專利名稱：β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法。
背景技術：
花粉發(fā)育是一個十分復雜的過程。在這個過程中，涉及近萬種花藥特異基因的協(xié)同表達。Stinson等從重組cDNA文庫中第一次分離出植物的花藥、花粉特異性基因以來，迄今所發(fā)現(xiàn)并得到鑒定的花粉發(fā)育特異基因也不過幾十種。這些花粉特異基因在植物發(fā)育過程中的表達受時間和空間調節(jié)。微管是細胞骨架的主要結構元件，參與細胞分裂，細胞內運輸和細胞形態(tài)發(fā)生，在細胞壁合成中起著重要的作用，引導纖維素微纖絲的沉積，并且參與花粉管的生長與發(fā)育。α微管蛋白(TUA)和β微管蛋白(TUB)被認為在植物細胞壁合成中引導纖維素的微纖絲的 沉積。已發(fā)現(xiàn)許多微管蛋白基因只在花粉中特異表達，擬南芥TUAs中ArathTUAl在花粉中特異表達，而其他的僅在營養(yǎng)組織中表達；TUBs中，Arath-TUBl和5在根和葉中優(yōu)先表達，而ArathTUB9則只在花粉中積累。水稻種也有花粉特異的亞型。在TUB基因第39位氨基酸殘基插入一個或三個氨基酸殘基可能與花粉發(fā)育有關。Oakley等發(fā)現(xiàn)，在胡楊中，TUB19和TUB20可能參與花粉發(fā)育，對于花粉管的生長和發(fā)育也是必不可少的。本因此，推測微管蛋白可能參與了不育的發(fā)生。馬小定在以花粉為材料利用cDNA-AFLP分析核雄性不育系可育與不育花藥差異表達基因時，找出了 17個差異表達的基因，其相應的基因可能參與了信號轉導，轉錄，能量代謝，和植物細胞壁的發(fā)展過程。其中包括一個β微管蛋白的同源基因其編號為EG036041 J^Sblast比對，得到與其片段同源性最高的是beta-tubulin-8基因。本研究以β微管蛋白-8基因為研究對象,通過分析其在可育株與不育株DNA序列的差異性，研究其對蛋白表達的影響，進而分析該基因對植株育性的調控。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的。一種β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，步驟包括:對棉花雄性花藥的總DNA的提取，設計引物對靶序列進行PCR擴增，目的片段的回收；上述引物與靶序列間的Tm值在63.6飛5.4°C，上述引物無發(fā)夾結構，上述引物內部鏈無二級結構。進一步地，上述對棉花雄性花藥的總DNA的提取使用CTAB法。進一步地，上述引物與非擴增區(qū)域無同源性，上下游引物間無同源序列。進一步地，上述引物長度為24或25bp。進一步地，上述引物為上游403bp和下游1047bp處長度分別為24bp和25bp的一對引物。進一步地，上述引物為:上游引物:5’GGCTTCCAGGTATGCCATTCACTTG3’ ；下游引物:5’ GGGAATCCACTCCACGAAGTATGA3，。
本發(fā)明的有益效果:提出了棉花核雄性不育系花藥中高質量的總DNA提取方法以及β微管蛋白-8基因片段引物的設計，首次在棉花核雄性不育系中克隆了 β微管蛋白-8基因片段，首次通過比較一個不育相關基因的片段在不育株與可育株中的DNA序列差異，從而進一步探討其與不育性狀的關系。
具體實施例方式下面根據(jù)實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。1.材料的選取。取棉花核雄性不育系mS5mS6不育與可育株的花蕾，根據(jù)花蕾大小，取不育株和可育株各時期的花蕾(取樣時間為上午6: 00-6: 30)，結合花藥涂片法、三酸法鏡檢，將花藥整個發(fā)育時期劃分為6個時期:幼花藥發(fā)育期(現(xiàn)蕾1-5天，直徑l_3mm)，花粉母細胞發(fā)育期(現(xiàn)蕾6-7天，直徑3-4_)，花粉母細胞減數(shù)分裂期(現(xiàn)蕾8-9天，直徑4-5_)，花粉粒發(fā)育期(現(xiàn)蕾10-11天，直徑5-6mm)，纖維層發(fā)育期(現(xiàn)蕾12-15天，直徑6_7mm)和成熟花粉期(現(xiàn)蕾16-20天，直徑7-8mm)。取100個單株的花藥，包括50株可育株和50株不育株，保存于-70°C冰箱備用?！?br> ·
2.總DNA的提取用CTAB 法提取 DNA。(I)取適量棉花核雄性不育系和可育系的花藥,加入適量的PVP,加液氮充分研磨至粉末狀，轉移至2ml離心管中，加入20-30 μ I β -巰基乙醇和Iml 65°C預熱的提取緩沖液，輕輕混勻，65°C溫浴30m·in ；(2)于4°C 12 000 rpm離心lOmin，將上清液轉移至另一新的2ml離心管中；(3)加入等體積酚(pH 8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)，輕輕混勻，于4°C 12 000rpm離心lOmin，將上清液轉移至另一新的2ml離心管中；(4)加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，于4°C 12 000 rpm離心lOmin，將上清
液轉移至另一新的2ml離心管中(重復此步驟，直至界面干凈)；(5)加入1/10體積的NaAc，2倍體積的無水乙醇，混勻，靜止半小時，使絮狀DNA充分析出，于4°C 12 000 rpm離心IOmin,棄去上清；(6)用75%乙醇洗沉淀2次，沉淀于室溫風干，加入50yL TE充分溶解后，于-20°C保存?zhèn)溆谩?.β微管蛋白-8基因特異性引物的設計利用DNAMAN軟件,根據(jù)GenBank上已登錄的棉花中beta-tubulin_8 ( β微管蛋白-8)基因全長cDNA序列,利用Primer Premier5.0軟件設計一對簡并引物，采用手動設計的方法，設定引物長度為24或25bp，分別尋找上游和下游引物，并將其進行組合，選取了綜合評價分數(shù)值較高高的且擴增片段長度較為適合的一對引物組合如圖。尋找到引物按以下原則:引物與靶序列間的Tm值不應過低，不要有發(fā)夾結構、引物內部鏈避免二級結構，弓丨物不應與非擴增區(qū)域有同源性，上下游引物間不應有同源序列。最后取的引物組合為上游403bp和下游1047bp處長度分別為24bp和25bp的一對引物。委托上海生物工程有限公司合成。
上游引物:5’GGCTTCCAGGTATGCCATTCACTTG3，下游引物:5’GGGAATCCACTCCACGAAGTATGA3，4.beta-tubul in-8 基因 DNA 片段的 PCR 擴增(I) PCR反應體系在PCR管中依次加入:ddH20 17.5μ 1，DNA模板I μ 1，上游引物(10 μ mol/L)1μ 1，下游引物(10μ θ1/υ μ l，Taq 酶(5U) 0.5 μ l,dNTP (10 mmol/L) 2 μ 1,10XPCRBuffer 2.5 μ I ο(2) PCR反應條件PCR 反應條件為:94°C預熱 3min，94°C變性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 2min，30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物于4°C保存。上述實施例只為說明本發(fā)明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發(fā)明內容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質所作的等效變化或 修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內。
權利要求
1.一種β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，其特征在于，步驟包括:對棉花雄性花藥的總DNA的提取，設計引物對靶序列進行PCR擴增，目的片段的回收；所述引物與靶序列間的Tm值在63.6飛5.4°C，所述引物無發(fā)夾結構，所述引物內部鏈無二級結構。
2.根據(jù)權利要求1所述的β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，其特征在于，所述對棉花雄性花藥的總DNA的提取使用CTAB法。
3.根據(jù)權利要求1所述的β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，其特征在于，所述引物與非擴增區(qū)域無同源性，上下游引物間無同源序列。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，其特征在于，所述引物長度為24或25bp。
5.根據(jù)權利要求4所述的β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，其特征在于，所述引物為上游403bp和下游1047bp處長度分別為25bp和24bp的一對引物。
6.根據(jù)權利要求5所述的β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，其特征在于，所述引物為:上游引物:5 ’ GGCTTCCAGGTATGCCATTCACTTG3 ’ ；下游引物:5 ’ GGGAATCCACTCCACGAAGTATGA3 ’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β微管蛋白-8基因片段的構建獲得方法，步驟包括對棉花雄性花藥的總DNA的提取，設計引物對靶序列進行PCR擴增，目的片段的回收；上述引物與靶序列間的Tm值在63.6~65.4℃，上述引物無發(fā)夾結構，上述引物內部鏈無二級結構。本發(fā)明的優(yōu)點在于，提出了棉花核雄性不育系花藥中高質量的總DNA提取方法以及β微管蛋白-8基因片段引物的設計，首次在棉花核雄性不育系中克隆了β微管蛋白-8基因片段，首次通過比較一個不育相關基因的片段在不育株與可育株中的DNA序列差異，從而進一步探討其與不育性狀的關系。
文檔編號C12N15/29GK103114097SQ20121052539
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權日2012年12月7日
發(fā)明者林毅, 王艷玲, 蔡永萍, 姜家生, 郭寧 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學