。本發(fā)明還涉及編碼這些蛋白的核酸?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明設(shè)計以提供以可檢測的親和力結(jié)合鐵調(diào)素的蛋白質(zhì)突變蛋白的其它蛋白骨架包括:EGF樣結(jié)構(gòu)域，Kringle-結(jié)構(gòu)域，纖連蛋白型I結(jié)構(gòu)域，纖連蛋白II型結(jié)構(gòu)域，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域，PAN結(jié)構(gòu)域，Gla結(jié)構(gòu)域，SRCR結(jié)構(gòu)域，Kunitz/Bovine胰臟胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，淀粉酶抑肽(tendamistat), Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域，Trefoil (p型)結(jié)構(gòu)域，血管性血友病因子C型結(jié)構(gòu)域，過敏毒素樣結(jié)構(gòu)域，⑶B結(jié)構(gòu)域，甲狀腺球蛋白I型重復(fù)序列，LDL受體A類結(jié)構(gòu)域，Sushi結(jié)構(gòu)域，鏈接結(jié)構(gòu)域，血小板反應(yīng)蛋白I型結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域抗體或camel重鏈抗體)，C型凝集素結(jié)構(gòu)域，MAM結(jié)構(gòu)域，血管性血友病因子A型結(jié)構(gòu)域，生長調(diào)節(jié)素B結(jié)構(gòu)域，WAP型四個二硫化物核心結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)5/8C型結(jié)構(gòu)域，血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域，SH2結(jié)構(gòu)域，SH3結(jié)構(gòu)域，層粘連蛋白型EGF樣結(jié)構(gòu)域，C2結(jié)構(gòu)域,“Kappabodies” (II1.等人“Design andconstruction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavyand light chain variable regions，，Protein EnglO: 949-57 (1997) )，“Minibodies，，(Martin 等人“The affinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor ofhuman interleukin_6”EMB0 J13:5303-9 (1994))，“雙體” (Holliger 等人“‘Diabodies，，，:small bivalent and bispecific antibody fragments”PNAS USA90:6444-6448(1993))，“Janusins，，(Traunecker 等人“Bispecific single chain molecules (Janusins)target cytotoxic lymph ocytes on HIV infected cells” EMBO JlO:3655-3659 (1991)和 Traunecker 等人“Janusin:new molecular design for bispecific reagents” IntJ Cancer Suppl7:51-52 (1992)，納米抗體，adnectin，四連接素(tetranectin)，微體，affilin，affibody或錨蛋白，晶狀體蛋白，knottin，泛素，鋅指蛋白，自焚光蛋白，錨蛋白或錨蛋白重復(fù)序列蛋白或富亮氨酸重復(fù)序列蛋白，avimer (Silverman, Lu Q，Bakker A，ToWj Duguay A, Alba BM，Smith Rj Rivas A，Li P，Le Hj Whitehorn E，Moore KWj SwimmerCj Perlroth Vj Vogt M，Kolkman J，Stemmer WP2005, Nat Biotech，Dec;23(12):1556-61，E-Publication in Nat Biotech.2005Nov20版)；以及通過人受體結(jié)構(gòu)域家族的外顯子改組進化的多價 avimer 蛋白，其還描述于 Silverman Jj Lu Q，Bakker A, To Wj Duguay A, AlbaBMj Smith Rj Rivas A，Li P，Le Hj Whitehorn E，Moore KWj Swimmer C，Perlroth Vj VogtM，Kolkman J，Stemmer WP，Nat Biotech，Dec;23 (12):1556-61，E-Publication in Nat.Biotechnology.2005Nov20 版)。本發(fā)明的蛋白可包括突變氨基酸序列位置外的“親本”蛋白骨架(例如脂質(zhì)運載蛋白)的野生型(天然)的氨基酸序列；或者，脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白還可包括在進行誘變的序列位置外的氨基酸突變，所述氨基酸突變不干擾突變蛋白的結(jié)合活性和折疊。這種突變可以使用既定的標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook，j.等人(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual，2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY)在DNA水平實現(xiàn)。氨基酸序列可能的改變?yōu)椴迦牖蛉笔б约鞍被崽鎿Q。這樣的替換可以是保守的，即一個氨基酸殘基被一個化學(xué)相似的氨基酸殘基替換。保守替換的例子有以下組成員間的替換:1)丙氨酸，絲氨酸和蘇氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和賴氨酸；5)異亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸和纈氨酸；6)苯丙氨酸，絡(luò)氨酸和色氨酸。另一方面，還可以在氨基酸序列中引入非保守性改變。此外，除了替換單個的氨基酸殘基，也可以插入或缺失親本蛋白骨架一級結(jié)構(gòu)的一個或多個連續(xù)氨基酸，這些缺失或插入產(chǎn)生穩(wěn)定的折疊/功能性突變蛋白，其可容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員檢測。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解可用于制備本發(fā)明預(yù)期的、但其蛋白或核酸序列在本文中沒有明確地披露的蛋白突變蛋白的方法。作為一個概述，這種氨基酸序列的修改包括，例如，通過引入某些限制性酶的切割位點對單個氨基酸位置進行定點誘變，以便簡化突變的脂質(zhì)運載蛋白基因或其部分的亞克隆。此外，也可以引入這些突變以進一步提高脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白對給定靶標(biāo)的親和力。并且，如果必要，可以引入突變來調(diào)節(jié)突變蛋白的某些特征，如提高折疊穩(wěn)定性、血清穩(wěn)定性、蛋白抗性或水溶性，或用來減少聚合趨勢。例如，天然存在的半胱氨酸殘基可突變?yōu)槠渌被嵋苑乐苟蜴I形成。相應(yīng)地，本發(fā)明還包括本文披露的蛋白的功能變體，其與參照蛋白有閾值序列同一性或序列同源性?！巴恍浴被颉靶蛄型恍浴敝傅氖呛饬克鼈兊南嗨菩曰蜿P(guān)聯(lián)的序列特性。本發(fā)明使用的術(shù)語“序列同一性”或“同一性”是指本發(fā)明多肽序列與有關(guān)序列(同源性)比對之后，形成配對的相同殘基相對于這兩個序列較長一個的殘基數(shù)量的百分比。通過用相同殘基的數(shù)量除以殘基總數(shù)再使結(jié)果乘以100來測定百分同一性。本文使用的術(shù)語“同源性”為其通常含義，包括相同的氨基酸以及在兩蛋白線性氨基酸序列的等效位置被認(rèn)為保守替換的氨基酸(例如，用天冬氨酸殘基交換谷氨酸殘基)。最優(yōu)選地，SEQ ID N0:35中所示的氨基酸序列優(yōu)選地作為“參照序列”。SEQ ID NO: 35示出了成熟hNGAL。本文中術(shù)語“參照序列”和(NGAL的)“野生型序列”互換使用。另外，具有SWISS-PROT/UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號P80188的氨基酸序列可以作為參照序列。序列同源性或序列同一‘注，比如，可以使用程序BLASTP blastp2.2.5版(2002年 11 月 16 日；參見 Altschul, S.F.等人(1997)Nucl.Acids Res.25，3389-3402)進行測定。在這個實施方案中，同源性百分比基于包括前肽序列的完整多肽序列比對(matrix:BL0SUM62 ；gap costs: 11.1 ;截距值設(shè)定為1(Γ3),優(yōu)選地在配對比較中使用野生型蛋白骨架作為參照。其計算為，以BLA STP程序輸出的結(jié)果表示的“陽性氨基酸”(同源氨基酸)數(shù)除以程序選擇用于比對的氨基酸總數(shù)的百分比。還可以特意地將其它氨基酸序列位置突變?yōu)榘腚装彼嵋砸胄碌姆磻?yīng)性基團，例如，用于綴合至其它化合物，如聚乙二醇(PEG)、羥乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白質(zhì)，或用于形成非天然存在的二硫鍵。關(guān)于人脂質(zhì)運載蛋白2的突變蛋白，將半胱氨酸殘基引入到包括人脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白的脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列這種突變的示例性可能性包括在對應(yīng)于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的序列位置至少一個處引入半胱氨酸(Cys)。在一些實施方案中，本發(fā)明的人脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白的序列相比于SWISS-PROT/UniProt數(shù)據(jù)庫登錄號P80188的序列，半胱氨酸已被另一個氨基酸殘基替換，所述相應(yīng)的半胱氨酸可以被重新引入所述序列。作為一個說明性的例子，在這種情況下，通過恢復(fù)到最初存在于SWISS-PR0T登錄號P80188序列中的半胱氨酸，可以引入氨基酸位置87處的半胱氨酸殘基。在氨基酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146和/或158任一處的一側(cè)生成的硫醇部分可用于PEG化或HES化突變蛋白，例如，以增加相應(yīng)人脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白的血清半衰期。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用時，術(shù)語“位置”是指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。本文使用的術(shù)語“相應(yīng)的”還包括不僅由前面的核苷酸/氨基酸數(shù)量決定的位置。因此，可以被替換的根據(jù)本發(fā)明的給定氨基酸的位置可以由于缺失或添加(變體或野生型)脂質(zhì)運載蛋白中別處的氨基酸而改變。類似地，可以被替換的根據(jù)本發(fā)明的給定核苷酸的位置可以由于缺失或添加突變蛋白中別處的核苷酸或包含啟動子和/或任意其它調(diào)節(jié)序列或基因(包括外顯子和內(nèi)含子)的野生型脂質(zhì)運載蛋白5’ -非翻譯區(qū)(UTR)而變化。因此，根據(jù)本發(fā)明在“相應(yīng)的位置”下，優(yōu)選地理解為核苷酸/氨基酸在所示的數(shù)字方面可以不同，但仍可以有類似的鄰近核苷酸/氨基酸?？梢越粨Q、缺失或添加的所述核苷酸/氨基酸也被術(shù)語“相應(yīng)的位置”所包含。當(dāng)本文使用“在對應(yīng)于一個位置的位置處”時，在“查詢”氨基酸(或核苷酸)序列中的位置是指對應(yīng)于“主體”氨基酸(或核苷酸)序列中的位置。特別地，為了確定不同于本發(fā)明NGAL脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的脂質(zhì)運載蛋白氨基酸序列的核苷酸殘基或氨基酸殘基是否對應(yīng)于所述NGAL脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的核苷酸序列或氨基酸序列，尤其是SEQ ID NO: 1-14中的任意一個或在NGAL線性多肽序列的位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 / 或 134 具有一個或多個(例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個)氨基酸替換的序列，技術(shù)人員可以利用本領(lǐng)域熟知的手段和方法，如手動地或通過使用計算機程序如BLAST2.0比對，所述BLAST2.0代表基本局部比對搜索工具或ClustalW或任意其它適用于生成序列比對的合適程序。因此，具有SEQ ID NO: 1-14中任一個或在NGAL線性多肽序列的位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 / 或134處或本文所述任意其它位置處具有一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)氨基酸替換的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可以用作“主體序列”，而不同于NGAL的脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列用作“查詢序列”。鑒于以上，本領(lǐng)域技術(shù)人員因此容易在一個位置來確定本文描述的Lcn2中突變的哪個氨基酸位置對應(yīng)于除Lcn2以外骨架的氨基酸，優(yōu)選如本文描述那些中的一個。具體地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員 將本文所述突變蛋白的氨基酸序列(特別是本發(fā)明的NGAL突變蛋白(或anticalin))與不同脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列進行比對，以確定所述突變蛋白的哪個(哪些)氨基酸對應(yīng)于所述不同脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列的相應(yīng)氨基酸。更具體地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員能因此確定所述不同脂質(zhì)運載蛋白的氨基酸序列的哪個氨基酸對應(yīng)于在位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、和 / 或 134 處的氨基酸或?qū)?yīng)于NGAL線性多肽序列的本文所述的任意其它位置處的氨基酸。針對或特異于鐵調(diào)素的本發(fā)明的蛋白包括任意數(shù)量的基于所定義蛋白骨架的特異性結(jié)合蛋白突變蛋白。優(yōu)選地，所述骨架為hNGAL。如本文使用地，“突變蛋白”、“突變的”實體(不管是蛋白質(zhì)還是核酸)或“突變體”是指，相對于天然存在的(野生型)核酸或蛋白“參照”骨架，分別地交換、缺失或插入一個或多個核苷酸或氨基酸。優(yōu)選地，分別地進行交換、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的數(shù)量為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多如25、30、35、40、45或50。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明的突變蛋白仍然能夠結(jié)合鐵調(diào)素。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的蛋白以ΙΟΟμΜ或更少(包括5μΜ或更少，約500nM,約200nM或更少，IOOnM或更少，InM或更少，或0.1nM或更少)的Kd結(jié)合鐵調(diào)素。本發(fā)明的蛋白可以特異地結(jié)合鐵調(diào)素的成熟、折疊生物活性形式的一個或多個連續(xù)、不連續(xù)或構(gòu)象表位。本發(fā)明的蛋白能夠以可測定的親和力結(jié)合鐵調(diào)素，即離解常數(shù)為至少200nM，即Kd為約200nM或更少。在一些實施方案中，本發(fā)明的蛋白以至少約ΙΟΟηΜ、約50nM、約25nM、約15nM、約5nM、約2nM、約0.5nM、約0.25nM、約0.1nMj^J 0.05nM或更少的離解常數(shù)結(jié)合鐵調(diào)素。本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地以Kd為約IOnM或更強的親和力結(jié)合至成熟人鐵調(diào)素分子。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合親和力通常為Kd低于約InM，在一些情況下，為約0.1nM和更低。本發(fā)明蛋白(例如脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白)對選定靶標(biāo)(在本發(fā)明中為鐵調(diào)素)的結(jié)合親和力，可以通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的大量方法來測定(由此可以測定突變蛋白-配體復(fù)合物的Kd值)。這些方法包括、但不限于，熒光滴定法、競爭ELISA、量熱法如等溫滴定量熱法(ITC)、和表面等離子體共振(BIAcore)。本領(lǐng)域完備地創(chuàng)建了這些方法，并且下面詳細介紹其實例。本發(fā)明蛋白的氨基酸序列與成熟人脂質(zhì)運載蛋白2或其它脂質(zhì)運載蛋白可具有高序列同一性。在本文中，本發(fā)明的蛋白與選自SEQ ID NO: 1-14的序列的蛋白可具有至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%同一性，包括至少95%同一性。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)性同系物在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的位置36、40、41、49、52、68、70、72、
73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 / 或 134 的一個或多個位置處(如 2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個位置處)仍然具有氨基酸替換。本發(fā)明還包括選自SEQ ID N0:l-14的序列的蛋白的結(jié)構(gòu)性同系物，其具有大于約60%的氨基酸序列同源性或序列同一性，優(yōu)選地大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于92%以及最優(yōu)選地大于95%。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)性同系物在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 / 或 134 的一個或多個位置處(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個位置處)仍然具有氨基酸替換。術(shù)語“鐵調(diào)素”指也被稱為肝表達抗菌肽I或假定的肝腫瘤抑制劑(regressor)的蛋白，其人類形式具有UniProtKB/Swiss-Prot登錄號P81172。在一般基礎(chǔ)上，術(shù)語“鐵調(diào)素”指已知存在于脊椎動物物種(包括哺乳動物)中的鐵調(diào)素蛋白的任意形式。人未加工蛋白具有84個氨基酸的長度，并且由基因“HAMP”編碼，也被稱為“HEPC”或“LEAP1”。其被切割成兩條鏈，本文中也包括在術(shù)語“鐵調(diào)素”中。這兩條鏈為具有氨基酸60 - 84的鐵調(diào)素-25 (11印025)和具有氨基酸65 - 84的鐵調(diào)素-20 (H印c20)。鐵調(diào)素-25以彎曲的發(fā)夾形式排列，通過四個二硫鍵穩(wěn)定。天然變體也包括在術(shù)語“鐵調(diào)素”中，其具有例如氨基酸替換 59R — G (VARJM25129);氨基酸替換 70C — R (VARJM2513);氨基酸替換 7IG — D(VAR_026648)或氨基酸替換78C —Y (VAR_042514)。另一天然變體為鐵調(diào)素_22，是鐵調(diào)素-25的另一 N端截短的同種型(除了鐵調(diào)素-20)。本文使用的術(shù)語“成熟鐵調(diào)素”指任意成熟的、生物活性形式的鐵調(diào)素蛋白，其在脊椎動物如哺乳動物中表達。術(shù)語“鐵調(diào)素”指存在于人體內(nèi)的鐵調(diào)素蛋白的任意形式。表達“人鐵調(diào)素-25”指具有描述于SEQ ID N0:28中的氨基酸序列的人鐵調(diào)素的成熟形式。在本發(fā)明中提供的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白能夠結(jié)合鐵調(diào)素的每一個給定形式，包括其蛋白水解片段，而不管各自的鐵調(diào)素分子是否顯示生物/生理活動。因此，鐵調(diào)素分子可能只存在于生物樣品中，而沒有任意可測量的生理相關(guān)性。例如，見，到目前為止鐵調(diào)素-22只有在尿液中檢測到，迄今為止被認(rèn)為僅僅是鐵調(diào)素-25的一種尿降解產(chǎn)物(綜述于Kemna等人，Haematologica.2008Jan;93: (1)90-97)。本發(fā)明的突變蛋白當(dāng)然也可以結(jié)合生理活性種類，如成熟的、生物活性的鐵調(diào)素-25。因此，本發(fā)明的突變蛋白可被用作診斷性的和/或藥物，這取決于選擇的要識別的鐵調(diào)素。根據(jù)上文，本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地作為鐵調(diào)素分子的拮抗劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的蛋白(如，人脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白)通過抑制鐵調(diào)素分子結(jié)合至或者與膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白相互作用的能力，可以作為鐵調(diào)素分子的拮抗劑。鐵調(diào)素可以為成熟人鐵調(diào)素形式，如鐵調(diào)素-25或鐵調(diào)素-20。成熟鐵調(diào)素與膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)合導(dǎo)致膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解，這是具有細胞表面/膜位置的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)過程。另一方面，本發(fā)明包括各種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，包括特異地結(jié)合鐵調(diào)素的人脂質(zhì)運載蛋白2的突變蛋白。在這個意義上，鐵調(diào)素可以看作野生型人脂質(zhì)運載蛋白2的非天然配體，這里“非天然配體”指不結(jié)合至野生型脂質(zhì)運載蛋白的化合物，包括生理條件下的人脂質(zhì)運載蛋白2。通過工程化野生型脂質(zhì)運載蛋白，如在某些位置誘變?nèi)酥|(zhì)運載蛋白2，本發(fā)明人證明了對非天然配體的高親和力和高特異性是可能的。一方面，至少在編碼 hLcn2 線性多肽序列的序列位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和/ 或 134 的任意處的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18,19和/或20個核苷酸三聯(lián)體·處，可以通過允許用核苷酸三聯(lián)體的子集在這些位置處進行替換，進行隨機突變。本文描述的本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白中的氨基酸替換優(yōu)選地在脂質(zhì)運載蛋白(優(yōu)選hNGAL)的一個、兩個、三個或四個環(huán)區(qū)域內(nèi)。所述環(huán)區(qū)域來自hNGAL的位置33至 54 (環(huán) 1)、66 至 83 (環(huán) 2)、94 至 106 (環(huán) 3)和 123 至 136 (環(huán) 4)。24-36、53_66、79_84和 103-110。進一步的，所述脂質(zhì)運載蛋白可以用來生成具有突變的氨基酸殘基的突變蛋白，所述突變的氨基酸殘基在對應(yīng)于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列的序列位置96、100和106的序列位置的任一個或多個處，包括至少在任意兩個或全部三個處。例如，在序列位置96處的替換可為替換Asn 96 — Arg、Asp、Gin、Gly、Lys、Ser、Thr或Val。例如，在序列位置100處的替換可為替換TyrlOO — Ala、Arg、Glu、Gin、Gly、Ser和Val。例如，在序列位置106處的替換可為替換Tyrl06 — lie、Gly、Phe、Val或Arg。相對于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列，在一些實施方案中的本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 —Val和TyrlOO —Gin。在這樣的實施方案中，在位置106處的酪氨酸可以不變。相對于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列，在一些實施方案中的本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 — Arg、Tyrl00 — Glu和Tyrl06 — Phe。在一些實施方案中，本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 — Asp、Tyrl00 — Ser和Tyrl06 — Gly。在一些實施方案中，本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 — Gly、Tyrl00 — Gly和Tyrl06 — Gly。在一些實施方案中的本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 —Lys、Tyrl00 —Ala和Tyrl06 — lie。在一些實施方案中，本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 — Ser、Tyr 100 — Arg和Tyr 106 — Val。在一些實施方案中的本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 — Ser、TyrlOO — Val和Tyrl06 — Arg。在一些實施方案中，本發(fā)明突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Asn96 — Thr、TyrlOO — Val和Tyrl06 — Gly。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白進一步包括在成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列中位置134處的突變的氨基酸殘基。在一個實施方案中，所述替換為Lysl34 — Trp0在一些實施方案中，典型地除了在序列位置96、100和106 (上文)的一處或多處突變，本發(fā)明的突變蛋白在對應(yīng)于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列的序列位置52、68、81、127的序列位置中的任意一處或多處包括突變的氨基酸殘基。例如，所述突變蛋白在成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列內(nèi)包括替換Tyr52 — His,Leu,Phe或Trp。所述突變蛋白還可在成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列內(nèi)包括替換Ser68 — Arg、Gly或IIe。所述突變蛋白還可包括替換Arg81 — Glu、Gly或Gin。例如,所述突變蛋白可在成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列內(nèi)包括替換Serl27 — Thr或Trp。相對于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列，在一些實施方案中的本發(fā)明的突變蛋白具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — His、Ser68 — Arg、Arg81 — Ser和Serl27 — Trp。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — Leu、Ser68 — Arg、Arg81 — Glu 和 Serl27 — Trp。在一些實施方案中的本發(fā)明的突變蛋白具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — Phe、Ser68 — Gly、Arg81 — Gly和Serl27 — Trp。在一些實施方案中的本發(fā)明的突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — Trp、Ser68 — lie、Arg81 — Gln 和 Serl27 — Trp。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — Trp、Ser68 — Arg、Arg81 — Glu和Serl27 — Trp。關(guān)于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2的序列,在一些實施方案中的本發(fā)明的突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — Trp、Ser68 — Arg、Arg81 — Glu和Serl27 — Thr。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可具有以下氨基酸替換集合:Tyr52 — Trp> Ser68 — Arg、Arg81 — Glu 和 Serl27 — Trp。在本發(fā)明的進一步的實施方案中，所`述突變蛋白在對應(yīng)于hNGAL線性多肽序列的序列位置 33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、
77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和138的序列位置的任意處或在其它脂質(zhì)運載蛋白上的相應(yīng)位點處包括至少1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個突變的氨基酸殘基。在進一步的實施方案中，所述突變蛋白在對應(yīng)于hNGAL線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、
47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 138 的任一處或在其它脂質(zhì)運載蛋白上的相應(yīng)位點處包括至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個突變的氨基酸殘基。仍然在進一步的實施方案中，所述突變蛋白在人脂質(zhì)運載蛋白2線性多肽序列的序列位置 33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、
72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136和138的任一處或在其它脂質(zhì)運載蛋白上的相應(yīng)位點處包含18、19或20個突變的氨基酸殘基。例如，關(guān)于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，本發(fā)明的突變蛋白可包括:Leu36 — Ala, Cys, Thr, Val ；Ala40 — Arg, Glu, Gly 和 Ser ；Ile41 — He, Leu, Met 或 Val ；Gln49 — Leu 或 Met ；Leu70 — Asp, Asn, Gin, Met 或 Phe ；Arg72 — Glu, Gly, Leu 或 Val ；Lys73 — Ala, Arg, Glu, Gly, Leu, Thr 或 Tyr ；Asp77 — Arg, Glu, Gly, Leu, Ser 或 Val ；Trp79 — Gly, Leu, Ser, Tyr 或 Val ；Leul03 — Ala, Arg, Gly 或 Trp ；Tyrl06 — Gly, He,Phe 或 Val ；Lysl25 — Arg, Leu, Met, Phe, Thr,或 Val ;和 Tyrl32 — Leu 或 Val 中的一個或多個氨基酸替換，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個。例如，關(guān)于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2線性多妝序列，本發(fā)明的突變蛋白可具有Ala36、Ser40、Leu41、Met49、Asn70、Gly72、Gly73、Ser77、Leu79、Leul25 和 Vall32 的氨基酸組合集合。例如，關(guān)于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2序列，本發(fā)明的突變蛋白可具有Leu36、Arg40、Val41、Gln49、Asp70、Arg72、Thr73、Leu77、Ser79、Thrl25和Vall32的氨基酸組合集合。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可具有 Leu36、Glu40、Ile41、Leu49、Gln70、Gly72、Glu73、Gly77、Gly79、Phel25和Vall32的氨基酸組合集合。本發(fā)明的突變蛋白還可具有Leu36、Glu40、Ile41、Met49、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Vall25、Vall32 的氨基酸組合集合或 Leu36、Glu40、Val41、Met49、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Thrl25 和 Val 132 的氨基酸組合集合。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白可具有Leu36、Glu40、Val41、Met49、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Val 125 和 Val 132 的氨基酸組合集合或 Thr36、Ser40、Ile41、Gln49、Phe70、Glu72、Gly73、Arg77、Val79、Vall25 和 Leul32 的氨基酸組合集合。作為進一步的例子，本發(fā)明的突變蛋白可具有Val36、Glu40、Met41、Leu49、Met70、Glu72、Tyr73、Val77、Leu79、Argl25和Vall32的氨基酸組合集合。本發(fā)明的突變蛋白還可具有Val36、Gly40、Leu41、Leu49、Leu70、Val72、Arg73、Arg77、Tyr79、Metl25 和 Val 132 的氨基酸組合隹A
口 O在本發(fā)明的一個實施方案中，所述突變蛋白在以上所列序列位置的至少任意10、14、15、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、35或所有45處包括突變的氨基酸殘基。本發(fā)明結(jié)合至鐵調(diào)素的突變蛋白可以相對于成熟人脂質(zhì)運載蛋白2野生型氨基酸序列(Lcn2)包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個氨基酸替換，其包括、但不限于，Leu36 — Val 或 Cys、Ala40 — Tyr 或 Lys 或 Val、Ile41 — Thr 或 Ser 或Leu、Gln49 — Leu 或 Trp、Leu70 — Gly、Arg72 — Gly 或 Asp、Lys73 — Leu 或 Thr 或 Asp、Asp77 — Asn 或 His 或 Leu、Trp79 — Lys、Asn96 — lie 或 Arg、Tyrl00 — Gln 或 Arg 或 Glu、Leul03 — Met 或 Arg 或 Gly、Tyrl06 — Tyr 或 Ala 或 Trp、Lysl25 — Thr 或 Val 或 Glu、Serl27 — Gly 或 Gln 或 Ala、Tyrl32 — Met 或 Ser 或 Thr、和 Lysl34 — Asn。在一個實施方案中，本發(fā)明結(jié)合至鐵調(diào)素的突變蛋白包括以下氨基酸替換:Leu36 — Val、Ala40 — Tyr、Ile41 — Thr、Gln49 — Leu、Leu70 — Gly、Lys73 — Leu、Asp77 — Asn、Trp79 — Lys、Asn96 — lie、TyrlOO — Gin、Leul03 — Met、Lysl25 — Thr、Ser 127 — Gly、Tyrl32 — Met和Lysl34 — Asn。在進一步的實施方案中，本發(fā)明結(jié)合至鐵調(diào)素的突變蛋白包括以下氨基酸替換:Leu36 — Val、Ala40 — Lys、Ile41 — Ser、Gln49 — Trp、Leu70 一 Gly、Arg72 一 Gly、Lys73 一 Thr、Asp77 一 His、Trp79 一 Lys、Asn96 一 Arg、TyrlOO — Arg、Leul03 — Arg、Tyrl06 — Ala、Lysl25 — Val、Serl27 — Gln、Tyrl32 — Ser和Lysl34 — Asn。在另一個實施方案中，本發(fā)明結(jié)合至鐵調(diào)素的突變蛋白包括以下氨基酸替換:Leu36 — Cys、Ala40 — Val、Ile41 — Leu、Gln49 — Leu、Leu70 — Gly、Arg72 — Asp、Lys73 — Asp、Asp77 — Leu、Trp79 — Lys、Asn96 — Arg、TyrlOO — Glu、Leul03 — Gly、Tyrl06 — Trp> Lysl25 — Glu、Serl27 — Ala、Tyrl32 — Thr 和 Lysl34 — Asn。相對于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白可進一步包括氨基酸替換Gln28 — Hi s。相對于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白可進一步包括氨基酸替換Lys62 — Argo此外，相對于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白可包括氨基酸替換Phe71 — Pro或Ser。相對于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，可存在于本發(fā)明的突變蛋白中的其它氨基酸替換為替換Lys74 — Glu0還可包括于本發(fā)明的突變蛋白中的其它氨基酸替換為替換Lys75 — Glu。相對于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，本發(fā)明的突變蛋白還可包括氨基酸替換Cys87 — Ser0本發(fā)明的突變蛋白還可包括氨基酸替換Serl46 — Pro0相對于成熟hLcn2野生型氨基酸序列，可存在于本發(fā)明突變蛋白中的其它氨基酸替換為替換Glul47 — Gly0本發(fā)明的突變蛋白還可包括其它氨基酸替換。所述突變蛋白可以進一步包括氨基酸替換，例如Tyr52 — Gln或Val ；Ser68 — Lys或Asn ；或 Arg81 — Trp、Asn 或 His。本發(fā)明的突變蛋白典型地以單體蛋白存在。然而，同樣可行的是本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白能夠自發(fā)地二聚化或低聚化。雖然形成穩(wěn)定單體的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的使用可能優(yōu)選地用于一些應(yīng)用，例如由于更快的擴散和更好的組織穿透力，形成穩(wěn)定的同型二聚體或多聚體的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的使用在其它情況下可能是有利的，因為這些多聚體可以為給定標(biāo)靶提供(進一步)增強的吸引力和/或親和力。此外，脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的低聚物形式可具有更慢的離解速率或延長的血清半衰期。本發(fā)明還指出，各突變蛋白和其配體間復(fù)合物的形成受許多不同因素影響，所述因素如各結(jié)合配偶體的濃度、競爭者的存在、PH和使用的緩沖系統(tǒng)的離子強度、以及用于離解常數(shù)Kd測定的實驗方法(例如熒光滴定法、競爭ELISA或表面等離子體共振，僅舉幾例)或甚至用于評價實驗數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)算法。

因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員也清楚Kd值(在各突變蛋白和其靶標(biāo)/配體間形成的復(fù)合物的離解常數(shù))可能在某個實驗范圍內(nèi)變化，這取決于用于測定特定脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白對給定配體的親和力的方法和實驗設(shè)置。這意味著所測得的Kd值可能會有輕微的偏差或耐量范圍，例如，取決于該Kd值是通過表面等離子體共振(Biacore)、競爭ELISA、還是“直接ELISA”測定的。在一個實施方案中，本文披露的突變蛋白可以從N或C端連接至親和力標(biāo)簽如五組氨酸標(biāo)簽、六組氨酸標(biāo)簽或鏈霉親和素標(biāo)簽(例如，Streptagi )。因此，本申請還包括裝備有這些標(biāo)簽的所有明確地和一般描述的突變蛋白。本發(fā)明與特征脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白片段聯(lián)合使用的術(shù)語“片段”涉及來源于N端和/或C端縮短的(例如，缺少N端和/或C端氨基酸的至少一個)全長成熟Lcn2的蛋白或肽。這種片段優(yōu)選地包括成熟Lcn2 —級序列的至少10個、更優(yōu)選20個、最優(yōu)選30個或更多個連續(xù)氨基酸，并且在成熟Lcn2的免疫測定中通常是可檢測的。本文使用的詞“檢測”理解為在定量和定性水平上以及它們的組合。從而其包括目標(biāo)分子的定量、半定量和定性測定。因此，可以測定例如在樣品中的分子如鐵調(diào)素的存在或不存在，以及其濃度或水平。上述突變蛋白也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)，就其免疫原性已經(jīng)對所述蛋白進行改變，以減少通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測到的任何免疫原性。細胞毒性T細胞識別與I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子相關(guān)合的抗原呈遞細胞的細胞表面上的肽抗原。肽結(jié)合MHC分子的能力具有等位基因特異性并且和它們的免疫原性相關(guān)。為了減少給定蛋白的免疫原性，預(yù)測蛋白中的哪些肽具有結(jié)合至給定的MHC分子的潛力的能力具有很大的價值。之前已經(jīng)描述了采用計算線程方法(computationalthreading approach)來識別潛在的T細胞表位的方法，以預(yù)測給定肽序列與MHC I類分子的結(jié)合(Altuvia等人(1995) J.Mol.Biol.249:244-250)。這種方法也可以用來識別在本發(fā)明突變蛋白中的潛在T細胞表位，以及取決于其預(yù)期用途，基于其預(yù)測的免疫原性進行特定突變蛋白的選擇。進一步可能的是，使已經(jīng)預(yù)測包含T細胞表位的肽區(qū)域進行另外的誘變，以減少或消除這些T細胞表位以及因此使免疫原性最小化。已經(jīng)描述了從基因工程抗體中去除兩性表位(Mateo等人(2000)Hybridomal9 (6):463-471),并且可以適于本發(fā)明的突變蛋白。由此獲得的突變蛋白可以擁有最小化的免疫原性，這對于它們在治療和診斷應(yīng)用中的使用是理想的，所述應(yīng)用比如下面描述的那些。對于某些應(yīng)用，使用本發(fā)明突變蛋白的綴合形式同樣是有用的。因此，本發(fā)明還涉及綴合至化合物的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，所述化合物包括、但不限于有機分子、酶標(biāo)記、有色標(biāo)記、細胞抑制劑、毒素、可光活化的標(biāo)記(其適用于光動力治療)、熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、顯色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、金屬絡(luò)合物、金屬如膠體金、半抗原、地高辛、生物素、化學(xué)治療劑金屬或化學(xué)治療劑金屬，僅列舉幾個有代表性的例子。所述突變蛋白也可綴合至有機藥物分子。所述綴合可以使用本領(lǐng)域已知的任意傳統(tǒng)耦合方法進行。本文使用于非天然靶標(biāo)的術(shù)語“有機分子”或“有機小分子”表示一種有機分子，其包含至少兩個碳原子，但優(yōu)選地不多于7或12個可選轉(zhuǎn)的碳鍵，具有范圍在100至2000道爾頓的分子量，優(yōu)選地在100至1000道爾頓間，并且可選擇地包含一個或兩個金屬原子。一般來說 ，可以用任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)或酶標(biāo)記本文描述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，所述化學(xué)物質(zhì)或酶直接或間接地生成在化學(xué)、物理、光學(xué)、或酶反應(yīng)中可檢測的化合物或信號。物理反應(yīng)(同時為光學(xué)反應(yīng)/標(biāo)記物)的實例是照射時熒光的發(fā)射。堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或半乳糖苷酶是酶標(biāo)記(同時為光學(xué)標(biāo)記)的實例，其催化顯色反應(yīng)產(chǎn)物的形成。一般來說，通常用于抗體的所有標(biāo)記(除了只能和免疫球蛋白Fe部分中的糖部分一起使用的那些)也可以用于綴合到本發(fā)明的突變蛋白。本發(fā)明的突變蛋白也可以和任何合適的治療活性劑綴合，例如，用于將這種制劑靶向遞送到給定細胞、組織或器官或用于細胞(例如腫瘤細胞)的選擇性靶向，而不影響周圍的正常細胞。這種治療活性劑的實例包括放射性核素、毒素、有機小分子和治療肽(如用作細胞表面受體的激動劑/拮抗劑的肽或競爭給定細胞靶標(biāo)上的蛋白結(jié)合位點的肽)。合適的毒素的例子包括、但不限于百日咳毒素、白喉毒素、蓖麻毒素、皂草素、假單胞菌外毒素、卡里奇霉素或其衍生物、紫杉燒、美登素、tubulysin或尾海兔素類似物。所述尾海兔素類似物可以為auristatin E、monomethylauristatin E、auristatin PYE 和 auristatin PHE。細胞抑制劑的例子包括、但不限于順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、五氟脲嘧啶、泰索帝(紫杉萜)、紫杉醇、蒽環(huán)霉素(阿霉素)、甲氨蝶呤、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、達卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿霉素、Camptotecine、Combretatastin A_4相關(guān)化合物、磺酰胺類、卩惡二唑啉、苯并[b]噻吩合成螺縮酮卩比喃、單四氫呋喃化合物、curacin和curacin衍生物、甲氧雌二醇衍生物和亞葉酸。本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白也可以和治療活性核酸綴合，所述核酸如反義核酸分子、小干擾RNA、微RNA或核酶。這樣的綴合物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生。
在一個實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白也可以耦合到靶向特定的人體區(qū)域的靶向部分，以便將本發(fā)明的突變蛋白遞送到體內(nèi)期望區(qū)域或范圍。其中可能需要這種修飾的一個實例為血腦屏障的穿過。為了穿過血腦屏障，本發(fā)明的突變蛋白可以耦合到促進通過這種屏障的主動轉(zhuǎn)運的部分(參見GaIIlard PJ等人(2005)International Congress Series.1277, 185-198 或 GaIIlard PJ 等人(2005)ExpertOpin Drug Deliv.2 (2)，299-309)。這種化合物例如可以以商標(biāo) 2B-Trans 獲得(to_BBBtechnologies BV, Leiden, NL)。其它可I禹合至本發(fā)明突變蛋白的示例性祀標(biāo)分子包括抗體、抗體片段或?qū)ζ谕袠?biāo)分子有親和力的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。靶向部分的靶標(biāo)分子例如可以是細胞表面抗原。細胞表面抗原例如可以特異于細胞或組織類型，如，癌癥細胞。這種細胞表面蛋白的示例性例子為HER-2或蛋白聚糖如NEU-2。正如上文所說，本發(fā)明的突變蛋白在一些實施方式中可以綴合至延長所述突變蛋白血清半衰期的化合物(這一點也參見PCT公開文件W02006/56464，其中參考對CTLA-4有結(jié)合親和力的人嗜中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白描述了這種綴合策略)。延長血清半衰期的化合物可以是聚亞烷基二醇分子，例如聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物；輕乙基淀粉，脂肪酸分子，如棕櫚酸(Va j o&Duckworth (2000) Pharmaco 1.Rev.52，1-9)，免疫球蛋白的Fe部分，免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域，白蛋白或其片段，白蛋白結(jié)合肽，白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)鐵蛋白，或標(biāo)簽Pro-Ala-Ser,僅列幾個例子。白蛋白結(jié)合蛋白可以是細菌白蛋白結(jié)合蛋白、抗體、抗體片段(包括結(jié)構(gòu)域抗體，例如參見美國專利6，696，245)、或?qū)Π椎鞍拙哂薪Y(jié)合活性的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。相應(yīng)地，用于延長本發(fā)明脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的半衰期的適合的綴合化合物包括白蛋白(Osborn 等人(2002) J.Pharmacol.Exp.Ther.303, 540-548),或白蛋白結(jié)合蛋白，
例如細菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如一種鏈球菌蛋白G (Konig，T.和Skerra，A.(1998)J.1mmunol.Methods218, 73-83)?？梢杂米骶Y合配偶體的白蛋白結(jié)合肽的其它實例例如具有 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 共有序列的那些，其中 Xaa1 是 Asp、Asn、Ser> Thr 或 Trp ；Xaa2 是 Asn、Gin、His、lie、Leu 或 Lys ；Xaa3 是 Ala、Asp、Phe、Trp 或 Tyr ；Xaa4 是 Asp、Gly、Leu、Phe、Ser 或 Thr，如美國專利申請 2003/0069395 或 Dennis 等人(Dennis 等人(2002)J.Biol.Chem.277，35035-35043)中所述。在其它實施方案中，可以將白蛋白自身或白蛋白的生物活性片段用作本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的化合物，以延長所述突變蛋白的血清半衰期。術(shù)語“白蛋白”包括所有的哺乳動物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白?？梢砸灾亟M方式生成白蛋白或其片段，如美國專利5，728，553或歐洲專利申請EP0330451和EP0361991中所述。用作蛋白穩(wěn)定劑的重組人白蛋白(Recombumin )例如可以購自Novozymes DeltaLtd.(Nottingham, UK)。如果白蛋白結(jié)合蛋白是抗體片段，則其可以是結(jié)構(gòu)域抗體。設(shè)計結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)以允許精確控制生物物理特性和體內(nèi)半衰期，以獲得最佳安全性和有效產(chǎn)品特征。結(jié)構(gòu)域抗體例如可從Domantis Ltd.(Cambridge, UK和MA, USA)商購獲得。將轉(zhuǎn)鐵蛋白用作延長本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期的部分，可以以基因工程方式將所述突變蛋白融合至 非糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白的N或C端或二者。非糖基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白的半衰期為14-17天，而轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白將類似地具有延長的半衰期。轉(zhuǎn)鐵蛋白載體還提供高的生物利用度、生物學(xué)分布和循環(huán)穩(wěn)定性。此技術(shù)可從BioRexis (BioRexisPharmaceutical Corporation, PA, USA)商購獲得。用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(DeltaFerrin )也可從 Novozymes Delta Ltd.(Nottingham, UK)商購獲得。如果將免疫球蛋白的Fe部分用于延長本發(fā)明突變蛋白的血清半衰期的目的，可以使用可從 Syntonix Pharmaceuticals, Inc (MA, USA)商購獲得的 SynFusion 技術(shù)。使用此Fe-融合技術(shù)允許產(chǎn)生更長效作用的生物藥劑，并且可以例如包含連接至抗體的Fe區(qū)域的兩個拷貝的突變蛋白，以改善藥代動力學(xué)、溶解性和生產(chǎn)效率。又一個延長本發(fā)明突變蛋白的半衰期的選擇是將長的非結(jié)構(gòu)化的柔性富甘氨酸序列(例如具有約20至80個連續(xù)甘氨酸殘基的多甘氨酸)融合至本發(fā)明的突變蛋白的N或C端。此方法例如公開于W02007/038619，還被稱為“rPEG”(重組PEG)。如果聚亞烷基二醇用作延長突變蛋白半衰期的化合物，則聚亞烷基二醇可以是取代的或未取代的。它還可以是活化的聚亞烷基衍生物。適合的化合物的實例為聚乙二醇(PEG)分子，如描述于W099/64016、美國專利6，177,074或涉及干擾素的美國專利6，403，564中，或者已針對其它蛋白質(zhì)例如PEG-修飾的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脫氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶所描述的(例如參見Fuertges等人(1990) “TheClinical Efficacy of Poly (Ethylene Glycol) -Modified Proteins，，J.Control.Releasell, 139-148)。這種聚合物(優(yōu)選聚乙二醇)的分子量可以在從約300到約70.000道爾頓范圍內(nèi)變化，包括，例如，聚乙二醇分子量為約10.000、約20.000,約30.000或約
40.000道爾頓。此外，例如在美國專利6，500, 930或6，620, 413中的描述，碳水化合物低聚物和聚合物如淀粉或羥乙基淀粉(HES)可以綴合 至本發(fā)明的突變蛋白，以延長血清半衰期。在另一個實施方案中，為了提供用于將上述化合物之一綴合至本發(fā)明的突變蛋白的適合的氨基酸側(cè)鏈，可以通過誘變引入人工氨基酸。通常，可以將此類人工氨基酸設(shè)計成更有反應(yīng)性，因此促進與期望部分的綴合?？梢越?jīng)由人工tRNA引入的這樣的人工氨基酸的一個實例是對乙?；?苯丙氨酸。對于本文公開的突變蛋白的若干應(yīng)用，使用它們的融合蛋白形式可能是有益的。在一些實施方案中，本發(fā)明的突變蛋白在其N端和/或其C端融合至蛋白、蛋白結(jié)構(gòu)域或肽例如信號序列和/或親和標(biāo)簽。對于制藥應(yīng)用，本發(fā)明的突變蛋白可以融合至延長突變蛋白體內(nèi)血清半衰期的融合配偶體(同樣參見PCT申請W02006/56464，其中參考對CTLA-4有結(jié)合親和力的人嗜中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白描述了合適的融合配偶體)。類似上面描述的綴合化合物，融合配偶體可以是免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白、白蛋白結(jié)合肽或白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，僅列幾個例子。同樣，白蛋白結(jié)合蛋白可以是細菌白蛋白結(jié)合蛋白或?qū)Π椎鞍子薪Y(jié)合活性的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。因此，用于延長本發(fā)明脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白半衰期的合適的融合配偶體包括白蛋白(上文的 Osborn, B.L.等人(2002) J.Pharmacol.Exp.Ther.303, 540-548),
或白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，例如，細菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如鏈球菌蛋白G (KonigrT.和 Skerra, A.(1998)J.1mmunol.Methods218, 73-83)。描述于上文的 Dennis 等人(2002)或美國專利申請2003/0069395的白蛋白結(jié)合肽也可以用作融合配偶體，其具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 共有序列，其中 Xaa1 是 Asp、Asn、Ser、Thr 或 Trp ；Xaa2 是 Asn、Gln、His、Ile、Leu 或 Lys ；Xaa3 是 Ala、Asp、Phe、Trp 或 Tyr ；Xaa4 是 Asp>Gly>Leu>Phe> Ser或Thr。還可以使用白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段作為本發(fā)明脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的融合配偶體。術(shù)語“白蛋白”包括所有的哺乳動物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。白蛋白或其片段的重組產(chǎn)生是本領(lǐng)域熟知的，例如描述于美國專利5，728，553、歐洲專利申請EP0330451或EP0361991中。融合配偶體可以給本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白帶來新的特性，如酶活性或其它分子的結(jié)合親和力。合適的融合蛋白的實例有堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)A、抗體片段、寡聚結(jié)構(gòu)域、結(jié)合特異性相同或不同的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白(這造成“duocalin”的形成,參見Schlehuber, S.和 Skerra,A.(2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dualspecificity derived from the lipocalin fold (Biol.Chem.382, 1335-1342)或毒素。特別地，可以將本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白與單獨的酶活性位點融合，以使得產(chǎn)生的融合蛋白的兩個“部分” 一起作用于給定治療靶標(biāo)。脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接到致病靶標(biāo)，從而允許酶結(jié)構(gòu)域阻止所述靶標(biāo)的生物功能。親和標(biāo)簽如Strep-tag1(或Strep-tagII (Schmidt, T.G.Μ.等人(1996) J.Mol.Biol.255，753-766),myc-標(biāo)簽、FLAG-標(biāo)簽、His6_標(biāo)簽或HA-標(biāo)簽或蛋白質(zhì)如也允許易于檢測和/或純化重組蛋白的 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，是優(yōu)選的融合配偶體的其它實例。最后，具有顯色或熒光性質(zhì)的蛋白質(zhì)如綠色熒光蛋白(GFP)或黃色熒光蛋白質(zhì)(YFP)也是本發(fā)明脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的合適的融合配偶體。本文使用的術(shù)語“融合蛋白”還包括包含信號序列的根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。多肽N端的信號序列將這種多肽導(dǎo)向到特定的細胞隔室，例如大腸桿菌的周質(zhì)或真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。大量的信號序列是本領(lǐng)域已知的。用于將多肽分泌到大腸桿菌的周質(zhì)的優(yōu)選信號序列為OmpA-信號序列。本發(fā)明還涉及核酸分子(DNA和RNA)，其包括編碼本文所述突變蛋白的核苷酸序列。因為遺傳密碼的簡并性允許指定相同氨基酸的其它密碼子替換某些密碼子，因此本發(fā)明并不局限于編碼本發(fā)明突變蛋白的特定核酸分子，而是涵蓋包括編碼功能性突變蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。本申請中公開的核酸分子可以“可操作地連接”調(diào)節(jié)序列以允許該核酸分子的表達。核酸分子，如DNA，如果它包括包含關(guān)于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)的信息的序列元件，并且這樣的序列“可操作地連接”編碼多肽的核苷酸序列的話，其被稱為“能夠表達核酸分子”或能夠“允許核苷酸序列的表達”。可操作的連接是這樣的連接:在所述連接中，調(diào)節(jié)序列元件和要表達的序列以使基因能夠表達的方式相連接?；虮磉_需要的調(diào)控區(qū)域的確切性質(zhì)可能在種類間變化，但一般來說這些區(qū)域包括啟動子，在原核生物中，所述啟動子既包含啟動子本身(即指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄啟動的DNA元件)，又包括當(dāng)轉(zhuǎn)錄成RNA時發(fā)出翻譯啟動信號的DNA元件。這種啟動子區(qū)域通常包括參與轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動的5’非編碼序列，如-35/-10盒以及原核生物中的Shine-Dalgarno元件或TATA盒、CAAT序列和真核生物中的5’ -加帽元件。這些區(qū)域還可以包括增強子或阻遏元件以及翻譯信號和用于將天然多肽靶向宿主細胞特定隔室的前導(dǎo)序列。
此外，3’非編碼序列可以包含參與轉(zhuǎn)錄終止、聚腺苷酸化等的調(diào)節(jié)元件。然而，如果這些終止序列在特定的宿主細胞內(nèi)沒有令人滿意的功能，那么它們可能被該細胞中有功能的信號替換。因此，本發(fā)明的核酸分子可以包括調(diào)節(jié)序列，優(yōu)選地啟動子序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包括啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。合適的原核啟動子，例如，tet啟動子，lacUV5啟動子或T7啟動子?？捎糜谠谡婧思毎斜磉_的啟動子的實例有SV40啟動子或CMV啟動子。
本發(fā)明的核酸分子也可以是載體的一部分或任何其它類型的克隆載體，如質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體、桿狀病毒、粘?；蛉斯と旧w。編碼本發(fā)明脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的DNA分子，尤其包含這種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的編碼序列的克隆載體可以轉(zhuǎn)化進入能夠表達該基因的宿主細胞。可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行轉(zhuǎn)化(上文的Sambrook,等人(1989))。因此，本發(fā)明還涉及包含本文披露的核酸分子的宿主細胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白、突變蛋白的片段或突變蛋白和另一多肽的融合蛋白通過基因工程方法的方式從編碼所述突變蛋白的核酸開始而產(chǎn)生。所述方法可以在體內(nèi)進行，例如，所述突變蛋白可以在細菌或真核宿主生物體內(nèi)產(chǎn)生并且從此宿主生物體或其培養(yǎng)物中富集、純化或分離。在體外產(chǎn)生蛋白也是可能的，例如通過使用體外翻譯系統(tǒng)。術(shù)語“富集”表示，所述突變蛋白或其功能片段占目標(biāo)樣品或溶液中存在的總蛋白的部分顯著高于在其所提取自的樣品或溶液中。例如富集可包括從細胞提取物中分離某一部分。這可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得，如離心。其它富集方式的例子為過濾或透析，例如其可以是針對去除低于某分子量的不期望分子，或使用有機溶劑或硫酸銨沉淀。例如，純化可包括色譜技術(shù)，例如凝膠過濾、離子交換色譜、親和純化、疏水相互作用色譜法或疏水電荷感應(yīng)色譜法。純化的另一個例子為電泳技術(shù)，如制備毛細管電泳。分離可包括類似方法的組合。文中使用的“基本上純的”或“基本上純化的”表示為存在的主要物質(zhì)的化合物或物質(zhì)(即，基于摩爾，它比組合物中任何其它個體物質(zhì)更豐富)。在一些實施方案中，基本上純的組合物是這樣的組合物:在該組合物中，所述物質(zhì)包括存在的全部分子的或者全部大分子(如適用)的物質(zhì)的至少約50% (基于摩爾)。在某些實施方案中，基本上純的組合物將具有組合物中存在的全部分子的或者全部大分子(如適用)的物質(zhì)的超過約80%、約85%、約90%、約95%或約99%。當(dāng)在體內(nèi)產(chǎn)生所述突變蛋白時，通過重組DNA技術(shù)將編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸引入適合的細菌或真菌宿主生物體(如上文已經(jīng)概括的)。為了這個目的，首先采用建立的標(biāo)準(zhǔn)方法(上文的Sambrook，J.等人(1989))用包含編碼本發(fā)明突變蛋白的核酸分子的克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。所述宿主細胞然后在允許表達異源DNA以及從而合成相應(yīng)多肽的條件下培養(yǎng)。隨后，所述多肽從細胞或從培養(yǎng)介質(zhì)中回收。一方面，本發(fā)明涉及用于生成結(jié)合鐵調(diào)素的突變蛋白的方法，包括:使編碼脂質(zhì)運載蛋白的核酸分子進行誘變，從而生成一個或多個突變蛋白核酸分子。所述方法可以進一步包括:在適合的表達系統(tǒng)中表達獲得的一個或多個突變蛋白核酸分子，
使多個突變蛋白至少與鐵調(diào)素的片段或成熟形式接觸，和通過選擇和/或分離的方式，富集一個或多個對給定靶標(biāo)具有可檢測結(jié)合親和力的突變蛋白。本文使用的術(shù)語“誘變”系指，選擇實驗條件，以使得在脂質(zhì)運載蛋白包括Lcn2(hNGAL ;Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫條目P80188)給定序列位置處天然存在的氨基酸可以被至少一個不存在于各天然多肽序列中的此特定位置處的氨基酸替換。術(shù)語“誘變”還包括通過缺失或插入一個或多個氨基酸進行的序列區(qū)段長度的(額外的)修飾。因此，以下在本發(fā)明的范圍內(nèi):例如，一個在選定序列位置處的氨基酸被三個隨機突變區(qū)段替代，從而相比于野生型蛋白各區(qū)段的長度，導(dǎo)致兩個氨基酸殘基的插入。這樣的缺失或插入可以彼此獨立地引入到在本發(fā)明中可以進行誘變的任何肽區(qū)段中。在本發(fā)明的一個示例性實施方式中，幾個突變的插入可以引入到選定的脂質(zhì)運載蛋白支架的AB環(huán)中(參見以全文引用并入本文的國際專利申請W02005/019256)。術(shù)語“隨機誘變”指，無預(yù)定的單個氨基酸(突變)存在于某個序列位置處，而是至少兩個氨基酸可以在誘變期間以某概率摻入在預(yù)限定的序列位置處。在一個非限制性方法中，人脂質(zhì)運載蛋白2的編碼序列可以用作在本發(fā)明中選擇的肽區(qū)段的誘變的起始點。對于列舉的氨基酸位置的誘變，本領(lǐng)域技術(shù)人員具有多種建立的標(biāo)準(zhǔn)方法以進行定點誘變(上文的Sambrook，J.等人(1989))。一個常用的技術(shù)是通過使用合成寡核苷酸混合物進行PCR (聚合酶鏈反應(yīng))來引入突變，所述合成寡核苷酸在所需的序列位置處帶有簡并堿基組成。其它相似技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。上面定義的核酸分子可以通過與編碼脂質(zhì)運載蛋白多肽和/或載體的核酸的缺失5’-和3’-序列連接來進行連接，并且可以被克隆到已知宿主生物體中。眾多的已建立實驗程序可供連接和克隆(上文的Sambrook, J.等人(1989))。例如，同樣存在于克隆載體序列中用于限制性內(nèi)切酶的識別序列可以被工程化到合成寡核苷酸的序列中。因此，在擴增各自的PCR產(chǎn)物和酶切割 之后，可以使用相應(yīng)的識別序列容易地克隆所得片段。在編碼選定用于誘變的蛋白的基因內(nèi)的較長序列區(qū)段還可以通過已知方法進行隨機誘變，例如通過利用在增加錯誤率的條件下的聚合酶鏈反應(yīng)、通過化學(xué)誘變或通過使用細菌突變菌株。這些方法還可以用于進一步優(yōu)化靶標(biāo)親和力或脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的特異性?？赡馨l(fā)生于實驗性誘變區(qū)段之外的突變通常是可以接受的或者甚至可以證明是有利的，例如如果它們有助于改進折疊效率或脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的折疊穩(wěn)定性。在進一步的實施方案中，所述方法包括使核酸分子在編碼對應(yīng)于脂質(zhì)運載蛋白(或例如，人脂質(zhì)運載蛋白2)線性多肽序列的序列位置33、36、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、54、55、59、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、86、87、98、96、99、100、103、106、107、110、111、125、127、132、134、136 和 / 或 138 的序列位置的至少任意 1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個處的核苷酸三聯(lián)體處進行誘變。這種核酸可進行誘突，并且通過使用重組DNA技術(shù)引入到合適的細菌或真菌宿主生物體中。獲得脂質(zhì)運載蛋白的核酸文庫可以使用本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生具有抗體樣性質(zhì)的突變蛋白(即與給定靶標(biāo)有親和力的突變蛋白)的任何適合的技術(shù)來進行。這種組合方法的實例在國際專利申請例如 W099/16873、W000/75308、W003/029471、W003/029462、W003/029463、TO2005/019254、TO2005/019255、W02005/019256 或 TO2006/56464 中有詳細描述。這些專利申請中的每一個的內(nèi)容均以全文引用的方式并入本文。在適當(dāng)宿主中表達進行誘變的氨基酸序列后，可以從獲得的文庫中選擇攜帶多個各脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的遺傳信息的克隆，所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白結(jié)合給定靶標(biāo)?？梢允褂檬熘募夹g(shù)來篩選這些克隆，比如噬菌體展示(上文的Kay, B.K.等人(1996);上文的Lowman, H.B.(1997)或上文的Rodi，D.J.和Makowski，L.(1999)的綜述)、菌落篩選(Pini，A.等人(2002)Comb.Chem.High Throughput Screen.5, 503-510 中的綜述)、核糖體展不(Amstutz, P.等人(2001) Curr.0pin.Biotechnol.12，400-405 中的綜述)或如在 Wilson, D.S.等人(2001) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98, 3750-3755 中報道的 mRNA 展示，或在 W099/16873、W000/75308、W003/02947U W003/029462, W003/029463, W02005/019254, W02005/019255,W02005/019256、或W02006/56464中具體描述的方法。根據(jù)此公開內(nèi)容，上述方法的另一個實施方案包括:(i)例如提供鐵調(diào)素的至少一個片段作為給定靶標(biāo)/配體，使多個突變蛋白與所述靶標(biāo)/配體接觸以允許在所述配體和對所述靶標(biāo)/配體有結(jié)合親和力的突變蛋白之間形成復(fù)合物，和去除沒有結(jié)合親和力或沒有顯著結(jié)合親和力的突變蛋白。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，結(jié)合親和力的篩選在競爭條件下進行。本文使用的競爭條件是指突變蛋白的篩選，其包含至少一個步驟，在該步驟中使所述突變蛋白和所述鐵調(diào)素的片段或成熟鐵調(diào)素如鐵調(diào)素-25 (靶標(biāo))在其它配體的存在下接觸，所述其它配體與該突變蛋白競爭對靶標(biāo)(鐵調(diào)素)的結(jié)合。這種其它的靶標(biāo)可以是鐵調(diào)素的另一形式，例如鐵調(diào)素_20(在被選定的突變蛋白選擇性地結(jié)合鐵調(diào)素-25或甚至鐵調(diào)素-25的五個N端殘基(正如前面指出的，目前認(rèn)定鐵調(diào)節(jié)的生物活性幾乎完全歸因于25個氨基酸形式的鐵調(diào)素-25，這表明五個N端氨基酸對這種活性是至關(guān)重要的，上文的Kenma等人)的情況下)，過量的靶標(biāo)自身或鐵調(diào)素的任意其它非生理配體將至少一個重疊表位結(jié)合至本發(fā)明突變蛋白識別的表位并且因此干擾突變蛋白的靶標(biāo)(鐵調(diào)素)結(jié)合。或者，其它的配體通過別構(gòu)效應(yīng)將不同于突變蛋白結(jié)合位點的表位絡(luò)合至所述靶標(biāo)，從而競爭該突變蛋白的結(jié)合。因此，任何片段、前體或鐵調(diào)素的成熟形式可以用于本發(fā)明突變蛋白的產(chǎn)生中。本發(fā)明方法的進一步實施方案涉及將編碼多個本發(fā)明突變蛋白并且由在3’端處誘變得到的核酸與編碼M13家族的纖維狀噬菌體的衣殼蛋白pill或這種衣殼蛋白的片段的基因可操作地融合，以便篩選至少一種用來結(jié)合給定配體的突變蛋白。融合蛋白可以包括其它成分，比如親和標(biāo)簽，它允許融合蛋白或其部分的固定、檢測和/或純化。此外，終止密碼子可以位于編碼脂質(zhì)運載蛋白或其突變蛋白的序列區(qū)域和噬菌體衣殼基因或其片段之間，其中所述終止密碼子，優(yōu)選琥珀終止密碼子，在合適的抑制菌株中在翻譯過程中至少部分地翻譯成氨基酸。例如，這里描述的噬菌粒載體PTLPC27，現(xiàn)在也稱為pTlc27，可用于制備編碼本發(fā)明突變蛋白的噬菌粒文庫。編碼本發(fā)明突變蛋白的本發(fā)明的核酸分子可以用兩個BstXI限制性位點插入到載體中。在連接后，用所得的核酸混合物轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株，如大腸桿菌XLl-Blue,以產(chǎn)生大量的獨立克隆。如果需要，可以產(chǎn)生各自的載體以用于制備超級噬菌粒(hyperphagemid)文庫。 一旦與給定靶標(biāo)具有親和力的突變蛋白被篩選出來，另外還可以使這種突變蛋白進行另一誘突，以便隨后篩選具有甚至更高親和力的變體或具有改善的特性的變體，如更高的熱穩(wěn)定性、改善的血清穩(wěn)定性、熱力學(xué)穩(wěn)定性、改善的溶解度、改善的單體行為、對熱變性、化學(xué)變性、蛋白質(zhì)水解或洗滌劑的改善的抗性等等。此進一步誘變，在針對更高親和力可視為體外“親和力成熟”的條件下，可以通過基于合理設(shè)計或隨機突變的位點特異性突變來獲得。另一個可行的用于獲得更高親和力或改善的特性的方法是使用易錯PCR，它導(dǎo)致在脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白序列位置的所選范圍內(nèi)的點突變。易錯PCR可以根據(jù)任何已知操作程序進行，如一個由Zaccolo等人(1996) J.Mol.Biol.255，589-603描述的操作程序。適合于這種目的的其它隨機誘變方法包括由Murakami等人(2002)Nat.Biotechnol.20, 76-81描述的隨機插入/缺失(RID)誘變，或由Bittker等人(2002)Nat.Biotechnol.20，1024-1029描述的非同源隨機重組(NRR)。如果需要，也可以根據(jù)W000/75308 或 Schlehuber 等人(2000) J.Mol.Biol.297, 1105-1120 中描述的過程進行親和力成熟，在該文獻中獲得了對地高辛具有高親和力的膽汁三烯結(jié)合蛋白的突變蛋白。提高親和力的另一個方法為進行位置飽和誘變。在這種方法中可以產(chǎn)生“小”核酸庫，其中僅僅在四個環(huán)區(qū)段中任一個內(nèi)的單一位置處引入氨基酸交換/突變。這些庫隨后直接進行篩選步驟(親和力篩選)，不進行其它輪的淘選。這種方法允許有助于提高期望靶標(biāo)結(jié)合的殘基的識別以及允許對結(jié)合重要的“熱點”的識別。在一個實施方案中，用于修飾突變蛋白的上述方法進一步包括在對應(yīng)于人脂質(zhì)運載蛋白2野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置的至少一個處引入Cys殘基以及經(jīng)由在對應(yīng)于hNGAL野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的任何序列位置的至少一個處引入的Cys殘基的硫醇基團耦合能夠改變所述突變蛋白血清半衰期的部分。所述能夠改變所述突變蛋白血清半衰期的部分可以選自聚亞烷基二醇分子和羥乙基淀粉。在本發(fā)明的蛋白為本發(fā)明的人脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白的情況下，可以去除在Cys76和Cysl75之間天然存在的二硫鍵。因此，這種突變蛋白(或任何其它的不包括分子內(nèi)_■硫鍵的人脂質(zhì)運載蛋白2突變蛋白)可以在具有氧化還原環(huán)境的細胞隔室中廣生，所述細胞隔室例如革蘭氏陰性細菌的細胞質(zhì)。在本發(fā)明 的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白包括分子內(nèi)二硫鍵的情況下，可優(yōu)選地用適當(dāng)?shù)男盘栃蛄袑⒃醵嚯膶?dǎo)向到具有氧化還原環(huán)境的細胞隔室。這種氧化環(huán)境可以由革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌的周質(zhì)提供，在革蘭氏陽性細菌的細胞外環(huán)境中或在真核細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中，并且通常有利于結(jié)構(gòu)性二硫鍵的形成。然而，也可以在宿主細胞優(yōu)選大腸桿菌的胞溶膠中產(chǎn)生本發(fā)明的突變蛋白。在這種情況下，所述多肽可以以可溶性和折疊狀態(tài)直接獲得或以包涵體的形式回收，然后在體外復(fù)性。其它選擇是使用具有氧化的細胞內(nèi)環(huán)境的特定宿主菌株，其可以因此允許在胞溶膠中形成二硫鍵(Venturi 等人(2002) J.Mol.Biol.315, 1-8)。然而，本發(fā)明的突變蛋白不一定僅通過使用基因工程生成或產(chǎn)生。相反，脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白也可以通過化學(xué)合成如梅利菲爾德固相多肽合成或通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯獲得。例如可行的是，使用分子建模鑒定有希望的突變，然后在體外合成想要的(設(shè)計的)多肽并且檢測對給定靶標(biāo)的結(jié)合活性。用于蛋白固相和/或液相合成的方法是本領(lǐng)域熟知的(例如，Lloyd-Williams等人(1997)Chemical Approaches to the Synthesis of Peptidesand Proteins.CRC Press,Boca Raton, Fields, GB 和 Colowick(1997)Solid-PhasePeptide Synthesis.Academic Press, San Diego 或 Bruckdorfer 等人(2004) Curr.Pharm.Biotechnol.5，29-43 中的綜述)。在另一個實施方式中，本發(fā)明的突變蛋白可以通過采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的已建立方法的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及到一種藥物組合物，其包括至少一種在權(quán)利要求書中提及的本發(fā)明的突變蛋白或其融合蛋白或綴合物以及任選的藥學(xué)上可接受的賦形劑?？梢越?jīng)由對蛋白質(zhì)性藥物治療上有效的腸胃外或非腸胃外(例如，腸)途徑施用根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。因此，本發(fā)明的突變蛋白可以使用藥學(xué)上可接受的成分以及已建立的制備方法配制成組合物(Gennaro 和 Gennaro (2000) Remington:The Science and Practice ofPharmacy, 20th Ed., Lippincott WIIIiams&WIIkins, Philadelphia, PA)。為了制備藥學(xué)組合物，可以使用藥學(xué)惰性的無機或有機賦形劑。本發(fā)明的蛋白還可以用于將化合物靶向至預(yù)選位點。在一個這樣的實施方案中，本發(fā)明的蛋白用于將藥學(xué)活性化合物靶向至生物體或組織內(nèi)的預(yù)選位點，包括:a)將所述蛋白與所述化合物綴合，和b)將所述蛋白/化合物復(fù)合物遞送至所述預(yù)選位點。對于這樣的目的，使突變蛋白和目標(biāo)化合物接觸，以允許復(fù)合物形成。然后包括所述突變蛋白和目標(biāo)化合物的復(fù)合物被遞送到預(yù)選位點。例如，這可以通過將所述突變蛋白耦合至靶標(biāo)部分實現(xiàn)，所述靶標(biāo)部分如抗體、抗體片段或脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白或?qū)x定靶標(biāo)有結(jié)合親和力的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白片段。這種用途尤其適合、但不限于，將藥物(選擇性地)遞送到生物體內(nèi)的預(yù)選位點，例如認(rèn)為要用所述藥物治療的被感染的身體部位、組織或器官。除了在突變蛋白和目標(biāo)化合物之間形成復(fù)合物之外，所述突變蛋白還可以和給定的化合物反應(yīng)，從而產(chǎn)生突變蛋白和化合物的綴合物。類似于上面的復(fù)合物，這種綴合物可以適合于將化合物遞送到預(yù)選靶標(biāo)位點。這種突變蛋白和化合物的綴合物還可以包括將突變蛋白和化合物彼此共價連接的連接物。任選地，這種連接物在血流中是穩(wěn)定的，但在細胞環(huán)境中是可切割的。本文公開的突變蛋白及其衍生物可以因此類似于抗體或其片段用在許多領(lǐng)域。除了它們結(jié)合至支持物(允許給定突變蛋白或綴合物的靶標(biāo)或者這種靶標(biāo)的融合蛋白固定或分離)的用途外，突變蛋白可以和酶、抗體、放射性物質(zhì)或具有生化活性或確定的結(jié)合特性的任何其它基團一起用于標(biāo)記。通過這樣做，它們各自的靶標(biāo)或其綴合物或融合蛋白可以被檢測出或與它們接觸。例如，本發(fā)明的突變蛋白可以通過已建立的分析方法(如ELISA或蛋白質(zhì)印跡)或者通過顯微鏡或免疫感知(immunosensorics)用來檢測化學(xué)結(jié)構(gòu)。在這里，檢測信號可以通過使用合適的突變蛋白綴合物或融合蛋白直接生成或通過免疫化學(xué)檢測經(jīng)由抗體的結(jié)合突變蛋白間接地生成。
本發(fā)明突變蛋白的眾多可能的應(yīng)用也存在于醫(yī)藥中。除了它們在診斷和藥物遞送中的用途，可以生成本發(fā)明的結(jié)合例如組織或腫瘤特異性細胞表面分子的突變多肽。這種突變蛋白可以，例如，以綴合形式使用或用作用于“腫瘤成像”的融合蛋白或直接用于癌癥治療。
在進一步的方面，本發(fā)明還包含根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白用于制備藥物組合物的用途。由此獲得的藥物組合物可以適于降低鐵調(diào)素的水平。所述藥物組合物可以用作單一療法或聯(lián)合療法。因此，本發(fā)明還涉及上文定義的突變蛋白用于治療與鐵調(diào)素水平改變(例如增加或減少)相關(guān)的疾病或障礙。鐵調(diào)素相關(guān)疾病貧血是一種與血清鐵損耗相關(guān)的疾病，其導(dǎo)致血液參數(shù)如紅細胞(RBC)計數(shù)、血細胞比容(Ht)、血紅蛋白(Hb)、血清鐵水平和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)飽和降低。這導(dǎo)致血液中氧含量減少，并且與描述為虛弱、精力不集中、氣短、呼吸困難的生活質(zhì)量下降相關(guān)。嚴(yán)重的貧血會導(dǎo)致心跳加快、心臟擴大和心力衰竭。貧血往往伴有慢性腎臟疾病/建立性慢性腎臟疾病(CKD )、癌癥貧血(AC)、化療所致貧血(ClA)和慢性疾病貧血(A⑶)。貧血的有效管理對生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響，可影響患者的生存。生活質(zhì)量的下降可以用虛弱、疲勞、精力不集中、氣短乃至呼吸困難來描述。嚴(yán)重貧血伴隨著心率加快，并可導(dǎo)致心臟擴大和心臟衰竭。標(biāo)準(zhǔn)的治療護理是輸血以及施用ESA和鐵。然而，因為標(biāo)準(zhǔn)治療方法與以下缺點或潛在缺陷相關(guān)，需要新的治療方法。輸血具有溶血、感染和由于血型不相容導(dǎo)致的過敏反應(yīng)的風(fēng)險。鐵療法在長期治療中會導(dǎo)致鐵過載，不建議用于治療炎癥性貧血，原因為鐵有助于炎癥響應(yīng)(如炎性關(guān)節(jié)疾病)。對于ESA而言，約40-50%的貧血患者為ESA非應(yīng)答者，沒有或僅在高劑量ESA治療后具有延遲的Hb應(yīng)答，這與安全問題如更難生存和癌癥患者中縮短進程的自由生存時間相關(guān)。缺鐵性貧血是一種鐵動態(tài)平衡障礙，其與炎癥疾病相關(guān)貧血相比，容易通過鐵施用治愈。鐵調(diào)素是允許區(qū)分這兩種障礙的參數(shù)，因為鐵調(diào)素水平僅與炎癥關(guān)聯(lián)地上升。伴隨慢性炎性疾病如慢性感染、風(fēng)濕病和系統(tǒng)性自身免疫障礙和炎性腸病的貧血稱為炎癥性貧血(Al)或慢性疾病貧血(ACD)。炎性細胞因子IL-6誘導(dǎo)鐵調(diào)素表達，作為炎性反應(yīng)的一部分，從而導(dǎo)致缺鐵引起的貧血及對ESA的應(yīng)答遲鈍。具有建立性慢性腎臟疾病(慢性腎功能衰竭(CRF))的患者發(fā)展為尿毒癥貧血，一種最明顯的疾病征兆。這種癥狀由促紅細胞生成素(EPO)的腎臟產(chǎn)生受阻引起。EPO通過促進控制骨髓中紅系祖細胞生存、增殖和分化來控制紅細胞(RBC)的產(chǎn)生。慢性腎功能衰竭(CRF)中貧血的有效管理對生活質(zhì)量有重大影響，并且可影響生存。補充重組人促紅細胞生成素(rhEPO)是目前對于那些貧血患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。臨床試驗中已經(jīng)觀察到CRF患者對各種ESA (紅細胞生成刺激劑)有70-90%的應(yīng)答率。僅在具有另外的炎性疾病的患者中，鐵調(diào)素在與CKD相關(guān)的貧血中發(fā)揮突出作用。
貧血常見于癌癥患者中，并且具有多因素病因?qū)W。其可能與腫瘤本身及其程度以及類型、持續(xù)時間和骨髓抑制化學(xué)療法的強度有關(guān)。此外，大多數(shù)癌癥患者已顯示具有對于他們的貧血程度不適當(dāng)?shù)牡退降难h(huán)ΕΡ0，反映了此動態(tài)平衡機制的改變。在某些癌癥類型中，嚴(yán)重到足以導(dǎo)致輸血的貧血發(fā)病率可高達60%。患有癌癥的貧血患者可能經(jīng)受如乏力、頭暈、氣短的癥狀和心血管癥狀如心悸和心臟衰竭。這種臨床后遺癥可能會降低這些患者的生活質(zhì)量。此外，最近討論了在貧血糾正和接受化療的病人存活率上升之間潛在的聯(lián)系。目前，癌癥患者的貧血治療選擇為RBC輸注或ESA’s。RBC輸注可以與非溶血性和溶血性輸血反應(yīng)、大量輸血患者鐵過載、或傳染病的傳播相關(guān)。在輸血治療中安全及篩查需求增加了輸血治療的物流和成本，因此將輸血限于嚴(yán)重和/或癥狀性貧血的病例。在以當(dāng)前的政策仍未嚴(yán)重到足以接受輸血的癥狀性貧血治療中，ESA’ s提供了輸血的另一種選擇。然而，已經(jīng)建立對ESA’ s明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，40%至50%的患者完全沒有顯示出Hb應(yīng)答或延遲應(yīng)答。在過去幾年間，已經(jīng)出現(xiàn)關(guān)于ESA影響癌癥患者的生存以及他們的血栓栓塞風(fēng)險可能性增加的重大關(guān)注(2007年3月，F(xiàn)DA創(chuàng)立了關(guān)于ESA與癌癥誘發(fā)和血栓栓塞事件的可能關(guān)聯(lián)性的黑盒預(yù)警)。有增加的文獻證據(jù)表明，不僅通過ESA治療4周內(nèi)沒有Hb應(yīng)答增加，還通過鐵調(diào)素水平提高(認(rèn)為是炎性反應(yīng)的一部分)，預(yù)測到癌癥患者的ESA抗性。如上所述，鐵調(diào)素是鐵動態(tài)平衡的核心負(fù)調(diào)節(jié)器。鐵調(diào)素的生成隨鐵過載和炎癥而增加，在低鐵條件和低氧下減少。鐵調(diào)素通過與唯一已知的哺乳動物細胞鐵輸出物(膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白)結(jié)合發(fā)揮作用，并且誘導(dǎo)其內(nèi)化和降解。因為膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白在十二指腸的腸細胞、脾臟和肝臟中表達，鐵調(diào)素的增加，以及隨后膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的減少，導(dǎo)致十二指腸鐵吸收的抑制、循環(huán)鐵從巨噬細胞的釋放和肝臟中鐵儲存的動員。鐵調(diào)素被認(rèn)為在炎性疾病相關(guān)性貧血的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。急性或慢性炎性病癥導(dǎo)致鐵調(diào)素表達上調(diào)，造成缺鐵，其可以弓I起炎性疾病相關(guān)性貧血(A⑶)、癌癥(AC，CIA)和慢性腎臟疾病(CKD) (CKD貧血)。根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可以用作鐵調(diào)素的拮抗劑(上文)。在這方面，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，通常為分離的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，可以用于治療，如人治療。各自的突變蛋白能夠通常以高親和力與鐵調(diào)素形成復(fù)合物，例如，人鐵調(diào)素。因此脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白通常阻礙與鐵調(diào)素受體膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白相互作用。結(jié)果膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解受到抑制。因此，所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白通過允許儲存鐵的動員和改善的腸鐵吸收而支持紅細胞生成。根據(jù)本發(fā)明的需要應(yīng)用鐵調(diào)素相應(yīng)拮抗劑的受試者的示例性例子為對ESA治療反應(yīng)低的受試者(約40-50%的患者),其認(rèn)為是由于鐵調(diào)素上調(diào)導(dǎo)致用于血紅蛋白合成的可用的鐵減少引起的。術(shù)語“受試者”是指脊椎動物，包括哺乳動物，尤其是人(在這種情況下，也可以使用術(shù)語“患者”)。在一些實施方案中，受試者可發(fā)生障礙，其將受益于鐵調(diào)素如鐵調(diào)素-25水平的降低，鐵調(diào)素生物活性(例如，鐵調(diào)素-25的生物活性)的降低，和/或血清中鐵水平、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白和/或血細胞比容的增加。 根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可以用于增加體液如血清中鐵水平。其還可以用于增加受試者例如人的網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白和/或血細胞比容。包含本發(fā)明脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的藥物組合物可以用于這方面。本發(fā)明的另一方面涉及一種治療受試者的方法，所述受試者患有與鐵調(diào)素水平改變?nèi)玷F調(diào)素水平增加或減少相關(guān)的疾病或障礙。相應(yīng)疾病或障礙可包括引起鐵缺乏或過載的遺傳或非遺傳疾病/障礙。疾病狀態(tài)或障礙可包括感染性疾病，包括如細菌、真菌、酵母或病毒。如上面已經(jīng)解釋的，在一些實施方案中，所述疾病或障礙是貧血，包括、但不限于，感染、炎癥、慢性疾病、和/或癌癥造成的貧血。在一些實施方案中，其可包括炎性疾病如關(guān)節(jié)炎和某些癌癥類型、肝臟疾病或血液疾病。在一些實施方案中，與鐵調(diào)素水平增加相關(guān)的疾病為貧血或慢性腎臟疾病或與慢性腎臟疾病相關(guān)的貧血。如上面已經(jīng)解釋的，這種方法涉及給有此需要的受試者施用本發(fā)明的相應(yīng)突變蛋白質(zhì)或包含本發(fā)明突變蛋白的藥物組合物。例如，本發(fā)明的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白可以用于治療具有提高水平的鐵調(diào)素、鐵調(diào)素相關(guān)障礙、鐵動態(tài)平衡障礙、貧血或與提高水平鐵調(diào)素相關(guān)的炎性病癥的受試者。例如，所述受試者可為患有以下疾病的哺乳動物，如人:非洲鐵過載，α地中海貧血，阿爾茲海默氏病，貧血，癌癥性貧血，慢性疾病貧血，炎癥性貧血，動脈硬化或動脈粥樣硬化(包括冠狀動脈疾病，腦血管疾病或外圍閉塞性動脈疾病)，共濟失調(diào)，鐵關(guān)聯(lián)共濟失調(diào)，轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥，癌癥，血漿銅藍蛋白缺乏，化學(xué)治療誘導(dǎo)貧血，慢性腎/腎臟疾病(尤其是與慢性腎臟疾病相關(guān)的貧血)，包括晚期腎疾病或慢性腎/腎功能衰竭，肝硬化，血色沉著病，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)，涉及鐵調(diào)素過量(提高的鐵調(diào)素)的病癥，先天性異常紅血球生成貧血，充血性心力衰竭，克羅恩氏病，糖尿病，鐵生物分布障礙，鐵動態(tài)平衡障礙，鐵代謝障礙，膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白疾病，膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白突變血色素沉著癥，葉酸缺乏，弗里德利希共濟失調(diào)，纜索骨髓組織病，纖弱綜合征，細菌感染如H.pyelori感染，Hallervordan Spatz疾病,血色沉著病，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2內(nèi)突變造成的血色沉著病，血紅蛋白病，肝炎，肝炎(Brock)，丙型肝炎，肝細胞癌，遺傳性血色沉著病，病毒性感染如HIV，亨廷頓氏舞蹈病，高鐵蛋白血癥，底色小紅細胞性貧血，血鐵過少，胰島素耐受性，缺鐵性貧血，缺鐵性障礙，鐵過載障礙，鐵調(diào)素過量的鐵缺乏病癥，少年血色素沉著癥(HFE2)，多發(fā)性硬化，鐵代謝中涉及的基因突變(所述基因例如表達本文涉及的蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2、HFE、鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白或膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白)，新生兒血色沉著病，鐵相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，骨質(zhì)缺乏，骨質(zhì)疏松胰腺炎，泛酸酯激酶相關(guān)神經(jīng)退行性變，帕金森氏病，糙皮病，異食癖，葉啉癥，遲發(fā)性皮膚卟啉病，假腦炎，肺含鐵血黃素沉著癥，血紅細胞障礙，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,敗血癥,繼發(fā)性貧血,系統(tǒng)性紅斑狼瘡，地中海貧血，中間型地中海貧血,輸血性鐵過載,腫瘤,血管炎,維生素B6缺乏，維生素B12缺乏，威爾遜氏病，或與鐵調(diào)素水平提高相關(guān)的炎性病癥。作為進一步的示例性例子，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白在一些實施方案中可以用于與促紅細胞生成素結(jié)合。患有癌癥(AC)和慢性疾病貧血(Ara)的貧血病患者與高濃度鐵調(diào)素(約30nmol/L)相關(guān)，導(dǎo)致血清鐵缺乏，從而降低紅細胞生成。已報道血清中基線鐵調(diào)素濃度低于13nmol/L的受試者比濃度大于13nmol/L的受試者對促紅細胞生成素(EPO)治療顯示出更好的應(yīng)答。因此，用鐵調(diào)素拮抗劑治療貧血癌癥患者可以提高他們對促紅細胞生成素的應(yīng)答。

另外，貧血癥受試者中的一個普遍的現(xiàn)象是抗重組促紅細胞生成素(rhEPO)，這是可以通過用根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白的組合治療克服的治療問題。鐵調(diào)素很可能在此rhEPO抗性中發(fā)揮重要作用。Sasu等人(Blood(2010) 115，17, 3616 - 3624)已經(jīng)示出了在小鼠體內(nèi)鐵調(diào)素水平增加和促紅細胞生成素刺激劑抗性之間顯著的關(guān)聯(lián)。他們還能夠通過施用鐵調(diào)素特異性抗體恢復(fù)ESA響應(yīng)能力。另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白在診斷中的用途。根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白通常用于與鐵調(diào)素水平改變相關(guān)的疾病或障礙的診斷以及各自的診斷方法。在一些實施方案中，所述用途涉及評價受試者體液中的鐵調(diào)素水平。為了這個目的，從各受試者取得體液。鐵調(diào)素水平可以與已知包括正常水平鐵調(diào)素的對照樣品相對比。因此可以確定是否有非生理學(xué)水平的鐵調(diào)素存在于受試者體內(nèi)。因此，本發(fā)明還涉及上文定義的突變蛋白用于診斷與鐵調(diào)素水平變化(如增加或減少)相關(guān)的疾病或障礙。在一些實施方案中，所述疾病為貧血癥，包括、但不限于，由感染、炎癥、慢性疾病和/或癌癥造成的貧血。所述疾病或障礙可以例如與鐵調(diào)素水平減少相關(guān)，例如遺傳性血色沉著病、鐵加載貧血或丙型肝炎。所述疾病或障礙還可以與鐵調(diào)素水平增加相關(guān)，例如，炎癥性貧血、鐵缺乏性貧血(iron-refractory iron deficiency anemia)或慢性腎臟疾病。例如，丙型肝炎通常涉及肝鐵過載，一般經(jīng)由鐵調(diào)素合成抑制導(dǎo)致。在診斷情況下，根據(jù)本發(fā)明的突變蛋白可以用于評估受試者體液中鐵調(diào)素的水平。因為已經(jīng)觀察到具有低鐵調(diào)素濃度(〈13nmol/L)的貧血性癌癥患者比具有聞鐵調(diào)素濃度(>13nmol/L)的患者對促紅細胞生成素治療顯示出更好的響應(yīng)，鐵調(diào)素血清濃度例如可以用于預(yù)測對依泊艾汀治療的響應(yīng)(約50%的患者抗EPO)。仍然在另一方面，本發(fā)明的特征為包含根據(jù)本發(fā)明突變蛋白的診斷或分析試劑盒。

有此治療需要的受試者可以是哺乳動物，例如人、狗、小鼠、大鼠、豬、猿如獼猴(cynomolgous monkey),僅舉出幾個示例性例子。仍然在另一方面，本發(fā)明的特征為一種用于受試者體內(nèi)成像的方法，包括給所述受試者施用本發(fā)明的突變蛋白或包含本發(fā)明突變蛋白的藥物組合物。所述受試者可以是如上文所定義的。通過以下非限制性實施例和附圖進一步闡明本發(fā)明。除非另有說明，例如，按Sambrook等人(上文)描述使用的重組基因技術(shù)的已建立方法。實施例1:突變體Lcn2噬菌體展示文庫的構(gòu)建Lcn2變體的組合文庫產(chǎn)生于克隆的cDNA基礎(chǔ)上(Breustedt等人(2006)Biochim.Biophys.Actal764，161-173),其攜帶氨基酸替換 Cys87Ser,以移除單一不成對的硫醇側(cè)鏈(Goetz 等人(2000)Biochemistry39, 1935-1941)，以及 Gln28His 以引入第二個BstXI限制性位點。誘變和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)組裝此區(qū)域基本上按照出版的策略進行(Beste 等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 1898-1903 ；Skerra (2001)J.Biotechnol.74，257-275)，這一次使用如圖1描述的采用寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO: 16至SEQ ID N0:25的序列)的一鍋式擴增反應(yīng)。設(shè)計寡脫氧核苷酸，以使得具有SEQ ID NO: 16至SEQ ID N0:19的序列的引物對應(yīng)于編碼鏈并且分別在氨基酸位置36、40、41、49、52或68、70、72、73、77、79、81 或 96、100、103、106 或 125、127、132、134 處攜帶簡并密碼子，而具有SEQ ID N0:20至SEQ ID NO:23的序列的引物對應(yīng)于非編碼鏈并且不攜帶簡并密碼子或反密碼子。具有SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:25的兩個側(cè)翼引物過量使用，并且用于組裝的隨機化基因片段的擴增。如(Schlehuber等人(2000) J.Mol.Biol.297, 1105-1120)描述的，采用Go-Taq熱啟動DNA聚合酶(Promega, Mannheim, Germany)進行所有的PCR步驟。不攜帶簡并密碼子的寡脫氧核苷酸以HPLC等級購自Metabion(Munich, Germany)。包含NNK的寡脫氧核苷酸以脫鹽形式購自同一供應(yīng)物并進一步提供尿素PAGE純化。用BstXI (Promega, Mannheim, Germany)切割產(chǎn)生的DNA文庫，并克隆于噬菌粒載體phNGAL102 (SEQID NO:26)上，該載體基于通用表達載體pASKlll (Vogt和 Skerra(2001) J.Mol.Recognit.14(1)，79-86)，并且編碼由 OmpA 信號肽、修飾的成熟Lcn2、接下來的琥珀密碼子以及絲狀噬菌體M13的基因III衣殼蛋白的C端片段組成的融合蛋白，即類似于前面描述的膽汁三烯結(jié)合蛋白(上文的Beste等人；上文的Skerra)。施用8.4μ g經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物和94 μ g經(jīng)消化的質(zhì)粒DNA的連接混合物電穿孔大腸桿菌XLl-Blue (Bullock 等人(1987) Biotechniques5，376-378)后，得到 lxlO1。個轉(zhuǎn)化子?；蛘?，從Sloning BioTechnology GmbH (Puchheim, Germany)獲得圖 2 中描述的克隆的合成Lcn2隨機文庫。用合適的引物(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)經(jīng)由PCR以20個循環(huán)擴增兩側(cè)有兩個BstXI限制性位點的中央基因盒，然后亞克隆在phNGAL108 (SEQID N0:27)上，該載體基于通用表達載體pASK75 (Skerra(1994)Genel51, 131-135)并且基本上攜帶與phNGAL102 (SEQ ID N0:26)相同的組件，但介導(dǎo)氨芐青霉素抗性而不是氯霉素抗性，同樣,產(chǎn)生復(fù)雜性對應(yīng)于1，7xl010獨立轉(zhuǎn)化子的文庫。對于兩個Lcn2文庫，同樣地進行以下產(chǎn)生文庫的步驟。取IOOml培養(yǎng)液，其包含用基于phNGAL102或phNGAL108的噬菌粒載體轉(zhuǎn)化的細胞，所述噬菌粒載體分別編碼脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白如噬菌體PlII融合蛋白的文庫，將該IOOml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至無菌錐形燒瓶，然后在37° C、160rpm下在沒有抗生素選擇壓力的2YT培養(yǎng)基中孵育一小時。在用VCS-Ml3輔助噬菌體感染前，將培養(yǎng)液在2YT培養(yǎng)基中稀釋至0D550為0.1，其中添加相應(yīng)抗生素，并且進一步在相同條件下培養(yǎng)直至0D550達到0.6。在用VCS-M13輔助噬菌體(AglientTechnologies, La Jolla, USA)以約10的感染復(fù)數(shù)感染后，將培養(yǎng)液在37°C、IOOrpm下再振搖30分鐘。然后，將孵育箱的溫度降至26° C并且振搖速度又提高到160轉(zhuǎn)/分，10分鐘后添加卡那霉素(70μ g/ml)，再經(jīng)由添加25μ g/Ι (在每升培養(yǎng)物中加入125μ I的在二甲基甲酰胺DMF中的200 μ g/ml母液)添加無水四環(huán)素(ACR0S Organics, Geel, Belgium)誘導(dǎo)基因表達。在26°C、160rpm下繼續(xù)孵化12_15h。通過離心(30min，18000g，4° C)沉淀來自整個培養(yǎng)液的細胞。無菌過濾(0.45 μ m)包含噬菌粒的上清液，與1/4體積的20%w/v PEG8000、15%w/vNaCl混合，然后在冰上孵育至少2h。在離心(30min，18000g，4° C)后，將來自I升培養(yǎng)液的沉淀的噬菌粒溶解于 30ml 包含有 50mM 苯甲脈(Sigma)和 Pefablocl μ g/ml (Roth, Karlsruhe, Germany)的冷BBS/E (200mM硼酸鈉，160mM NaCl, ImM EDTA pH8.0)。將所述溶液在冰上孵育lh。在離心(lOmin，43000g, 4° C)未溶解的組分之后，將各上清液轉(zhuǎn)移到新的反應(yīng)管中。
·
加入1/4體積的20%w/v PEG8000、15%w/v NaCl以及在冰上孵育60分鐘使得再次沉淀噬菌粒，然后將噬菌粒等分并在-80°C下冷凍儲存。為了進行第一個篩選循環(huán)，解凍噬菌粒并離心(30min，34000g，4° C)，移除上清液，然后溶解沉淀的噬菌粒并合并在包含50mM苯甲脒的總計400 μ IPBS中。在冰上孵育30min后，離心(5min，18500g, 4° C)該溶液，以移除殘余的聚集體，并將上清液直接用于噬菌體展示篩選。實施例2:可溶性鐵調(diào)素-25肽的獲得合成的未修飾的鐵調(diào)素-25(人 DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT，SEQ ID NO:28,2789.4g/mol ；小 DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT, SEQ ID NO:29,2754.2g/mol ；大鼠DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT, SEQ ID NO: 30，2711.9g/mol)和 C 端生物素化大鼠鐵調(diào)素-25 (DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT (SEQ ID NO: 30)-Min1-PEG-連接物-K-生物素，3210.5g/mol)購自 PeptaNova GmbH (Sandhausen, GE)。人和小鼠C端生物素化鐵調(diào)素-25購自Bachem AGCBubendorf, CH) 類似于大鼠鐵調(diào)素-25，這些靶標(biāo)經(jīng)由賴氨酸殘基生物素化，該賴氨酸殘基經(jīng)由Minn1-PEG連接物耦合至C端。實施例3:具有100億個獨立NGAL突變蛋白的文庫的產(chǎn)生
具有聞度復(fù)雜性的NGAL脂質(zhì)運載蛋白(Lcn2)的隨機文庫基本上如上述實施例1所描述制備。圖1示出擴增反應(yīng)，噬菌粒載體phNGAL102為SEQ ID N0:26。實施例4:噬菌粒展示以及對人鐵調(diào)素具有親和力的NGAL突變蛋白的篩選基本上如國際專利申請W0/2005/019256中描述的使用實施例1中獲得的噬菌粒進行噬菌粒展示和篩選。針對可溶的C端生物素化的人鐵調(diào)素-25靶標(biāo)肽，所述文庫經(jīng)過三輪曬菌體展示篩選。使用實施例1中獲得的2xl012至IxlO13個噬菌粒的文庫。簡而言之，將噬菌粒進行離心(21460xg, 4°C，20min)并重懸浮于 Iml 含有 50mM 苯甲脒的 PBS (4mM KH2PO4, 16mM`Na2BPO4, 115mM NaCI, ρΗ7.4)中。含有 l%w/v 酪蛋白(Sigma)和 0.1% 吐溫20&的 PBS 用作封閉緩沖液。在與靶標(biāo)蛋白一起孵育前，來自文庫的噬菌粒與酪蛋白封閉的鏈霉親和素珠子一起孵育30分鐘，以耗竭呈遞多反應(yīng)性或錯誤折疊的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白或鏈霉親和素珠子特異性突變蛋白的噬菌粒。在不同的淘選方法中，在與噬菌粒(溶液含固體的方法)孵育前，將I μ M靶標(biāo)溶液捕獲到Str印tavidin -涂覆的1%酪蛋白封閉的磁性珠子上或?qū)?00nM鐵調(diào)素-25與來自NGAL文庫的用1%酪蛋白封閉的3.IO12噬菌粒在溶液中孵育(溶液方法)。在溶液方法中，結(jié)合肽的曬菌粒在20min內(nèi)被Streptavidin -涂覆的磁性珠子捕獲,接下來洗漆8次，用300 μ L70mM三乙胺(Triethylamin)洗脫10分鐘，并用適量的ρΗ7.4的IM Tris/HCl(堿性洗脫液)中和或用300 μ L ρΗ2.2的0.1M甘氨酸/HCl洗脫10分鐘并用適量的0.5ΜTris-Base (酸性洗脫液)中和。在溶液含固體的方法中，將封閉的噬菌粒與鏈霉親和素珠子涂覆的靶標(biāo)一起孵育，接下來洗滌8次，并且如上文描述洗脫。從第二個富集循環(huán)開始，只有一半的結(jié)合的噬菌粒溶液用于噬菌粒擴增。在每一個淘選循環(huán)之間如Schlehuber, S.等人(J.Mol.Biol.(2000), 297, 1105-1120)中描述的進行噬菌粒擴增。以這種方式進行針對鐵調(diào)素-25的另兩個篩選輪，其中使用來自各自前一富集循環(huán)的擴增的噬菌粒制備物，除了在第二個富集循環(huán)開始時使用僅約IXlO11個噬菌粒。實施例5:使用高通暈ELISA篩選鑒定人鐵調(diào)素特異的突變蛋白基本上按照國際專利申請W02006/56464中實施例3描述的進行根據(jù)實施例4的選定的突變蛋白的篩選。在HT-篩選ELISA中篩選脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。其中，使用具有phNGALlOl的大腸桿菌菌株TG1/F_在96孔微量滴定板中可溶表達裝配有T7檢測標(biāo)簽(Novagen)以及Strep-tag II親和標(biāo)簽(IBA)的NGAL變體。這種載體對應(yīng)于具有N端T7標(biāo)簽的phNGAL98(SEQ ID N0:31)，該 N 端 T7 標(biāo)簽由 11 個氨基酸(MASMTGGQQMG) (SEQ ID N0:34，仍見圖4B)組成。脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白表達在22° C、700rpm下用無水四環(huán)素(0，2μ g/ml)以O(shè)D55tl為0.6誘導(dǎo)過夜。隨后，細胞在攪拌下裂解(IOOmM硼酸鈉，pH8.0，80mM NaCl, ImMEDTA, 0.025%w/v溶菌酶)lh。為了使隨后的ELISA篩選中的非特異性結(jié)合最小化，給粗細胞裂解物補充2%w/vBSA和0.1%ν/ν吐溫20，并且在ELISA中檢測與人鐵調(diào)素_25的結(jié)合。因此,經(jīng)由用中性親和素(5 μ g/ml, Thermo Scientific)捕獲，將可溶的C端生物素化的人鐵調(diào)素_25以I μ g/ml固定在黑色Fluotrac600ELISA板(Greiner ；384孔)的孔上。每個5 μ g/ml的中性親和素、鏈霉親和素以及3%的牛奶用作陰性對照。板用含有2%w/v BSA的PBST/0.1封閉，隨后與細菌細胞提取物在室溫下孵育lh，板被洗滌5次并且結(jié)合的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白經(jīng)由抗17的單克隆抗體HRP綴合物(Novagen)進行測定,該綴合物在PBST/0.1 中以 1:10.000 稀釋。因此，QuantaBlu (Pierce ;1:2 稀釋在 PBS/T0.1% 中)被用作熒光HRP底物。在室溫下信號發(fā)展45分鐘后，在波長320nm ( ± 12.5nm)下激發(fā)熒光，在430nm ( 土 17.5nm)下在GENiosPlus讀板器中測量熒光。在反向ELISA方法中，來自粗細胞裂解物的可溶性表達的突變蛋白在與不同量的C端生物素化的人鐵調(diào)素孵育后經(jīng)由它們的T7標(biāo)簽被捕獲在ELISA板中，以達到靶標(biāo)限制性條件，以便通過它們的親和力來區(qū)分突變蛋白。經(jīng)由Extravidin-HRP綴合物(Sigma)測定對靶標(biāo)的結(jié)合。通過加入IOOnM非生物素化的人鐵調(diào)素-25而能夠競爭突變蛋白結(jié)合，表明所述突變蛋白也能結(jié)合未修飾的人鐵調(diào)素-25。對如實施例4中描述選定的2160個克隆進行篩選，鑒定了超過1000個的主要成功例(primary hit),這表明成功分離了祀標(biāo)特異性突變蛋白。在祀標(biāo)限制性條件下的反向ELISA方法以及競爭ELISA允許以其靶標(biāo)親和力區(qū)分鐵調(diào)素特異的突變蛋白。使用這些 ELISA 方法，鑒定了具有 SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO: 12的克隆。這些突變蛋白的序列描述于圖3中。實施例6:鐵調(diào)素結(jié)合突變蛋白(NGAL)的產(chǎn)生所述重組Lcn2和人鐵調(diào)素特異的Lcn2變體通過周質(zhì)分泌在大腸桿菌K12菌株JM83 (Yanisch-Perron 等人(I985)Gene33, 103_11)、大腸桿菌 supE 菌株 TGl-F-(大腸桿菌K12TG1的衍生物[Kim等人(2009) J.Am.Chem.Soc.131, 3565-3576]其使用吖啶橙自它的附加體處理得到)、大腸桿菌 BL21(Studier 和 Moffat (1986) J.Mol.Biol.189，113-130)、或大腸桿菌 W3110 (Bachmann (1990)Microbiol.Rev.54，130-197)中產(chǎn)生。對于小規(guī)模的可溶性蛋白表達，使用質(zhì)粒phNGAL98 (SEQ ID N0:31)，其編碼OmpA信號肽與各自的突變蛋白以及C端Strep-tag II的融合蛋白，由此質(zhì)粒攜帶所突變基因盒的單向亞克隆的兩個不相容的BstXI限制性位點。根據(jù)描述于Schlehuber，S.等人(J.Mol.Biol.(2000)，297，1105-1120)中的操作程序，在LB氨芐青霉素培養(yǎng)基存在下，在2L搖瓶培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。對于更大量的蛋白表達，基于Schiweck，W.和Skerra, A.Proteins (1995) 23, 561-565中描述的操作程序，在I升或10升容器中經(jīng)由臺式發(fā)酵器培養(yǎng)，用相同質(zhì)粒在大腸桿菌菌株W3110中進行周質(zhì)生產(chǎn)。為了增加體內(nèi)半衰期，選定的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白通過以下過程示例性地被修飾。構(gòu)建ABD融合蛋白并周質(zhì)表達SEQ ID NO:1的突變蛋白。來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域經(jīng)由源自鏈球菌蛋白G的原始連接物融合至所述突變蛋白的C端，如SEQID NO: 15中所述。在定點聚乙二醇化的情況下，將在氨基酸位置87處具有自由的半胱氨酸殘基的hNGAL突變蛋白(SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14)用于與分支的40k PEG-馬來酰亞胺進行聚乙二醇化。為實現(xiàn)這個目的，位置87處的絲氨酸通過定點誘變(Quick-change誘變試劑盒,Stratagene)被突變回 半胱氨酸,該半胱氨酸最初存在于野生型hNGAL中。在聚乙二醇化反應(yīng)之前，在室溫下，以摩爾比為1:1的Anticalin與TCEP還原所述自由的半胱氨酸殘基3h。其后，通過用大于2摩爾的過量的PEG40-馬來酰亞胺試劑與所述蛋白混合，在室溫下進行聚乙二醇化1.5h。經(jīng)由鏈霉親和素親和色譜法(Strep-Tactin Superf low , IBA),采用適當(dāng)床體積的柱子，根據(jù) Skerra, A.&Schmidt, T.G.M.(2000) (Use of the Strep-tag andstreptavidin for detection and purification of recombinant proteins.MethodsEnzymo1.326A, 271-304)描述的操作程序，從周質(zhì)級份中純化Lcn2變體。為了達到更高的純度并移除任何聚集的重組蛋白，最后在Superdex75HR10/30柱子(24-ml柱體積，Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)上,在 PBS 緩沖液存在下，進行突變蛋白的凝膠過濾。匯集所述單體蛋白級分并通過SDS-PAGE(Fling and Gregerson (1986)Anal.Biochem.155, 83-88)進行純度分析,并且用于進一步的生化表征。通過色譜法純化hNGAL突變蛋白的聚乙二醇化形式，并在必要時,通過MustangE膜(Pall Corporation, US)過濾實現(xiàn)細菌內(nèi)霉素的進一步減少。實施例7:使用ELISA技術(shù)測暈親和力進行“直接”ELISA以驗證選定的Lcn2突變蛋白的結(jié)合親和力和特異性。因此，將I μ g/ml恒定濃度的C端生物素化的鐵調(diào)素(Bachem AG, CH)通過中性親和素(ThermoScientific, 5 μ g/ml)捕獲于聚苯乙烯板(Greiner, GE)的表面上。純化的Lcn2突變蛋白的兩步稀釋系列與捕獲的鐵調(diào)素在室溫下孵育lh，然后經(jīng)由Strep-tag II使用兔抗strep-tag II多克隆抗體(GenScript, USA)或通過使用骨架特異性多克隆兔抗體進行測定。在這兩種情況下，抗兔IgG-HRP綴 合物(Abeam, UK)用作第二檢測抗體。在ELISA讀取器(Tecan，GE)中測定320nm處的Λ A吸收，并且數(shù)據(jù)用GraphpadPrism 軟件(Statcom, USA)擬合。使用SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO: 12 以及連接至 PEG40 的 SEQ ID NO: 14、連接至PEG40的SEQ ID NO: 13和連接至白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)的SEQ ID NO: KSEQ ID NO: 15)的序列的突變蛋白的測定結(jié)果概括于圖5中。選定的Lcn2突變蛋白的Kd值從220pM至6.8nM變化。所有的突變蛋白以可比較的親和力結(jié)合人和獼猴的鐵調(diào)素-25。經(jīng)由白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C端融合的SEQ ID N0:1的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其血清半衰期的延長對該突變蛋白的結(jié)合親和力沒有顯著影響，然而在此ELISA實驗中，聚乙二醇化顯著降低了結(jié)合親和力，其中對于SEQ ID N0:8，降低了5倍，對于SEQ ID NO:1的突變蛋白，降低了 8倍。在競爭ELISA方法中測定Lcn2突變蛋白對溶液中未修飾的鐵調(diào)素_25的結(jié)合親和力。因此,將I μ g/ml恒定濃度的C端生物素化的人鐵調(diào)素(Bachem AG, CH)經(jīng)由中性親和素(Thermo Scientific, 5 μ g/ml, GE)捕獲于聚苯乙烯板(Greiner, GE)的表面上。并行地，在無蛋白結(jié)合96孔聚丙烯板(Nunc, GE)中，在室溫下，將I μ M起始的非生物素化的人鐵調(diào)素的兩步稀釋系列與恒定濃度的鐵調(diào)素特異性突變蛋白孵育lh。所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的恒定濃度對應(yīng)于本實施例中如上描述的直接ELISA中測定的各突變蛋白的EC500以下，將未修飾的人鐵調(diào)素和脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的混合物轉(zhuǎn)移至捕獲有鐵調(diào)素的中性親和素板上。使C端生物素化鐵調(diào)素與未修飾的鐵調(diào)素在室溫下競爭Anticali結(jié)合20min。在這20min期間，游離的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白被結(jié)合至捕獲的鐵調(diào)素并且經(jīng)由兔抗strep-tag II多克隆抗體(GenScript, USA)進行測定。山羊抗兔IgG-HRP綴合物(Abcam，UK)用作第二檢測抗體。平行于競爭實驗，在“直接”ELISA中在相同的板上測定anticalin結(jié)合，以獲得將RFU值與anticalin濃度相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將該曲線用于將競爭數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化到結(jié)合至板上的anticalin的水平,然后用Graphpad軟件擬合。IC5tl值對應(yīng)于被結(jié)合至板上的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的半最大量。使用SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO: 12 以及連接至 PEG40 的 SEQ ID NO: 14、連接至PEG40的SEQ ID NO: 13和連接至ABD的SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO: 15)的序列的突變蛋白的測定結(jié)果概括于圖6中。選定的Lcn2突變蛋白的IC5tl值從IOOpM至10.8nM變化。經(jīng)由白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的血清半衰期的延長對SEQ ID NO:1突變蛋白的結(jié)合親和力沒有影響，然而聚乙二醇化降低了結(jié)合親和力，其中對于SEQ ID N0:13-PEG40降低了 2倍，對于SEQ ID N0:14_PEG40降低了 4倍。
_9] 實施例8:使用表面等離子體共振(SPR)測暈親和力表面等離子體共振用于測量本文公開的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的結(jié)合動力學(xué)和親和力。使用標(biāo)準(zhǔn)胺化學(xué)將脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白固定至CM5傳感器芯片:使用EDC和NHS激活芯片的表面。隨后，以5 μ L/min的流量施加在10mMpH4.5乙酸鈉中的20 μ g/mL的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白(對于聚乙二醇化脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，施加在IOmM pH4的乙酸鈉中的60μ g/mL)，直到實現(xiàn)對于未修飾脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的500-700諧振單元(RU)的表面密度和對于序 列為SEQ ID NO: 13的聚乙二醇化脂質(zhì)運載蛋白的約1600RU的表面密度。用乙醇胺飽和殘基活化基團。隨后用EDC/NHS、然后用乙醇胺處理參考通道(空白固定化)。所有試劑和材料購自GE Healthcare。將人和獼猴鐵調(diào)素-25在流動緩沖液(HBS-EP+，GE Healthcare, BR-1006-68)中的系列稀釋液施加于制備的表面。下面的參數(shù)用于結(jié)合測定:接觸時間60s、解離時間180-360s、流量30μ L/min。所有的測量都是在25 °C下在Biacore TlOO儀器(GEHealthcare)上進行。其上固定有脂質(zhì)運載蛋白的表面的再生通過以下方式獲得:隨后注射2M/4M鹽酸胍(120-600s)以及IOmM鹽酸甘氨酸pHl.5/2.0 (40_240s)，接下來用流動的緩沖液額外沖洗以及120s的穩(wěn)定時間段。數(shù)據(jù)用Biacore TlOO評估軟件(V2.0.1)進行評估。使用雙重參考。1:1的結(jié)合模型(Langmuir)用于擬合原始數(shù)據(jù)。重復(fù)實驗可再現(xiàn)，并且沒有檢測到對參考通道的結(jié)合。具有SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO:8以及連接至PEG40的SEQ ID NO: 13的序列的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白對人和獼猴鐵調(diào)素-25的結(jié)合參數(shù)概括于圖7中。獼猴鐵調(diào)素-25以約高于人靶標(biāo)2倍的親和力結(jié)合至固定的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白。在具有SEQ ID NO: 13序列的固定化的聚乙二醇化變體上的人鐵調(diào)素_25的動力學(xué)分析顯示出40pM的高親和力。實施例9:鐵調(diào)素誘導(dǎo)的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解的基于細胞的測定體外基于細胞的測定用于測量本發(fā)明的針對人鐵調(diào)素的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的中和活性。這個測定基于鐵調(diào)素誘導(dǎo)的其受體膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的內(nèi)化和降解，基本上如(Nemeth等人，2004, 2006)描述地實施。簡單地說，制備HEK-293穩(wěn)定細胞系以允許羧基端融合有綠色熒光蛋白(GFP)的鼠膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(FPN)的誘導(dǎo)表達。FPN-GFP融合蛋白的誘導(dǎo)表達受多西環(huán)素控制，其中使用市場上可以買到的四環(huán)素調(diào)節(jié)的T-Rex表達系統(tǒng)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)。將FPN-GFP編碼序列克隆到pcDNA4/T0載體中，其包含誘導(dǎo)型啟動子和Zeocin抗性標(biāo)記物。將得到的構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到T-REx-293細胞中，其表達多西環(huán)素誘導(dǎo)表達所需要的調(diào)節(jié)蛋白。鐵調(diào)素受體的鐵調(diào)素誘導(dǎo)的內(nèi)化的測定如下進行:將所述T-REx-293:FPN-GFP穩(wěn)定系細胞以80%匯合度接種在T75細胞培養(yǎng)瓶中。在晚上，用4ng/ml多西環(huán)素誘導(dǎo)FPN-GFP的表達，并用IOyM檸檬酸鐵銨(III)在37°C下穩(wěn)定16h。在第二天早晨，細胞被胰蛋白酶消化并以30萬個細胞/孔、體積450 μ I接種于24孔板中。使細胞在37°C下附著lh，然后添加鐵調(diào)素。將細胞在37°C下孵育24h，然后用流式細胞術(shù)分析分離的細胞懸液的GFP熒光。將EC80 (40nM)鐵調(diào)素介導(dǎo)的Fpn-GFP融合蛋白降解用于中和測定中。為了這個目的，在加入細胞前，將Anticalin與鐵調(diào)素在室溫下孵育30min。24h孵育時間段之后，如上所述量化熒光。具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 以及連接至 PEG40 的 SEQ ID NO: 14 和連接至 PEG40的SEQ ID NO: 13和連接至ABD的SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO: 15)的序列的抗鐵調(diào)素脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白中和人鐵調(diào)素-25的生物活性，其IC50值在圖8中示出。實施例10:抗鐵調(diào)素月旨質(zhì)運載蛋白突變蛋白中和小鼠體內(nèi)的人鐵調(diào)素抗人鐵調(diào)素脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的活性在小鼠體內(nèi)進行評估，所述小鼠被施用了足以產(chǎn)生如(Nemeth 等人(2006)Blood, 107:328-333)描述的缺鐵反應(yīng)(hypoferremicresponse)的量的人鐵調(diào)素。實驗前兩周，將C57BL/6小鼠轉(zhuǎn)換為缺鐵的飲食以抑制內(nèi)源性鐵調(diào)素。在實驗前，使3倍摩爾過量的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白與合成的人鐵調(diào)素-25結(jié)合30min。平行地，將野生型脂質(zhì)運載蛋白(NGAL98)與人鐵調(diào)素-25以相同摩爾比預(yù)孵育，作為同型對照。小鼠獲得單次腹膜內(nèi)(1.P.)注射PBS (溶媒)或2mg/kg鐵調(diào)素或2mg/kg與脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白或野生型脂質(zhì)運載蛋白(陰性對照)預(yù)孵育的鐵調(diào)素。兩個小時后，在異氟醚麻醉下收集血液，在KoneLab XTi臨床分析儀上使用比色法測定總血清鐵水平。以μ M濃度計的總血清鐵水平的結(jié)果描述于圖9中。鐵調(diào)素治療誘導(dǎo)鐵饑餓小鼠體內(nèi)的血清鐵水平顯著下降。用野生型脂質(zhì)運載蛋白預(yù)孵育的鐵調(diào)素也顯示血鐵過少。人鐵調(diào)素與脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的預(yù)先復(fù)合保護動物免于缺鐵反應(yīng)。實施例11:抗鐵調(diào)素-25脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的藥代動力學(xué)(PK)參數(shù)的測定在以圖10所示劑量在NMRI小鼠和獼猴(Macacca fascicularis)中經(jīng)靜脈內(nèi)單次團注給藥之后，測定Lcn2突變蛋白的藥代動力學(xué)(PK)參數(shù)(半衰期血藥濃度)，所述Lcn2突變蛋白具有連接至PEG40的SEQ ID NO: 14和連接至ABD的SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO: 15)的序列。由在預(yù)先確定的時間點獲取的終端血樣制備血漿，并用ELISA測定脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白的濃度。用自然對數(shù)轉(zhuǎn)換的血藥濃度-時間曲線的終端部分的最小二乘線性回歸計算消除速率常數(shù)。每一個單獨曲線的最終消除階段的開始處通過目測定義，其為血清濃度對數(shù)線性下降沒有系統(tǒng)偏差的第一點。T1/2按以下公式計算:ln(2)
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其能夠以Kd為約IOnM或更低的親和力結(jié)合鐵調(diào)素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其具有Kd為約InM或更低的親和力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其具有Kd為約0.1nM或更低的親和力。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其能夠中和人鐵調(diào)素-25的生物活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其IC50值為約SOnM或更低，如通過用于鐵調(diào)素誘導(dǎo)的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白內(nèi)化和降解的基于細胞的測定所測得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其IC50值為約50nM或更低。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其IC50值為約25nM或更低。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其包含選自SEQIDNO: 1-14的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含在NGAL線性多肽序列的序列位置96、100和/或106處的2個或3個突變的氨基酸殘基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的突變蛋白，其中在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的序列位置106的序列位置處的突變的氨基酸殘基為替換Tyrl06 — lie、Gly、Phe、Val或Arg。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項所述的突變蛋白，其中在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的序列位置96的序列位置處的突變的氨基酸殘基為替換Asn96 — Arg、Asp、Gln、Gly、Lys、Ser > Thr 或 Val。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項所述的突變蛋白，其中在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的序列位置100的序列位置處的突變的氨基酸殘基為替換TyrlOO — Ala、Arg、Glu、Gln、Gly、Ser 和 Val。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸替換集合中的一個:(a)Asn96— Val、TyrlOO — Gln ；(b)Asn96— Arg、TyrlOO — Glu、Tyr106 — Phe ；(c)Asn96— Asp、TyrlOO — Ser>Tyrl06 — Gly ；(d)Asn96 — Gly、TyrlOO — Gly、Tyrl06 — Gly ；(e)Asn96 — Lys> TyrlOO — Ala、Tyrl06 — He ；(f)Asn96 — Ser> TyrlOO — Arg、Tyrl06 — Val ；(g)Asn96 — Ser、TyrlOO — Val、Tyr 106 — Arg ;和(h)Asn96 — Thr> TyrlOO — Val、Tyrl06 — Gly。
14.根據(jù)權(quán)利要求8至13中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白結(jié)合成熟人鐵調(diào)素。
15.根據(jù)權(quán)利要求8至14中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白與NGAL的序列具有至少75%的同一性。
16.根據(jù)權(quán)利要求8至15中任一項所述的突變蛋白，其還包含在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的序列位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、103、125、127、132 和 134 的序列位置任意處的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個突變的氨基酸殘基。
17.根據(jù)權(quán)利要求8至16中任一項所述的突變蛋白，其包含在NGAL線性多肽序列的序列位置 36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 的任意處的至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個突變的氨基酸殘基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的突變蛋白，其包含在NGAL線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132 和 134 的任意一個處的18、19或20個突變的氨基酸殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求8至18中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的序列位置52、68、81、127和134的序列位置的任意一個或多個處包含突變的氣基酸殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求8至19中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含在NGAL線性多肽序列中的替換Lysl34 — Trp0
21.根據(jù)權(quán)利要求8至20中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白包含在NGAL線性多妝序列中的替換 Tyr52 — Hi S、Leu、Phe 或 Trp ；Ser68 — Arg、Gly 和 lie ；Arg81 — Glu、Gly和Gln ;和Serl27 — Thr或Trp中的一個或多個。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸替換集合中的一個:(a)Tyr52 — His、Ser68 — Arg、Arg81 — Ser 和 Serl27 — Trp ；(b)Tyr52 — Leu、Ser68 — Arg、Arg81 — Glu 和 Serl27 — Trp ；(c)Tyr52 — Phe、Ser68 — Gly、Arg81 — Gly 和 Serl27 — Trp ；(d)Tyr52 — Trp> Ser68 — lie、Arg81 — Gln 和 Serl27 — Trp ；(e)Tyr52 — Trp> Ser68 — Arg、Arg81 — Glu 和 Serl27 — Trp ；(f)Tyr52 — Trp> Ser68 — Arg、Arg81 — Glu 和 Serl27 — Thr ;和(g)Tyr52 — Trp> Ser68 — Arg、Arg81 — Glu 和 Serl27 — Trp0
23.根據(jù)權(quán)利要求8至22中任一項所述的突變蛋白，其還在對應(yīng)于NGAL線性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、103、125和132的序列位置的任意處包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個突變的氨基酸殘基。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的突變蛋白，其中相對于成熟NGAL野生型氨基酸序列，所述突變蛋白包含選自以下的一個或多個氨基酸替換:Leu36 — Ala、Cys, Thr, Val ；Ala40 — Arg、Glu、Gly 和 Ser ；Ile41 — lie、Leu、Met 或 Val ；Gln49 — Leu 或 Met ；Leu70 — Asp、Asn、Gln、Met 或 Phe ；Arg72 — Glu、Gly、Leu 或 Val ；Lys73 — Ala、Arg、Glu、Gly、Leu、Thr 或 Tyr ；Asp77 — Arg、Glu、Gly、Leu、Ser 或 Val ；Trp79 — Gly、Leu、Ser>Tyr 或 Val ；Leul03 — Ala、Arg、Gly 或 Trp ；Lysl25 — Arg、Leu、Met、Phe、Thr 或 Val ;和Tyrl32 — Leu 或 Val。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸組合集合中的一個:(a)Ala36、Ser40 ；Leu41 ；Met49 ；Asn70 ；Gly72 ；Gly73 ；Ser77 ；Leu79 ；Leul25 ；Vall32 ；(b)Leu36、Arg40；Val41 ；Gln49 ；Asp70 ；Arg72 ；Thr73 ；Leu77 ；Ser79 ；Thrl25 ；Vall32 ；(c)Leu36、Glu40；Ile41 ；Leu49 ；Gln70 ；Gly72 ；Glu73 ；Gly77 ；Gly79 ；Phel25 ；Vall32 ；(d)Leu36、Glu40；Ile41 ；Met49 ；Met70 ；Leu72 ；Ala73 ；Glu77 ；Leu79 ；Vall25 ；Vall32 ；(e)Leu36、Glu40；Val41 ；Met49 ；Met70 ；Leu72 ；Ala73 ；Glu77 ；Leu79 ；Thrl25 ；Vall32 ；(f)Leu36、Glu40；Val41 ；Met49 ；Met70 ；Leu72 ；Ala73 ；Glu77 ；Leu79 ；Vall25 ；Vall32 ；(g)Thr36、Ser40；Ile41 ；Gln49 ；Phe70 ；Glu72 ；Gly73 ；Arg77 ；Val79 ；Vall25 ；Leul32 ； (h)Val36、Glu40 ；Met41 ；Leu49 ；Met70 ；Glu72 ；Tyr73 ；Val77 ；Leu79 ；Argl25 ；Vall32 ；和(i)Val36、Gly40；Leu41 ；Leu49；Leu70 ；Val72 ；Arg73 ；Arg77 ；Tyr79 ；Metl25;Vall32。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的突變蛋白，其包含以下突變中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個:Leu36 — Thr、Leu36 — VaU Leu36 — Ala、Ala40 — Serλ Ala40 — Gly、Ala40 — Glu、Ala40 — Arg、Ile41 — Val ；Ile41 — Leu、Ile41 — Met、Gln49 — Leu、Gln49 — Met ；Tyr52 — His、Tyr52 — Leu、Tyr52 — Phe、Tyr52 — Trp、Ser68 — Arg、Ser68 — Gly、Ser68 — lie、Leu70 — Phe、Leu70 — Asn、Leu70 — Gin、Leu70 — Met、Leu70 — Asp、Arg72 — Glu、Arg72 — VaK Arg72 — Gly、Arg72 一 Leu72、Lys73 一 Gly、Lys73 一 Arg、Lys73 一 Ala、Lys73 一 Thr、Lys73 一 Tyr、Lys73 一 Glu、Asp77 一 Arg、Asp77 一 VaK Asp77 一 Ser、Asp77 一 Glu、Asp77 一 Gly、Asp77 一 Leu、Trp79 一 VaK Trp79 一 Tyr、Trp79 一 Ser、Trp79 一 Gly、Trp79 一 Leu79 ；Arg81 — Glu、Arg81 — Ser、Arg81 — Gly、Arg81 — Gin、Asn96 — Lys、Asn96 — Arg、Asn96 — Thrλ Asn96 — Ser、Asn96 — Asp96、Asn96 — Val、TyrlOO — Ala、TyrlOO — Glu、TyrlOO — VaK TyrlOO — Arg、TyrlOO — SerlOO、TyrlOO — Gin、Leul03 — Gly、Leul03 — Arg、Leul03 — Ala、Leul03 — Gly、Leul03 — Arg、Leul03 — Trp、Tyrl06 — lie、Tyrl06 — Phe、Tyrl06 — Val、Tyrl06 — Gly、Tyrl06 — Arg、Lysl25 — Val、Lysl25 — Met、Lysl25 一 Arg、Lysl25 一 Leu、Lysl25 一 Thr、Lysl25 一 Phe、Serl27 一 Trp、Serl27 一 Thr、Tyrl32 — Leu、Tyrl32 — VaK Lysl34 — Trp。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26中任一項所述的突變蛋白，其包含以下突變中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 個:Ala40 — Glu、Ile41 — Val ；Gln49 — Met ；Tyr52 — Trp、Ser68 — lie、Leu70 — Met、Arg72 — Leu72、Lys73 — Ala、Asp77 — Glu、Trp79 — Leu79 ；Arg81 — Gln、Asn96 — Asp96、Asn96 — Gly、TyrlOO — SerlOO、TyrlOO — Gly、Leul03 — Arg、Tyrl06 — Gly、Lysl25 — Thr、Lysl25 — Val、Serl27 — Trp、Tyrl32 — VaK Lysl34 — Trp。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的突變蛋白，其包含以下氨基酸組合集合中的一個:(a)Leu36、Glu40、Val41 ；Met49 ;Trp52、Ile68、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79 ；Gln81、Asp96、SerlOO、Argl03、Glyl06、Thrl25、Trpl27、Vall32、Trpl34；(b)Leu36、Glu40、Val41、Met49、Trp52、Ile68、Met70;Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Gln81、Gly96、GlylOO、Argl03、Glyl06、Vall25、Trpl27、Vall32、Trp134 ；(c)Leu36、Glu40、Val41、Met49、Trp52、Ile68、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79；Gln81、Asp96、Serl00、Argl03、Glyl06、Vall25、Trpl27、Vall32、Trpl34；(d)Leu36、Glu40、Ile41、Met49、Trp52、Ile68、Met70、Leu72、Ala73、Glu77；Leu79 ；Gln81、Asp96、SerlOO、Argl03、Glyl06、Vall25、Trp127, Vall32、Trp134 ；(e)Leu36、Glu40、Ile41、Met49、Trp52、Ile68、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Gln81、Asp96、Serl00、Argl03、Glyl06、Vall25、Trpl27、Vall32、Trpl34；(f)Leu36、Glu40、Val41、Met49、Trp52、Ile68、Met70、Leu72、Ala73、Glu77、Leu79、Gln81、Asp96、SerlOO、Argl03、Glyl06、Vall25、Trp127, Vall32、Trp134
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的突變蛋白，其還包含以下突變中的至少1、2、3或4個:Lys59 — Glu、Lys62 — Arg、Phe71 — Pro、Phe71 — Ser> Lys74 — Glu、Lys75 — Glu、Ile80 — Phe、Ilel35 — Val.Ser 146 — Pro、Glul47 — Gly。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的突變蛋白，其包含至少16個氨基酸突變。
31.根據(jù)權(quán)利要求8至30中任一項所述的突變蛋白，其中相對于成熟NGAL野生型氨基酸序列，所述突變蛋白還包含選自以下的一個或多個氨基酸替換:Gln28 —His、Lys62 — Arg、Phe71 — Pro 或 Ser、Lys74 — Glu、Lys75 — Glu、Cys87 — Ser、Ilel35 — Val、Serl46 — Pro 和 Glul47 — Gly。
32.根據(jù)權(quán)利要求8至31中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白具有如SEQIDNo: 1-14中任意一個所述的氨基酸序列或其片段或變體。
33.根據(jù)權(quán)利要求8至32中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白與成熟人鐵調(diào)素的親和力用Kd定義，所述Kd為IOnM或更少。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白與成熟人鐵調(diào)素的親和力用Kd定義，所述Kd為InM或更少。
35.根據(jù)權(quán)利要求8至34中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白綴合至選自以下的化合物:有機分子、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記、有色標(biāo)記、熒光標(biāo)記、顯色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、半抗原、地高辛、生物素、細胞抑制劑、毒素、金屬絡(luò)合物、金屬和膠體金。
36.根據(jù)權(quán)利要求8至35中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在其N端和/或其C端融合至融合配偶體，所述融合配偶體為蛋白、或蛋白結(jié)構(gòu)域或肽。
37.根據(jù)權(quán)利要求8至36中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白綴合至延長所述突變蛋白的血清半衰期的化合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的突變蛋白，其中所述延長血清半衰期的化合物選自:聚亞烷基二醇分子、羥乙基淀粉、免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白結(jié)合肽和白蛋白結(jié)合蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的突變蛋白，其中所述聚亞烷基二醇是聚乙二醇(PEG)或其活化衍生物。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白的融合配偶體是延長所述突變蛋白的血清半衰期的蛋白結(jié)構(gòu)域。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的突變蛋白，其中所述蛋白結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白的Fe部分、免疫球蛋白的CH3結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的CH4結(jié)構(gòu)域、白蛋白結(jié)合肽、或白蛋白結(jié)合蛋白。
42.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用作鐵調(diào)素的拮抗劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用作在膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白處的成熟人鐵調(diào)素的拮抗劑。
44.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用于治療或診斷。
45.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用于治療或診斷疾病或障礙，所述疾病或障礙涉及鐵動態(tài)平衡的障礙或與提高水平的鐵調(diào)素相關(guān)的炎性病癥。
46.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用于增加受試者的體液、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白或血細胞比容中的鐵水平。
47.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用于治療或診斷貧血、炎癥性貧血、慢性炎性貧血、缺鐵性貧血、鐵加載貧血、敗血癥、遺傳性血色沉著病、慢性腎臟疾病(CKD)相關(guān)貧血、 癌癥性貧血(AC)、化療所致貧血(CIA)、抗ESA (紅細胞生成刺激劑)相關(guān)貧血、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白疾病、血色沉著癥、后階段腎功能障礙、慢性腎臟疾病、炎癥、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈硬化、血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和血紅蛋白病。
48.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白，其用于監(jiān)測EPO治療或預(yù)測對EPO的響應(yīng)。
49.一種核酸分子，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述突變蛋白的核苷酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作性地連接至調(diào)節(jié)序列以允許所述核酸分子的表達。
51.根據(jù)權(quán)利要求49或50所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含于載體或噬菌粒載體中。
52.—種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求49至51中任一項所述的核酸分子。
53.—種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述突變蛋白的方法，其中所述突變蛋白、所述突變蛋白的片段或所述突變蛋白和另一多肽的融合蛋白通過基因工程方法的方式從編碼所述突變蛋白的核酸開始而產(chǎn)生。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述突變蛋白在細菌或真核宿主生物體中產(chǎn)生，并從該宿主生物體或其培養(yǎng)物中分離。
55.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的藥物組合物，其還包含紅細胞生成刺激物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的藥物組合物，其中所述紅細胞生成刺激物是促紅細胞生成素、促紅細胞生成素變體、結(jié)合促紅細胞生成素的抗體和結(jié)合促紅細胞生成素的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白中的一種。
58.根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白用于鐵調(diào)素的結(jié)合/檢測的用途，所述用途包括: (a)使所述突變蛋白與疑似含有鐵調(diào)素的試驗樣品接觸，從而允許形成在所述突變蛋白與所述鐵調(diào)素之間的復(fù)合物，和(b)通過合適的信號檢測在所述突變蛋白與所述鐵調(diào)素之間的復(fù)合物。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的用途，其中所述鐵調(diào)素為成熟人鐵調(diào)素。
60.一種診斷或分析試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白。
61.一種檢測生物樣品中鐵調(diào)素的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求8至41中任一項所述的突變蛋白在允許形成所述突變蛋白和所述鐵調(diào)素的復(fù)合物的條件下接觸。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其還包括檢測所述鐵調(diào)素和所述突變蛋白的復(fù)合物。
63.根據(jù)權(quán) 利要求61或62所述的方法，其中所述鐵調(diào)素為成熟人鐵調(diào)素。
64.根據(jù)權(quán)利要求61至63中任一項所述的方法，其中所述生物樣品從人分離。
65.根據(jù)權(quán)利要求61至63中任一項所述的方法，其中所述樣品包括體液。
66.一種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其具有圓柱形β折疊片超二級結(jié)構(gòu)區(qū)，所述結(jié)構(gòu)區(qū)包含通過在一端的4個環(huán)逐對連接的八個β鏈，從而由此限定結(jié)合口袋，其中所述四個環(huán)中至少三個中每一個的至少一個氨基酸已被突變，并且其中所述脂質(zhì)運載蛋白以可檢測的親和力有效地結(jié)合作為給定非天然靶標(biāo)的鐵調(diào)素。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其中所述限定結(jié)合口袋的四個環(huán)對應(yīng)于包含歐洲粉蝶的膽汁三烯結(jié)合蛋白線性多肽序列的氨基酸28 - 45,58 - 69,86 - 99和115 - 129的那些區(qū)段。
68.根據(jù)權(quán)利要求66或67所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其中所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白選自以下蛋白的突變蛋白:視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、膽汁三烯結(jié)合蛋白(ΒΒΡ)、載脂蛋白D (APO D)、嗜中性粒細胞明月父酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL/脂質(zhì)運載蛋白2)、淚脂質(zhì)運載蛋白(TLPC)、α 2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)、24p3/uterocalin (24p3)、von Ebners 腺蛋白 I (VEGPl)、von Ebners 腺蛋白 2 (VEGP2)和主要變應(yīng)原 Can Π 前體(ALL-1)。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其中所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白選自人嗜中性粒細胞明股酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(hNGAL/脂質(zhì)運載蛋白2)、人淚脂質(zhì)運載蛋白(hTLPC)、人載脂蛋白D (APO D)和歐洲粉蝶的膽汁三烯結(jié)合蛋白。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其中所述脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白在NGAL線性多肽序列的序列位置24-36、53-66、79-84和103-110的任意序列位置處包含至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個突變的氨基酸殘基。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在NGAL線性多肽序列的18個序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和 108 的任意處包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個突變的氨基酸殘基。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在NGAL線性多肽序列的序列位置 25、26、27、28、29、30、31、32、33、56、57、58、83、105、106、108 和 109 的任意處包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 或 17 個突變的氨基酸殘基。
73.根據(jù)權(quán)利要求68至70中任一項所述的突變蛋白，其中所述突變蛋白在NGAL線性多肽序列的序列位置 8、9、10、11、12、13、43、45、47、70、72、74、75、90、92、94 和 97 的任意處包含至少12-16個氨基酸突變。
74.根據(jù)權(quán)利要求66所述的突變蛋白，其中所述四個肽環(huán)區(qū)中的突變的氨基酸代表膽汁三烯結(jié)合蛋白(SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫登錄號P09464)線性多肽序列的序列位置34 - 37、.58、60、69、88、90、93、95、97、114、116、125 和 127，載脂蛋白 D (SffISS-PROT 數(shù)據(jù)庫登錄號P05090)線性多肽序列的序列位置 34 - 37、59、61、70、87、89、92、94、96、113、115、123 和.125或人視黃醇結(jié)合蛋白(SWISS-PR0T數(shù)據(jù)庫登錄號P02753)線性多肽序列的序列位置.32 - 35、57、59、73、90、92、95、100、102、119、121、131 和 133。
75.一種減少鐵調(diào)素水平的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用包含根據(jù)權(quán)利要求I至48和66至74中任一項所述突變蛋白的藥物組合物。
76.一種脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其阻止人鐵調(diào)素-25誘導(dǎo)的受試者的血清鐵水平降低。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其中所述受試者是哺乳動物。
78.根據(jù)權(quán)利要 求77所述的脂質(zhì)運載蛋白突變蛋白，其中所述受試者是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對鐵調(diào)素的新的、特異性結(jié)合的治療和/或診斷蛋白，所述蛋白優(yōu)選地是脂質(zhì)運載蛋白的突變蛋白。本發(fā)明還涉及編碼這樣的蛋白的核酸分子和生成方法以及這樣的蛋白和核酸分子的用途。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及包含這樣的脂質(zhì)運載蛋白的藥物和/或診斷組合物，包括這些蛋白的用途。
文檔編號C07K14/435GK103154023SQ201180049831
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者S·特倫特曼, G·馬欽內(nèi)爾, A·斯克拉, A·霍爾鮑姆, M·胡爾斯邁爾, H·吉勒, H-J·克里斯蒂安, K·延森, R·S·貝萊巴 申請人:皮里斯股份公司